Visualizando o Tissue interrenais Steroidogenic e sua Vascular Microenvironment em Zebrafish

Resumo

A glândula interrenal no peixe-zebra é a contrapartida teleósteos da glândula supra-renal de mamífero. Este protocolo apresenta a forma de realizar a desidrogenase de 3-hidroxiesteróides β (Δ ^5-4 isomerase; 3β-HSD) ensaio da actividade enzimática, que detecta as células diferenciadas esteroidogênicas no peixe-zebra desenvolvimento.

Resumo

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-β-Hydroxysteroid dehydrogenase /Δ^5-4 isomerase (3β-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3β-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3β-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

Introdução

A glândula adrenal, um componente crucial do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, segrega esteróides e coordena a homeostase esteróides e na resposta do organismo ao estresse. A glândula adrenal compreende o córtex exterior, que segrega esteróides de um modo específico da zona, e medula interna, que sintetiza catecolaminas. A glândula interrenal em teleósteos é o homólogo da glândula supra-renal em mamíferos e é composto de células cromafins e interrenais esteroidogênicas, que são equivalentes funcionais do córtex adrenal e medula, respectivamente ^1-3. Estudos realizados utilizando o modelo de peixe-zebra têm relatado que ambas as linhagens celulares esteroidogênicas e cromafins são formados por mecanismos moleculares e celulares altamente semelhantes aos mamíferos em ^1,2. Por isso, o peixe-zebra é um modelo potencialmente poderosa para o estudo de doenças genéticas, controlo neuroendócrino, e sistemas de biologia do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (interrenal).

na glândula adrenal, 3β-HSD catalisa a conversão da progesterona a partir de pregnenolona, 17α-hidroxiprogesterona de 17α-hydroxypregnelolone, e androstenodiona a partir de desidroepiandrosterona ^4,5. 3β-HSD é essencial para biosynthesizing todas as classes de esteróides hormonais, nomeadamente progesterona, glucocorticóides, mineralocorticóides, androgénios, estrogénios e. Os dois humana 3β-HSD isozimas HSD3B1 e HSD3B2 são diferencialmente expressos ^6. HSD3B1 é expressa na placenta e nos tecidos periféricos, enquanto que HSD3B2 é expresso no córtex adrenal e das gónadas. HSD3B1 humano e HSD3B2 são co-ortólogos de hsd3b1 peixe-zebra, que é expressa no tecido interrenal e gónadas adultos; HSD3B2 peixe-zebra é um gene maternalmente expressa cuja transcrições desaparecer antes organogênese ^7. O protocolo do ensaio de actividade de toda a montagem 3β-HSD enzimática para peixe-zebra foi desenvolvido através da modificação do método Levy,s descritas por Milano et al. , Em cortes congelados de oito espécies de teleósteos ^8. Devido à permeabilidade dos tecidos e a transparência óptica do peixe-zebra desenvolvimento, todo-montagem 3β-HSD histoquímica pode ser usada com sucesso para o embrião do peixe-zebra fixa e larvas e especificamente delinear os tecidos interrenais diferenciadas.

Este ensaio sensível e rápida foi aplicado a vários mutantes e morphants demonstrando diferentes tipos de dysmorphogenesis interrenal. A actividade 3β-HSD interrenal está ausente no embrião quando as especificações do tecido interrenal é interrompida através de um knockdown específica do factor de transcrição Ff1b e diminui à medida que a diferenciação interrenal é afectada por um knockdown da coregulator Ff1b Prox1 ^9,10. Notavelmente, a actividade 3β-HSD pode ser detectada em mutantes com defeitos graves da fase inicial, tais como uma cabeça de alfinete e de olhos estrabismo, onde o 3β-HSD histoquímica delineia como a migração celular é afectada interrenal ^11. A diferenciação do tecido interrenal não é comprometida, mesmo na ausência total de sangue e vasculatura. Portanto, como os sinais derivados do endotélio moldar o órgão interrenal em desenvolvimento pode ser determinado ^12,13. Em geral, este ensaio histoquímico foi usado com êxito para estudar especificação, diferenciação e migração de células esteroidogénicas no modelo de peixe-zebra. Portanto, ele deve ser um eficiente e uma ferramenta confiável para as telas genéticos ou químicos visando as disfunções dos órgãos supra-renais e interrenais.

