Interrenal Steroidogenic 조직 및 제브라 피쉬의 혈관 미세 시각화

요약

제브라 피쉬의 interrenal 선은 포유 동물의 부신의 teleostean 대응이다. 효소 활성 분석, 개발 제브라 피쉬에서 차별화 된 steroidogenic 세포를 감지,이 프로토콜은 3-β-하이드 록시 탈수소 효소 (3β-HSD Δ ^{5-4 이성화} 효소)를 수행하는 방법을 소개합니다.

초록

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-β-Hydroxysteroid dehydrogenase /Δ^5-4 isomerase (3β-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3β-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3β-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

서문

부신은 시상 하부 - 뇌하수체 - 부신 축의 중요한 구성 요소, 스테로이드를 분비하고 스테로이드 항상성과 스트레스에 대한 신체 반응을 조정한다. 부신은 카테콜아민을 합성 ㄱ 영역 별 방식으로 스테로이드를 분비 바깥 쪽 피질, 및 내부 수질를 포함한다. 경골 어류의 interrenal 선은 포유 동물의 부신의 상대이며, 부신 피질과 수질, 각각 ^1-3의 기능적 등가물이다 steroidogenic interrenal과 크롬 친화 세포로 구성되어있다. 제브라 피쉬 모델을 사용하여 수행 연구는 모두 steroidogenic 및 크롬 친화 세포의 계보가 매우 포유류 ^{1, 2에서와} 유사한 분자 및 세포 메커니즘에 의해 형성되는 것으로보고있다. 따라서, 제브라 피쉬는 유전 질환, 신경 내분비 조절하고, 시상 하부 - 뇌하수체 - 부신 (interrenal) 축 시스템 생물학 연구를위한 잠재적으로 강력한 모델이다.

, 3β-HSD는 데히드 ^4,5에서 17α-hydroxypregnelolone에서 프레 그네 놀론, 17α-hydroxyprogesterone에서 프로게스테론의 변환 및 안드로 스텐 디온을 촉매. 3β-HSD 호르몬 스테로이드, 즉 황체 호르몬, 글루코 코르티코이드, 무기질 코르티코이드, 안드로겐과 에스트로겐의 모든 클래스를 생합성을 위해 필수적이다. 두 사람의 3β-HSD는 HSD3B1을 동질 효소와 HSD3B2는 차동 ⁽⁶⁾ 표현된다. HSD3B2가 신피질 생식선에서 발현되는 반면 HSD3B1는 태반 및 말초 조직에서 발현된다. 인간 HSD3B1 및 HSD3B2는 interrenal 조직과 성인 생식선에서 표현되는 제브라 피쉬 hsd3b1, 공동 orthologs이다; 제브라 피쉬 hsd3b2 누구의 성적 기관 형성 ^칠하기 전에 사라질 모체 표현 유전자이다. 제브라 피쉬의 전체 마운트 3β-HSD 효소 활성 분석의 프로토콜, 레비의 방법을 수정하여 개발 된밀라노 등의 알에 의해 설명 s의. 여덟 경골 종 ^(8)의 동결 절편에. 때문에 조직 투과성 현상 지브라 피쉬의 광학 투명성, 3β-HSD 조직 화학 성공적 고정 제브라 배아와 유충에 사용할 수있는 전체 마운트 구체적 차별화 interrenal 조직을 서술.

이 민감하고 신속한 분석은 interrenal dysmorphogenesis의 다른 유형을 보여주는 다양한 돌연변이 morphants 적용되었다. interrenal 3β-HSD 활성은 interrenal 조직 명세가 Ff1b 전사 인자의 특정 녹다운을 중단하고 interrenal 분화가 Ff1b의 coregulator Prox1 ^9,10-의 최저 의해 영향으로 감소 된 배아 부재. 특히, 3β-HSD 활동과 같은 하나 아이드 핀 머리 심한 초기 결손 돌연변이 체에서 검출 될 수 있고, 여기서 H-3β, 곁눈질SD 조직 화학은 interrenal 세포 이동 ^(11)를 어떻게 영향을 받는지 묘사. interrenal 조직의 분화에도 혈액과 혈관의 완전한 부재에 손상되지 않습니다. 따라서, 내피 세포 유래 신호를 형성하는 방법을 개발 interrenal 기관은 ^{12, 13를} 측정 할 수있다. 전반적으로,이 조직 화학적 분석은 성공적으로 제브라 피쉬 모델의 사양, 차별화, 그리고 steroidogenic 세포의 이동을 연구에 사용되었다. 따라서, 효율적이고 부신 및 interrenal 장기 장애를 타겟팅하는 유전자 또는 화학 스크린에 대한 신뢰할 수있는 도구를해야한다.

