JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

בלוטת interrenal דג הזברה היא עמיתו teleostean של בלוטת יותרת הכליה היונקת. פרוטוקול זה מציג כיצד לבצע את dehydrogenase 3-β-hydroxysteroid (איזומראז Δ 5-4; 3β-HSD) assay הפעילות האנזימטית, אשר מזהה תאים steroidogenic הבדיל של דג הזברה פיתוח.

Abstract

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-β-Hydroxysteroid dehydrogenase /Δ5-4 isomerase (3β-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3β-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3β-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

Introduction

בלוטת יותרת הכליה, מרכיב חיוני של ציר hypothalamo-היפופיזה-אדרנל, מפריש סטרואידים ומתאם הומאוסטזיס סטרואידים ואת התגובה הגופנית ללחץ. בלוטת יותרת הכליה כולל הקורטקס החיצוני, אשר מפריש סטרואידים באופן אזור ספציפי, ומדולה פנימית, אשר מסנתז קטכולאמינים. בלוטת interrenal ב teleosts היא העמית של בלוטת יותרת הכליה ביונקים והוא מורכב של תאי interrenal ו chromaffin steroidogenic, שהן ושווי תפקודי של קליפת יותרת הכליה ומדולה, בהתאמה 1-3. מחקרים שנערכו תוך יישום מודל דג הזברה דיווחו כי הן שושלות תאים steroidogenic ו chromaffin נוצרות על ידי מנגנונים מולקולריים ותאיים מאוד דומים לאלה ביונקים 1,2. לכן, דג הזברה הוא מודל רב עצמה פוטנציאלית ללימוד הפרעות גנטיות, בקרת נוירואנדוקריניים, וביולוגית מערכות של hypothalamo-היפופיזה-אדרנל הציר (interrenal).

s = "jove_content"> בבלוטת יותרת הכליה, 3β-HSD מזרז את ההמרה של פרוגסטרון מ פרגננולון, 17α-hydroxyprogesterone מ 17α-hydroxypregnelolone, ו אנדרוסטנדיון מ dehydroepiandrosterone 4,5. 3β-HSD חיונית biosynthesizing כל המעמדות של סטרואידים הורמונלית, כלומר פרוגסטרון, גלוקוקורטיקואידים, מינרלוקורטיקואידים, אנדרוגנים, אסטרוגנים. שני-HSD 3β האדם isozymes HSD3B1 ו HSD3B2 מבוטא 6 דיפרנציאלי. HSD3B1 מתבטא השליה ורקמות פריפריה, כאשר HSD3B2 מתבטא בקליפת והאשכים הכליה. האדם HSD3B1 ו HSD3B2 הוא-orthologs שיתוף של hsd3b1 דג הזברה, אשר באו לידי ביטוי על רקמות interrenal ואשכים מבוגרים; hsd3b2 דג הזברה הוא גן אימהי הביע שאת התמלילים להיעלם לפני organogenesis 7. הפרוטוקול של assay הפעילות האנזימטית כל הר 3β-HSD עבור דג זברה פותח על ידי שינוי השיטה של ​​לוי,שעות שתואר על ידי Milano et al. , על חלקים קפואים של שמונה בעלי חוליות 8. בגלל חדירות רקמות שקיפות אופטית של דג הזברה פיתוח, כל הר 3β-HSD היסטוכימיה יכול לשמש בהצלחה העובר הזחלים דג הזברה קבוע ובאופן ספציפי להתוות הרקמות interrenal מובחן.

assay הרגיש ומהיר זו יושם כדי מוטנטים morphants שבאו להפגין סוגים שונים של dysmorphogenesis interrenal. פעילות interrenal 3β-HSD תיאור בעובר שבו מפרט של רקמת interrenal מופר באמצעות מציאה ספציפית של גורם שעתוק Ff1b והוא ירד כמו הבידול interrenal מושפע מציאה של coregulator Ff1b Prox1 9,10. יש לציין, כי פעילות 3β-HSD ניתן לאתר מוטציות עם מומים בשלב מוקדם חמורים, כגון ראש סיכת שתום עין לפזול, שבו 3β-Hsd היסטוכימיה מתווה כיצד נדידת תאי interrenal מושפעת 11. הבידול של רקמת interrenal לא נפגע גם בהיעדר המוחלט של דם בכלי דם. לכן, איך אותות שמקורם האנדותל לעצב את איבר interrenal בפיתוח ניתן לקבוע 12,13. בסך הכל, assay histochemical זה שימש בהצלחה ללימוד מפרט, בידול, והגירה של תאים steroidogenic במודל דג הזברה. לכן, זה צריך להיות יעיל כלי אמין עבור כל מסך גנטי או כימי מיקוד הפרעות איבר האדרנל interrenal.