Protocolo

Declaração de Ética: Todos os procedimentos experimentais no peixe-zebra foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional animal da Universidade Tunghai (Aprovação IRB NO 101-12.) E realizado em conformidade com as orientações aprovadas.

1. As soluções de reserva para 3β-HSD Actividade Enzimática A coloração

1. Prepare trans-dehydroandrosterone [10 mg / ml em sulfóxido de dimetilo (DMSO)].
2. Prepare β-nicotinamida adenina dinucleótido hidrato (1,2 mg / ml em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,2).
3. Prepare a nicotinamida (vitamina B3, 50 mg / ml em _H2O).
4. Prepare de tetrazólio azul nitro-4 (50 mg / ml em 70% de dimetilformamida).
5. Alíquotas todos esses componentes em tubos de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C.
   NOTA: Em nossa experiência, ciclos repetidos de congelamento e descongelamento das alíquotas de todas as soluções acima mencionadas não afectam a intensidade da coloração de atividade 3β-HSD.

2. Whole-montagem 3β-HSD Atividade Coloração

NOTA: A actividade enzimática 3β-HSD é detectável nos embriões de peixe-zebra tão cedo quanto 28 horas após a fertilização (HPF) quando cultivadas a 28,5 ° C, o que é consistente com o aparecimento da expressão de ARNm de hsd3b1 ^2,7. O protocolo de toda a montagem de coloração de actividade 3β-HSD neste estudo baseia-se num método anteriormente descrito ⁸ e determinou-se ser bem sucedido no peixe-zebra desenvolver até 7 dias após a fertilização ^9. Para analisar o microambiente vascular do tecido esteroidogênica interrenal, conjunto de montagem 3β-HSD de coloração de actividade deve ser aplicado às linhas transgénicas expressando fluorescência específica do endotélio, tal como TG (kdrl: EGFP) ^{s843 14} e Tg (kdrl: mCherry) ^{CI5 15} . Para analisar o tecido esteroidogênica interrenal considerando o desenvolvimento do rim zebrafish, atividade 3β-HSD coloração pode ser apliEd à Tg (wt1b: GFP) ^LI1 peixe ^16, onde a formação do glomérulo e pronephric túbulos é delineado.

1. Tratar o peixe-zebra desenvolvimento, incubando-as em 0,03% em água feniltioureia ovo (sal de 0,06 mg / L de recife em água desionizada), a partir de uma fase de entre 12 e 24 hpf, para inibir a formação de pigmentos.
2. Fix embriões dechorionated ou larvas em (a) 4% de paraformaldeído (PFA) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) suplementado com 0,1% de Tween 20 (PFAT) durante 1 h à temperatura ambiente (TA) ou (B) 2% PFAT durante a noite a 4 ° C ou durante 2 horas a 4 ° C, seguido por 4 horas à temperatura ambiente.
   Cuidado: PFA é tóxico por inalação e em contacto com a pele. É destrutivo para a pele, membranas mucosas, olhos, e tracto respiratório superior.
3. Lava-se a embriões 4x durante 10 min com PBS suplementado com 0,1% de Tween 20 (PBST) a TA.
   NOTA: É crítico para não secar as amostras ao alterar as soluções de lavagem.
4. Recém preparar o staining solução antes das reacções (Tabela 1). Prepare, vortex, centrifugação e partes A e B, em tubos separados.
   NOTA: A adição de todos os componentes em linha reta em um único tubo iria causar precipitação grave.
5. Adicionar toda a solução da Parte A para toda a solução da Parte B, misturar bem para preparar a solução de coloração, e distribuir imediatamente 1 ml em cada tubo de microcentrífuga contendo embriões fixados e lavadas.
6. Enrole tubos de microcentrífuga com folha de alumínio para proteger da luz e o local de cada um rotor ou de uma plataforma de agitação para agitação suave à temperatura ambiente.
7. Empiricamente determinar o tempo de reação, monitorando sinais cromogénicos por meio de microscopia. precipitações leves irão desenvolver ao longo do tempo; No entanto, eles não irão interferir com o processo de reacção.
   NOTA: Para os embriões fixada em 28 hpf, a coloração, a 25 ° C durante 4 h gera um sinal claro no tecido interrenal.
8. Parar a reacção através de lavagem 4 x durante 10 minutos em PBST. EuF mais nenhuma análise imuno-histoquimica (IHC) é necessário, pós-corrigir os embriões corados com 4% PFAT durante 60 min à TA. Caso contrário, armazenar os embriões foram lavados a 4 ° C até uso posterior.
9. Para a microscopia todo-mount, limpar os embriões corados, pós-fixados, e lavado com 50% de glicerol em PBS, orientá-los com o lado dorsal para cima em um slide, e observar com um microscópio vertical sob iluminação de campo claro.
   NOTA: Para fazer uma imagem de alta resolução da morfologia do tecido interrenal, a análise do embrião 3β-HSD atividade-coradas e deyolked plana de montagem é recomendada. Como o tecido esteroidogênica interrenal está posicionado logo acima do saco vitelino, uma análise ventral plano de montagem do tecido interrenal permite uma observação direta e clara da morfologia interrenal ^17.