프로토콜

윤리 정책 : 제브라 피쉬의 모든 실험 절차는 동해 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다 (IRB 승인 NO 101-12합니다.) 및 승인 된 지침에 따라 수행 하였다.

3β-HSD 효소 활성 염색 1. 재고 솔루션

1. 트랜스 dehydroandrosterone [디메틸 술폭 사이드 (DMSO)에 10 ㎎ / ㎖]를 준비한다.
2. β - 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드 수화물 (0.1 M 인산염 완충액에서 1.2 ㎎ / ㎖, pH를 7.2)을 준비한다.
3. 니코틴 준비 (비타민 B3,을 50mg / ㎖의 H ₂ O).
4. 4- 니트로 블루 테트라 졸륨 (50 ㎎ / ㎖ 70 % 디메틸 포름 아미드)를 준비한다.
5. -20 ° C에서의 미세 원심 분리 튜브에 나누어 저장하는 모든 이러한 구성 요소.
   참고 : 우리의 경험, 반복 동결 모든 상기 용액의 분취 량의 해동에서 3β-HSD 활동 염색의 강도에 영향을주지 않습니다.

2. W홀 마운트 3β-HSD 활동 염색

참고 : 3β-HSD 효소 활성이 빠르면 28시간 게시물 수정 (HPF)와 같은 경우 배양 hsd3b1 ^2,7의 mRNA 발현의 발병과 일관성이 28.5 ° C,에서 제브라 피쉬 배아에서 감지 할 수 있습니다. 이 연구에서 전체 마운트 3β-HSD 활성 염색 프로토콜은 전술 한 방법 ^(8)에 기초하고 최대 7 일 후 시비 ⁹ 현상 제브라 성공적인 것으로 측정되었다. interrenal steroidogenic 조직의 혈관 미세 환경을 분석, 3β-HSD 활동 염색을 전체 마운트하는 것은 이러한 Tg는 같은 내피 세포 고유의 형광을 발현하는 형질 전환 라인 (kdrl : EGFP)에 적용해야합니다은 : ^{C15- 카르 (15) (14)과의} Tg (mCherry kdrl를) ^S843 . 제브라 신장 개발을 고려 interrenal steroidogenic 조직을 분석, 3β-HSD 활성 염색 될 수 애플리^{LI1 물고기 (16),} 사구체 및 pronephric 세관의 형성이 묘사되어 Tg가 (GFP wt1b)에 에디션.

1. 색소 형성을 억제하기 위해, 12, 24 HPF 사이의 단계에서 시작, 달걀 물에 0.03 %의 페닐 티오 요소 (Phenylthiourea)에서 (탈 이온수에 0.06 ㎎ / ℓ 암초 소금)을 배양하여 개발 제브라 피쉬를 취급합니다.
2. 밤새 실온 (RT) 또는 (B) 2 % PFAT에서 1 시간 동안 0.1 % 트윈 20 (PFAT)으로 보충 된 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 (A) 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에 dechorionated 배아 또는 유충 해결 4 °의 C 또는 실온에서 4 시간 뒤에 4 ° C에서 2 시간에 대해.
   주의 : PFA는 흡입 및 피부 접촉에 의해 독성. 그것은 피부, 점막, 눈, 상부 호흡기에 파괴.
3. PBS는 RT에서 0.1 % 트윈 20 (PBST)가 보충 10 분간 배아 4X 씻는다.
   주 : 세탁 솔루션을 변경하면서 샘플을 건조하지에 중요합니다.
4. 갓 역을 준비반응 전에 ining 용액 (표 1). 준비, 소용돌이, 분리 튜브에서 원심 분리 부 A 및 B.
   참고 : 바로 하나의 튜브에 모든 구성 요소를 추가하면 심한 침전을 일으킬 것입니다.
5. 부분 (B)의 전체 용액 A 부분의 전체 용액을 첨가 염색 용액을 제조 잘 혼합하고 즉시 고정 세정 배아를 포함하는 각 미세 원심 분리 튜브에 1 ㎖에 배포한다.
6. 회 전자 또는 실온에서 진탕 부드러운위한 락 플랫폼 중 하나에 빛과 장소에서 그들을 보호하기 위해 알루미늄 호일로의 microfuge 튜브를 감싸.
7. 경험적으로 현미경을 통해 발색 신호를 모니터링함으로써, 반응 시간을 결정한다. 시간이 지남에 따라 개발한다 약간의 침전; 그러나, 이들은 반응 과정을 방해하지 않을 것이다.
   참고 : 배아가 4 시간 동안 25 ° C에서 28 HPF, 염색 고정을 위해 interrenal 조직에서 명확한 신호를 생성한다.
8. PBST에서 10 분 동안 4 배를 세척하여 반응을 정지. 나는F 더 이상 면역 조직 화학 (IHC) 분석이 필요하지 않습니다, 이후 수정 실온에서 60 분 동안 4 % PFAT와 스테인드 배아를. 그렇지 않으면 더 사용할 때까지 4 ° C에서 세척 된 배아를 저장합니다.
9. 전체 마운트 현미경 들어, PBS에 50 % 글리세롤로, 염색 후 고정, 세척 배아를 취소 슬라이드에이 위를 향하도록 몸 윗면로 방향을, 밝은 필드 조명 아래 직립 현미경을 이용하여 관찰한다.
   참고 : 권장 interrenal 조직 형태의 고해상도 이미지의 3β-HSD 활동 염색 및 deyolked 배아의 분석을 평면 마운트 확인하십시오. interrenal steroidogenic 조직이 바로 난황 위에 위치로, interrenal 조직의 복부 평면 마운트 분석은 interrenal 형태 ^(17)의 직접적이고 명확한 관찰 할 수 있습니다.