Protocol

משפט ואתיקה: כל הפרוצדורות על דג הזברה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השימוש Tunghai אוניברסיטת (אישור IRB NO 101-12.) ובוצע בהתאם להנחיות שאושרו.

1. פתרונות המניות עבור 3β-HSD אנזימתי פעילות מכתים

  1. הכן-dehydroandrosterone טרנס [10 מ"ג / מ"ל ​​ב sulfoxide דימתיל (DMSO)].
  2. הכן מימה dinucleotide אדנין β-nicotinamide (1.2 מ"ג / מ"ל ​​במאגר M 0.1 פוספט, pH 7.2).
  3. הכן nicotinamide (ויטמין B3, 50 מ"ג / מ"ל ב H 2 O).
  4. הכן tetrazolium כחול 4-ניטרו (50 מ"ג / מ"ל ​​ב dimethylformamide 70%).
  5. Aliquot כל המרכיבים האלה לתוך צינורות microfuge ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
    הערה: מניסיוננו, חזרה הקפאה להפשרה של aliquots של כל הפתרונים הנ"ל אינו משפיע על עוצמת 3β-HSD פעילות מכתימה.

2. Wחור-הר 3β-HSD פעילות מכתים

הערה: 3β-HSD הפעילות האנזימטית ניתן לזהות עוברי דג הזברה מוקדם ככל 28 שעות שלאחר ההפריה (hpf) כאשר בתרבית על 28.5 מעלות צלזיוס, אשר עולה בקנה אחד עם תחילת ביטוי mRNA של hsd3b1 2,7. פרוטוקול מכתים פעילות כל הר 3β-HSD במחקר זה מבוסס על שיטה שתואר לעיל 8 והיה נחוש להצליח דג הזברה פיתוח עד 7 ימים לאחר ההפריה 9. לניתוח במיקרו-סביבה של כלי הדם של הרקמה steroidogenic interrenal, כל הר מכתים פעילות 3β-HSD יש להחיל קווי מהונדס המבטא הקרינה ספציפי האנדותל, כגון Tg (kdrl: EGFP) s843 14 ו Tg (kdrl: mCherry) ci5 15 . כדי לנתח את רקמת steroidogenic interrenal שוקלת את המשך הפיתוח כליות דג הזברה, 3β-HSD פעילות מכתים יכול להיות appliעורך אל Tg (wt1b: GFP) Li1 דגים 16, שבו היווצרות של tubules glomerulus ו pronephric מותווה.