3. IHC Análise de 3β-HSD Embriões manchado de Atividade

NOTA: Para analisar o microambiente vascular do steroitecido dogenic, os embriões manchado de atividade 3β-HSD com um repórter fluorescente específica do endotélio transgênicos são submetidos a deslocamentos vibratome seccionamento e subsequente análise IHC ^12,18.

1. Pós-fixação
   1. Pós-corrigir os embriões 3β-HSD actividade coradas e lavou-se com 2% de PFA suplementado com 1% de Triton X-100 durante 1 hora a 4 ° C e lavar 4x durante 10 min em PBS contendo 1% de Triton X-100 (PBSTx) à TA.
2. Incorporação
   1. Prepare a 4% de agarose de baixo ponto de fusão dissolvendo o de agarose em PBS a 95 ° C, em tubos de microcentrífuga alíquota, e armazenar a 4-8 ° C.
   2. Derreter-se uma alíquota de 4% de agarose de baixo ponto de fusão a 70 ° C durante 10 min, e em seguida manter a aliquota a 47 ° C. Incorporar cada embrião no fundido de 4% de agarose de baixo ponto de fusão em um tampão individual de um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, que serve como um molde, e deixa-se arrefecer até solidificar.
3. vibratome Seccionamento
   1. Cole um pedaço de fita de papel para a p secolatform de vibratome.
   2. Remover o bloco de agarose endurecida do molde por uma lâmina de barbear. Aplicar supercola para a fita de papel na plataforma, e fixar o bloco de agarose na fita de papel, com o lado anterior da amostra virada para cima. Aparar o bloco de agarose a uma forma de prisma trapezoidal, com aproximadamente 4 mm e de 8 mm em cada lado das facetas superiores e inferiores, respectivamente.
   3. Lavar o bloco de agarose contendo amostra com PBS frio suplementado com 0,5% de Triton X-100 (0,5% PBSTx), utilizando um conta-gotas.
   4. Corte o bloco de agarose em 100 mm seções de acordo com o manual de instruções do vibratome. Constantemente lavar o bloco de agarose para evitar a secagem. À medida que cada fatia é cortada, removê-lo a partir da vibratome usando uma agulha G 26 da seringa, e transferir para uma placa de ponto frio contendo 0,5% PBSTx (500 ul / poço).
   5. Recolher as secções de tecido de atividade positivos 3p-HSD, verificando sob um microscópio de dissecação, e transferir as seções por um piponta pette com a sua extremidade de corte (cerca de 1 mm de diâmetro interior na abertura) numa placa de 96 poços contendo 0,5% frio PBSTx (150 ul / poço). As amostras de tecido geralmente dissociar-se do bloco de agarose após este passo.
4. Permeabilização e Lavagem
   1. Lavam-se as fatias 6x durante 15 min em 0,5% PBSTx à TA, 10 min em PBS, e 4x durante 10 minutos em PBS suplementado com 1% de albumina de soro de bovino / 1% de DMSO / 0,1% de Triton X-100 (PBDTx).
5. Bloqueio
   1. Incubam-se as fatias para o soro 1 h em 2% de vitelo fetal (FCS) em PBDTx à TA.
6. Anticorpo primário
   1. Incubam-se as fatias durante 1,5 dias em PBDTx contendo um anticorpo primário (por exemplo, policlonal de coelho anti-fibronectina humana e de ratinho anti-humano quinase de adesão focal), a 4 ° C.
7. Lavando
   1. Lavam-se as fatias 6x durante 10 min em PBDTx à TA.
8. Bloqueio
   1. Incubam-se as fatias durante 1 h em 2% de FCS em PBDTx à TA.
9. Anticorpo secundário
   1. Incubam-se as fatias para 1,5 dias em PBDTx contendo um anticorpo secundário (anticorpo de cabra anti-coelho conjugada com fluoróforo ou anti-IgG de ratinho) a 4 ° C.
10. Lavando
    1. Lavam-se as fatias 6x durante 10 min em PBDTx à TA e 4x durante 10 min em PBST à TA.
       NOTA: Para a análise microscópica confocal, limpar as amostras com 50% de glicerol em PBS.