3β-HSD 활동 묻은 태아의 3 IHC 분석

주 : steroi의 혈관 미세 환경 분석을위한dogenic 조직은 형질 전환 내피 특정 형광 기자와 3β-HSD 활동 묻은 배아는 vibratome 절편 이후 IHC 분석 ^{12, 18, 20, 22를} 횡단하기 위해 실시한다.

1. 후 고정
   1. 4 ° C에서 1 시간 동안 1 % 트리톤 X-100 보충 2 % PFA와 3β-HSD 활동 염색 및 세척 배아를 포스트 - 수정 1 % 트리톤 X-100을 포함하는 PBS에서 10 분 동안 배를 씻어 (PBSTx) RT에서.
2. 퍼가기
   1. 4 %가 95 ° C, 4-8 ℃에서의 microfuge 튜브로 나누어지는 및 매장에서 PBS에서 아가로 오스를 용해하여 아가 로스 저 융점 준비합니다.
   2. 10 분 동안 70 ° C에서 아가로 오스 4 % 저 융점의 나누어지는 용융 한 후 47 ° C에서 나누어지는을 유지합니다. 각각의 배아를 포함 용융 4 % 금형 역할을하는 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브의 분리 된 모자 아가로 오스 저 융점, 고체까지 냉각 할 수 있습니다.
3. Vibratome 단면
   1. 건조 페이지에 종이 테이프의 조각 스틱vibratome의 latform.
   2. 면도날에 의해 금형에서 경화 아가로 오스 블록을 제거합니다. 플랫폼에 종이 테이프에 순간 접착제를 적용하고 위를 향 샘플의 앞쪽면, 종이 테이프에 아가로 오스 블록을 수정합니다. 각각 약 4mm 상부 및 하부면 양쪽에 8mm로, 사다리꼴 프리즘 형상 아가 블록 낸다.
   3. 스포이드를 사용하여 0.5 % 트리톤 X-100 (0.5 % PBSTx) 보충 차가운 PBS로 샘플을 함유 아가로 오스 블록을 씻어.
   4. vibratome의 사용 설명서에 따라 100 μm의 섹션으로 아가로 오스 블록을 슬라이스. 계속해서 건조를 방지하는 아가 블록을 헹군다. 각 슬라이스 절단되기 때문에, 26 G 주사기 바늘을 이용하여 vibratome에서 제거하고, 차가운 0.5 % PBSTx (500 μL / 웰)를 포함하는 스폿 플레이트에 옮긴다.
   5. 해부 현미경 하에서 검사하여 3β-HSD 활성 양성 조직 절편을 수집하고, PI에 의한 부분 전송추운 0.5 % PBSTx (150 μL / 웰)를 포함하는 96 웰 플레이트에 끝 차단 (개방에서 약 1mm 내경)와 pette 팁. 조직 샘플은 통상적으로이 공정 후의 아가 블록으로부터 해리.
4. Permeabilization 및 세척
   1. PBS에서 10 분, 1 % 소 혈청 알부민 / 1 % DMSO / 0.1 % 트리톤 X-100 (PBDTx)로 보충을위한 슬라이스 RT에서 0.5 % PBSTx 15 분간 PBS에서 10 분, 4 배 6 배 씻는다.
5. 블로킹
   1. RT에서 1 시간 PBDTx 2 % 소 태아 혈청 (FCS)을위한 슬라이스 부화.
6. 차 항체 반응
   1. 차 항체를 함유하는 PBDTx 1.5 일 동안 인큐베이션 슬라이스 (예를 들어 토끼 다 클론 항 - 인간 피브로넥틴 및 마우스 항 - 인간 국소 부착 키나아제) 4 ℃에서.
7. 세탁
   1. 조각은 실온에서 PBDTx에서 10 분 동안 6 배 씻으십시오.
8. 블로킹
   1. PB에 2 % FCS에서 1 시간 동안 조각을 품어RT에서 DTX.
9. 차 항체 반응
   1. 4 ° C에서 차 항체 (형광 결합 염소 항 - 토끼 또는 항 - 마우스 IgG)를 포함 PBDTx 1.5 일 동안 조각을 품어.
10. 세탁
    1. 조각은 실온에서 PBST에서 10 분 동안 10 RT에서 PBDTx에서 분 및 4 배에 대한 6 배 씻으십시오.
       , 공 초점 현미경 분석을 위해 PBS에 50 % 글리세롤로 샘플을 취소 : 참고.