  1. פנקו את דג הזברה פיתוח על ידי דוגרים להם 0.03% phenylthiourea במים ביצה (מלח 0.06 מ"ג / L שונית במים deionized), החל משלב בין 12 ל 24 hpf, לעכב היווצרות פיגמנט.
  2. תקן עוברים dechorionated או זחלים ב (א) 4% paraformaldehyde (PFA) ב פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) בתוספת 0.1% Tween 20 (PFAT) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר (RT) או (ב) 2% PFAT לילה בשעה 4 ° C או עבור שעה 2 ב 4 ° C, ואחריו 4 שעות ב RT.
    זהירות: PFA הוא רעיל על ידי שאיפה ידי מגע עם העור. זה הרסני לעור, ריריות, עיניים, ודרכי הנשימה העליונות.
  3. שטפו את 4x עוברים במשך 10 דקות עם PBS בתוספת 0.1% Tween 20 (PBST) ב RT.
    הערה: זה קריטי כדי לא לייבש את הדגימות תוך שינוי פתרונות הכביסה.
  4. טרי להכין את staפתרון ining לפני התגובות (טבלה 1). כן, מערבולת, וחלקי צנטריפוגות A ו- B ב צינורות נפרדים.
    הערה: הוספת כל המרכיבים ישר לתוך צינור אחד תגרום משקעים קשים.
  5. מוסיף את הפתרון השלם של חלק לפתרון השלם של חלק ב ', ומערבב היטב כדי להכין את הפתרון המכתים, ומייד להפיץ 1 מיליליטר לתוך צינור אחד microfuge המכיל עוברים קבועים ורחצה.
  6. גלישת צינורות microfuge עם רדיד אלומיניום על מנת להגן עליהם מפני האור והמקום משני הכתף או פלטפורמת נדנדה עבור רעד עדין ב RT.
  7. באופן אמפירי לקבוע את זמן התגובה על ידי ניטור אותות chromogenic באמצעות מיקרוסקופיה. משקעים קלים יפתחו לאורך זמן; עם זאת, הם לא יפריעו לתהליך התגובה.
    הערה: לקבלת עוברים קבועים ב 28 hpf, מכתים ב 25 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות מייצרת איתות ברורה על רקמות interrenal.
  8. עצור את התגובה על ידי שטיפת 4x במשך 10 דקות ב PBST. אניf לא immunohistochemical נוסף (IHC) ניתוח נדרש, שלאחר לתקן את העוברים מוכתם 4% PFAT במשך 60 דקות ב RT. אחרת, לאחסן את העוברים לכבס ב 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
  9. עבור מיקרוסקופיה כל ההר, נקה את המוכתם, שלאחר קבוע, ורחץ עובר עם גליצרול 50% ב- PBS, כוון אותם עם הצד הגבה פונה כלפי מעלה בשקופית, ולבחון באמצעות מיקרוסקופ זקוף תחת תאורה בשדה בהירה.
    הערה: כדי ליצור תמונה ברזולוציה גבוהה של מורפולוגיה רקמות interrenal, שטוח הר ניתוח 3β-HSD פעילות מוכתמת עובר deyolked מומלץ. כמו רקמת steroidogenic interrenal ממוצבת ממש מעל שק החלמון, ניתוח שטוח הר הגחון של הרקמה interrenal מאפשר תצפית ישירה וברורה של מורפולוגיה interrenal 17.

3. ניתוח IHC של עוברי פעילות מוכתמת 3β-HSD

הערה: לקבלת ניתוח המיקרו-סביבה של כלי הדם של steroiרקמת dogenic, העוברים מוכתם פעילות 3β-HSD עם כתב ניאון האנדותל ספציפי מהונדס חשופים רוחביים חתך vibratome וניתוח IHC עוקב 12,18.