4. Análise confocal

1. Observe todo o embrião montagem ea seção por um microscópio confocal equipado com 10X / 0.5 e 20X / 0,75 lente objetiva.
2. Para a detecção simultânea da fluorescência e da coloração 3β-HSD, definir o modo de multicanal como se segue: 488 nm do laser de árgon e 505-530 nm, filtro de banda para a detecção de GFP; 543 nm do laser de Hélio-Néon e 560-615 nm, filtro de banda para a detecção de mCherry; e transmitida canal de luz para a detecção de coloração 3β-HSD.O tamanho pinhole é uma unidade Airey, ea resolução é de 1024 x 1024 pixel.
3. Montar as pilhas Z (com 6 intervalo mm) como uma projeção em 3D, e fundir a projeção e o campo brilhante, usando o built-in software confocal.

Resultados

Para determinar como as esteroidogênicas codevelops tecido interrenais com o glomérulo renal pronephric e sua vasculatura nascente, o ensaio de actividade enzimática 3β-HSD foi realizada na dupla transgénico Tg (wt1b: GFP) ^li1; Tg (kdrl: mCherry) ^CI5 embrião em 34 HPF (Figura 1). Nesta fase, o tecido esteroidogênica actividade positiva 3β-HSD está localizado à direita da linha média e caudal imediatamente para o glomérulo renal ...

Discussão

A intensidade do sinal da actividade 3β-HSD aumentado ao longo do curso de reacção. Sinais claros de actividade 3β-HSD foram detectados após 4 horas de reacção para as fases de 28 HPF em diante. No entanto, a duração da reacção requer a determinação empírica, dependendo do objetivo do ensaio. Nos casos em que a coloração requer processamento durante a noite, um fundo ligeiramente azulado tende a desenvolver sobre as amostras. Este problema pode ser ultrapassado pelo aumento da duração de fixação ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal microscope	Carl Zeiss	LSM510
DMSO	Sigma	D8418
Glycerol	USB	US16374
Hyclone Fetal Calf Serum	GE Healthcare Life Sciences	SH30073
Nicotinamide	Sigma	N0636
β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate	Sigma	N1636
4-Nitro blue tetrazolium	Promega	S380C
Nusieve GTG	Lonza	50081
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Phenylthiourea	Sigma	P7629
Phosphate buffered saline	Sigma	P4417-100Tab
PYREX Spot Plate	Corning	7220-85
Reef Salt	AZOO	AZ28001
trans-Dehydroandrosterone	Sigma	D4000
Triton X-100	Sigma	T8787
Tween 20	Sigma	P9416
Vibratome	Leica	VT1000M