4. 공 촛점 분석

1. 전체 마운트 배아 및 10X / 0.5 20X / 0.75 대물 렌즈가 장착 된 공 초점 현미경으로 단면을 관찰한다.
2. 다음 형광 및 3β-HSD 염색을 동시에 검출 들어, 멀티 모드를 설정 488nm의 아르곤 레이저 및 GFP의 검출 505-530 nm의 대역 통과 필터; 543 nm의 헬륨 - 네온 레이저 mCherry 감응 560-615 nm의 대역 통과 필터; 및 3β-HSD의 얼룩의 검출을위한 광 채널 전송된다.핀홀 크기는 1 Airey 부이고, 해상도가 1024 X 1024 픽셀이다.
3. 3 차원으로 투영 (6 μm의 간격)의 Z 스택을 조립하고 이용함으로써, 돌기와 시야 병합 내장 촛점 소프트웨어.

결과

pronephric 신장 사구체 및 초기 혈관과 steroidogenic interrenal 조직 codevelops에서, 3β-HSD 효소 활성 분석은 이중 형질 전환의 Tg (wt1b : GFP)에서 수행 된 방법을 결정하려면 ^LI1, Tg는 (kdrl : mCherry) ^{C15- 카르 배아를} 34 HPF에서 (그림 1). 이 단계에서, 3β-HSD 활동을 양성 steroidogenic 조직을 바로 중간 선에 위치하고 있으며 일부 steroidogenic 세포가 중?...

토론

3β-HSD 활동의 신호 강도는 반응의 과정을 통해 증가. 3β-HSD 활동의 명확한 신호는 이후 28 HPF에서 단계에 대한 반응 4 시간 후에 발견되었다. 그러나, 반응 시간은 분석의 목적에 따라 경험적 결정이 필요하다. 염색 밤새 처리 요구의 경우, 약간 엷은 배경 샘플을 개발하는 경향이있다. 이 문제는 HSD-3β 활성 염색 전에 고정 지속 시간 (예를 들어, RT에서 4 % PFAT에서 4 시간)의 증가에 의해 극복 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal microscope	Carl Zeiss	LSM510
DMSO	Sigma	D8418
Glycerol	USB	US16374
Hyclone Fetal Calf Serum	GE Healthcare Life Sciences	SH30073
Nicotinamide	Sigma	N0636
β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate	Sigma	N1636
4-Nitro blue tetrazolium	Promega	S380C
Nusieve GTG	Lonza	50081
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Phenylthiourea	Sigma	P7629
Phosphate buffered saline	Sigma	P4417-100Tab
PYREX Spot Plate	Corning	7220-85
Reef Salt	AZOO	AZ28001
trans-Dehydroandrosterone	Sigma	D4000
Triton X-100	Sigma	T8787
Tween 20	Sigma	P9416
Vibratome	Leica	VT1000M