  1. פוסט קיבעון
    1. פוסט לתקן את 3β-HSD פעילות מוכתם ורחץ עוברים עם 2% PFA בתוספת 1% Triton X-100 עבור שעה 1 ב 4 ° C ולשטוף 4x במשך 10 דקות ב PBS המכיל 1% Triton X-100 (PBSTx) ב RT.
  2. Embedding
    1. הכן 4% נמוך ההיתוך agarose על ידי המסת agarose ב PBS על 95 מעלות צלזיוס, aliquot לתוך צינורות microfuge, ולאחסן ב 4-8 מעלות.
    2. ממיסים aliquot של 4%-התכה נמוכה agarose ב 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן לשמור את aliquot ב -47 ° C. הטמע את כל העובר ב מותכת 4% נמוך ההיתוך agarose בכובע פרטי או צינור 1.5 מ"ל microfuge אשר משמש עובש, להתקרר עד מוצק.
  3. חתך vibratome
    1. היצמד חתיכת סרט נייר p היבשlatform של vibratome.
    2. הסר את הבלוק agarose קשה מרוב עובש על ידי סכין גילוח. החל דבק מגע לקלטת נייר על הרציף, ולתקן לחסום agarose על גבי קלטת נייר, עם הצד הקדמי של המדגם פונה כלפי מעלה. חתוך את הבלוק agarose לצורה פריזמה טרפז, עם כ 4 מ"מ ו 8 מ"מ בכל צד של היבטים העליונים והתחתונים, בהתאמה.
    3. שוטפים את הבלוק agarose המכילים מדגם עם קר PBS השלימו עם 0.5% Triton X-100 (0.5% PBSTx) באמצעות טפטפת.
    4. פורסים את גוש agarose לתוך 100 מיקרומטר חלקים לפי במדריך ההוראות של vibratome. כל הזמן לשטוף את הבלוק agarose כדי למנוע התייבשות. כמו כל פרוסה חותכת, להסיר אותו vibratome באמצעות מחט מזרק 26 G, ולהעביר לצלחת מקום המכילה קר 0.5% PBSTx (500 μl / טוב).
    5. אסוף את הפעילות החיובית HSD-3β סעיפי רקמה ידי סימון תחת מיקרוסקופ לנתיחה, ולהעביר את הסעיפים ידי pipette טיפ עם חתך סופו (כ 1 מ"מ קוטר פנימי בפתיחה) לתוך צלחת 96-היטב המכילה קר 0.5% PBSTx (150 μl / טוב). דגימות הרקמה בדרך כלל לנתק מגוש agarose לאחר שלב זה.
  4. Permeabilization ו כביסה
    1. לשטוף את פרוסות 6x במשך 15 דקות ב 0.5% PBSTx ב RT, 10 דקות ב PBS, 4x במשך 10 דקות ב PBS השלימו עם DMSO אלבומין 1% שור / 1% / 0.1% Triton X-100 (PBDTx).
  5. חסימה
    1. דגירה הפרוסה עבור נסיוב עגל 1 hr ב 2% עובריים (FCS) ב PBDTx ב RT.
  6. תגובה ראשית נוגדן
    1. דגירה הפרוסה עבור 1.5 ימי PBDTx המכילים נוגדן ראשוני (למשל, פיברונקטין אנטי אנושי polyclonal הארנב קינאז הדבקה מוקדים אנטי אנושי עכבר) ב 4 ° C..
  7. כְּבָסִים
    1. לשטוף את פרוסות 6x במשך 10 דקות ב PBDTx ב RT.
  8. חסימה
    1. דגירה הפרוסה במשך שעה 1 ב 2% FCS ב PBDTX ב RT.
  9. תגובת נוגדנים משני
    1. דגירה פרוסות עבור 1.5 ימים PBDTx המכיל נוגדנים משני (ארנב נגד עז מצומדות fluorophore או IgG אנטי עכבר) בשעה 4 מעלות צלזיוס.
  10. כְּבָסִים
    1. לשטוף את פרוסות 6x במשך 10 דקות ב PBDTx ב RT ו 4x במשך 10 דקות ב PBST ב RT.
      הערה: לקבלת ניתוח מיקרוסקופי confocal, נקה את דגימות עם גליצרול 50% ב- PBS.

4. ניתוח Confocal

  1. שים לב העובר ההר השלם והסעיף ידי מיקרוסקופ confocal מצויד 10X / 0.5 ו 20X / 0.75 עדשה אובייקטיבית.
  2. עבור זיהוי סימולטני של הקרינה ואת מכתים 3β-HSD, להגדיר את מצב multitrack כדלקמן: לייזר ארגון 488 ננומטר 505-530 מסנן bandpass ננומטר לצורך זיהוי של GFP; 543 לייזר הליום-נאון ננומטר מסנן bandpass 560-615 ננומטר לצורך זיהוי של mCherry; ומשודר ערוץ אור לצורך זיהוי של מכתים 3β-HSD.גודל החריר הוא 1 יחידת איירי, וההחלטה היא 1,024 x 1,024 פיקסלים.
  3. הרכב את ערימות z (עם 6 מרווח מיקרומטר) כהשלכת 3D, ולמזג את ההקרנה ואת השדה הבהיר, באמצעות תוכנה המובנית confocal.

תוצאות

כדי לקבוע כיצד codevelops רקמות interrenal steroidogenic עם glomerulus כליות pronephric ואת כלי הדם המתהווה שלה, assay הפעילות האנזימטית 3β-HSD בוצע על כפול מהונדס Tg (wt1b: GFP) Li1; Tg (kdrl: mCherry) העובר ci5 ב 34 hpf (איור 1). בשלב זה, רקמת steroidogenic הפעילות חיובית 3β-HSD מ?...

Discussion

עוצמת האות של פעילות 3β-HSD וגובר במהלך ריאקציה. אותות ברורים של פעילות 3β-HSD אותרו לאחר 4 שעות של התגובה לשלבים מ -28 hpf ואילך. עם זאת, משך התגובה דורש נחישות אמפירית, בהתאם לצורך של assay. במקרים בהם מכתים דורש עיבוד לילה, רקע כחלחל מעט נוטה להתפתח על דגימות. ניתן להתגבר על בעי?...

Disclosures

The authors have no competing financial interests to declare.

Acknowledgements

אנו מודים פרופ 'כריסטוף אנגלר ופרופ דידייה Stainier עבור gifting את Tg (wt1b: GFP) Li1 ו Tg (kdrl: EGFP) s843 זנים, בהתאמה, ואת מתקן Core דג הזברה טייוואן למתן Tg (kdrl: mCherry) ci5. מחקר זה נתמך על ידי מענקי משרד של טייוואן המדע והטכנולוגיה (96-2628-B-029-002-MY3, 101-2313-B-029-001, 102-2628-B-029-002-MY3, 102- 2321-B-400-018).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Confocal microscopeCarl Zeiss LSM510 
DMSOSigmaD8418 
GlycerolUSBUS16374
Hyclone Fetal Calf Serum GE Healthcare Life SciencesSH30073
NicotinamideSigmaN0636
β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrateSigmaN1636
4-Nitro blue tetrazoliumPromegaS380C
Nusieve GTGLonza50081
ParaformaldehydeSigmaP6148
PhenylthioureaSigma P7629
Phosphate buffered salineSigmaP4417-100Tab
PYREX Spot PlateCorning7220-85
Reef SaltAZOOAZ28001
trans-DehydroandrosteroneSigmaD4000
Triton X-100SigmaT8787
Tween 20SigmaP9416
VibratomeLeicaVT1000M

References

  1. Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b. Development. 130, 2107-2116 (2003).
  2. To, T. T., et al. Pituitary-interrenal interaction in zebrafish interrenal organ development. Mol Endocrinol. 21, 472-485 (2007).
  3. Liu, Y. W. Interrenal organogenesis in the zebrafish model. Organogenesis. 3, 44-48 (2007).
  4. Cravioto, M. D., et al. A new inherited variant of the 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase-isomerase deficiency syndrome: evidence for the existence of two isoenzymes. J Clin Endocrinol Metab. 63, 360-367 (1986).
  5. Lachance, Y., et al. Characterization of human 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta 5-delta 4-isomerase gene and its expression in mammalian cells. J Biol Chem. 267, 3551 (1992).
  6. Simard, J., et al. Molecular biology of the 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta5-delta4 isomerase gene family. Endocr Rev. 26, 525-582 (2005).
  7. Lin, J. C., et al. Two zebrafish hsd3b genes are distinct in function, expression, and evolution. Endocrinology. 156, 2854-2862 (2015).
  8. Grassi Milano, E., Basari, F., Chimenti, C. Adrenocortical and adrenomedullary homologs in eight species of adult and developing teleosts: morphology, histology, and immunohistochemistry. Gen Comp Endocrinol. 108, 483-496 (1997).
  9. Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ. Dev Biol. 260, 226-244 (2003).
  10. Liu, Y. W., Gao, W., Teh, H. L., Tan, J. H., Chan, W. K. Prox1 is a novel coregulator of Ff1b and is involved in the embryonic development of the zebra fish interrenal primordium. Mol Cell Biol. 23, 7243-7255 (2003).
  11. Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ. Dev. Biol. 260, 226-244 (2003).
  12. Chou, C. W., Zhuo, Y. L., Jiang, Z. Y., Liu, Y. W. The hemodynamically-regulated vascular microenvironment promotes migration of the steroidogenic tissue during its interaction with chromaffin cells in the zebrafish embryo. PLoS One. 9, e107997 (2014).
  13. Liu, Y. W., Guo, L. Endothelium is required for the promotion of interrenal morphogenetic movement during early zebrafish development. Dev Biol. 297, 44-58 (2006).
  14. Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
  15. Proulx, K., Lu, A., Sumanas, S. Cranial vasculature in zebrafish forms by angioblast cluster-derived angiogenesis. Dev Biol. 348, 34-46 (2010).
  16. Perner, B., Englert, C., Bollig, F. The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros. Dev Biol. 309, 87-96 (2007).
  17. Chou, C. W., Chiu, C. H., Liu, Y. W. Fibronectin mediates correct positioning of the interrenal organ in zebrafish. Dev Dyn. 242, 432-443 (2013).
  18. Chiu, C. H., Chou, C. W., Takada, S., Liu, Y. W. Development and fibronectin signaling requirements of the zebrafish interrenal vessel. PLoS One. 7, e43040 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

1183 hydroxysteroidsteroidogenicAdreno Corticointerrenalvibratome

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved