JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Интерреналовой железа в данио является костистых аналогом млекопитающих надпочечника. Этот протокол представляет , как выполнить 3-β-гидроксистероиддегидрогеназы (Δ 5-4 изомеразный; 3β-HSD) ферментативной активности анализа, который обнаруживает дифференцированные стероидогенеза клеток в развивающихся данио рерио.

Аннотация

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-β-Hydroxysteroid dehydrogenase /Δ5-4 isomerase (3β-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3β-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3β-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

Введение

Надпочечники, важнейшим компонентом гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, секретирует стероиды и координирует стероидный гомеостаз и телесную реакцию на стресс. Надпочечники включает внешнюю кору, которая секретирует стероиды в манере зоны специфичную и внутренние мозговое вещество, которое синтезирует катехоламины. Интерреналовой железы у костистых рыб является аналогом надпочечников у млекопитающих и состоит из стероидогенных интерреналовой и хромафинных клеток, которые являются функциональными аналогами коры надпочечников и мозгового вещества соответственно 1-3. Исследования , проведенные с использованием модели данио сообщили , что оба стероидогенных и Хромаффинные клеточных клонов формируются молекулярных и клеточных механизмов , весьма напоминающих те , у млекопитающих 1,2. Поэтому данио является потенциально мощной моделью для изучения генетических заболеваний, контроля нейроэндокринной и систем биологии гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой (интерреналовой) оси.

В надпочечниках, 3β-HSD катализирует превращение прогестерона из прегненолона, 17 & alpha ; -гидроксипрогестерона от 17 & hydroxypregnelolone и андростендион из дегидроэпиандростерона 4,5. 3β-HSD имеет важное значение для биосинтеза всех классов гормональных стероидов, а именно, прогестерон, глюкокортикоиды, минералокортикоиды, андрогены и эстрогены. Два человеческого 3β-HSD изоферментов HSD3B1 и HSD3B2 дифференцированно выражены 6. HSD3B1 выражается в плаценте и периферических тканях, тогда как HSD3B2 выражается в коре надпочечников и гонад. Человек HSD3B1 и HSD3B2 являются со-ортологи данио hsd3b1, которая выражается в интерреналовой ткани и взрослых гонад; данио hsd3b2 является материнским выразил ген, транскрипты исчезнуть до органогенеза 7. Протокол 3β-HSD ферментативного анализа всего монтажа активности для данио был разработан путем модификации метода Леви, Aы описывается Milano и др. , На замороженных срезов восьми видов костистых 8. Из-за тканевой проницаемости и оптической прозрачности развивающихся данио, в целом монтажа 3β-HSD гистохимия может быть успешно использован для фиксированного данио эмбрионов и личинок и конкретно очертить дифференцированные интерреналовой ткани.

Этот чувствительный и быстрый анализ был применен к различным мутантами и морфантов, демонстрирующих различные типы интерреналовой дисморфогенеза. Интерреналовой активность 3β-HSD отсутствует в зародыше , где спецификация интерреналовой ткани нарушается через специфический нокдаун фактора транскрипции Ff1b и уменьшается как интерреналовой дифференциация влияет на нокдауна Ff1b coregulator Prox1 9,10. Следует отметить, что активность 3β-HSD могут быть обнаружены у мутантов с тяжелыми дефектами на ранних стадиях развития , такие , как одноглазый булавочной головки и косоглазие, где 3β-Hсд гистохимия очерчивает как миграция интерреналовой клеток влияет 11. Дифференцировка интерреналовой ткани не будет нарушена даже при полном отсутствии крови и сосудистой сети. Поэтому, как эндотелием сигналы формируют развивающийся интерреналовой орган может быть определено 12,13. В целом, этот гистохимических анализ был успешно использован для изучения спецификации, дифференцировки и миграции стероидогенных клеток в данио модели. Таким образом, оно должно быть эффективным и надежным инструментом для любых генетических или химических экранов, ориентированных на надпочечники и интерреналовой расстройства органов.

протокол

Заявление по этике: Все экспериментальные процедуры по данио были утверждены Институциональный животных по уходу и использованию комитета Tunghai университета по (IRB одобрение NO 101-12.) И осуществляется в соответствии с утвержденными руководящими принципами.

1. Исходные растворы для 3β-HSD ферментативная активность Окрашивание

  1. Готовят транс-dehydroandrosterone [10 мг / мл в диметилсульфоксиде (ДМСО)].
  2. Готовят β-никотинамидадениндинуклеотидфосфат гидрат (1,2 мг / мл в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,2).
  3. Готовят никотинамид (витамин B3, 50 мг / мл в H 2 O).
  4. Подготовка 4-нитро-тетразолия (50 мг / мл в 70% диметилформамиде).
  5. Аликвотные все эти компоненты в микроцентрифужных пробирках и хранят при -20 ° C.
    Примечание: В нашем опыте, многократном замораживании и оттаивании аликвот всех вышеупомянутых решений не влияют на интенсивность окрашивания активности 3β-HSD.

2. WОтверстие монтажа 3β-HSD активность Окрашивание

ПРИМЕЧАНИЕ: ферментативная активность 3β-HSD обнаруживается у эмбрионов данио рерио уже в 28 часов после оплодотворения (ФВЧ) , когда культивировали при 28,5 ° C, что согласуется с началом экспрессии мРНК hsd3b1 2,7. Весь монтажа 3β-HSD протокол окрашивания активность в данном исследовании на основе описанного выше метода 8 и был определен , чтобы быть успешным в развивающихся данио до 7 дней после оплодотворения 9. Для анализа сосудистой микросреду интерреналовой стероидогенной ткани, в целом монтажа 3 & HSD активность окрашивания должны быть применены к трансгенных линий , выражающих эндотелий-специфические флуоресценцию, такие как Tg (kdrl: EGFP) s843 14 и Tg (kdrl: mCherry) CI5 15 , Для анализа интерреналовой стероидогенных ткани с учетом развития данио почек, активность окрашивания 3β-HSD может быть примее изд к Tg (wt1b: GFP) li1 рыбы 16, где очерчена формирование клубочках и pronephric канальцев.

  1. Обрабатывают развивающуюся данио путем выдержки их в термостате в 0,03% фенилтиомочевины в яичном воде (0,06 мг / л рифовую соли в деионизированной воде), начиная с этапа от 12 до 24 часов после оплодотворения, чтобы ингибировать образование пигмента.
  2. Закрепить dechorionated эмбрионов или личинок на стадии (а) 4% параформальдегида (PFA) в фосфатно-солевом буфере (PBS), дополненной 0,1% Tween 20 (PFAT) в течение 1 ч при комнатной температуре (RT) или (В) 2% PFAT в течение ночи при 4 ° с или в течение 2 ч при 4 ° с, затем в течение 4 ч при комнатной температуре.
    Внимание: PFA токсичен при вдыхании и при контакте с кожей. Это разрушительное воздействие на кожу, слизистые оболочки, глаза и верхних дыхательных путей.
  3. Промыть эмбрионы 4x в течение 10 мин с ФБР с добавкой 0,1% Tween 20 (PBST) при комнатной температуре.
    Примечание: Очень важно, чтобы не высушить образцы при изменении моющих растворов.
  4. Свеже подготовить ГНАоцен- ками раствор перед реакций (таблица 1). Приготовьте, вихрь, и центрифуга части А и В в отдельные пробирки.
    Примечание: Добавление всех компонентов прямо в одну трубку бы вызвать серьезные осадки.
  5. Добавить все решение в части А ко всему раствору части В, хорошо перемешать, чтобы приготовить раствор для окрашивания, и сразу же распределить 1 мл в каждую пробирку, содержащую микроцентрифуге фиксированные и промытые эмбрионов.
  6. Оберните микроцентрифуге трубы с алюминиевой фольгой, чтобы защитить их от света месте и на любой ротатор или качающейся платформе для осторожном встряхивании при комнатной температуре.
  7. Эмпирически определяют время реакции путем мониторинга хромогенные сигналов с помощью микроскопии. Незначительные осадки будут развиваться с течением времени; Тем не менее, они не будут мешать процессу реакции.
    Примечание: Для получения эмбрионов установлена ​​на 28 часов после оплодотворения, окрашивание при температуре 25 ° С в течение 4 ч формирует четкий сигнал на интерреналовой ткани.
  8. Остановить реакцию промывкой 4 раза в течение 10 мин в PBST. яе не далее иммуногистохимического (IHC) анализ не требуется, после фиксации окрашивали эмбрионов с 4% PFAT в течение 60 мин при комнатной температуре. В противном случае, не хранить промытых эмбрионов при 4 ° С до дальнейшего использования.
  9. Для целом монтажа микроскопии, очистить окрасить, фиксировали и промытые эмбрионов с 50% глицерина в PBS, ориентировать их спинной стороной вверх на слайде, и наблюдать, используя прямой микроскоп при ярком освещении поля.
    Примечание: Для того, чтобы сделать изображение с высоким разрешением морфологии интерреналовой ткани, плоским смонтировать анализ 3β-HSD активность окрашенном и deyolked эмбриона рекомендуется. По мере того как интерреналовой стероидогенных ткань расположена прямо над желтка, вентральный плоским смонтировать анализ интерреналовой ткани позволяет прямое и четкое наблюдение интерреналовой морфологии 17.

3. IHC Анализ 3β-HSD активность окрашенных Эмбрионы

ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа сосудистой микроокружение steroidogenic ткани, активность окрашенных эмбрионов 3β-HSD с трансгенной эндотелий-специфический флуоресцентный репортер подвергаются поперечным vibratome секционирования и последующий анализ IHC 12,18.

  1. Пост-крепление
    1. После фиксации 3β-HSD активность окрашенных и промытые эмбрионов с 2% PFA с добавлением 1% Тритон Х-100 в течение 1 ч при 4 ° С и моют 4 раза в течение 10 мин в PBS, содержащем 1% Triton X-100 (PBSTx) при комнатной температуре.
  2. Вложение
    1. Подготовка 4% легкоплавкой агарозы путем растворения агарозы в PBS при 95 ° С, аликвоты в микроцентрифужных пробирках, и хранят при температуре 4-8 ° С.
    2. Melt аликвоты 4% легкоплавких агарозы при 70 ° С в течение 10 мин, а затем сохранить аликвоты при 47 ° C. Встраивание каждого эмбриона в расплавленный 4% легкоплавкой агарозы в отдельном колпачке 1,5 мл пробирке а, которая служит в качестве пресс-формы, и позволить остыть до твердого продукта.
  3. Vibratome Секционирование
    1. Придерживайтесь кусок бумажной ленты к сухому рlatform из vibratome.
    2. Удалить затвердевшую агарозном блок из пресс-формы с помощью лезвия бритвы. Нанесите суперклей на бумажную ленту на платформе, и зафиксировать агарозном блок на бумажную ленту, с передней стороны образца, обращенной вверх. Обрежьте агарозном блок в трапециевидную форму призмы, с примерно 4 мм и 8 мм с каждой стороны верхней и нижней граней, соответственно.
    3. Промыть принимающую образец, содержащий агарозном блок с холодным PBS, дополненную 0,5% Triton X-100 (0,5% PBSTx) с помощью капельницы.
    4. Нарезать блок агарозы на секции 100 мкм в соответствии с инструкцией по эксплуатации vibratome. Постоянно промывайте блок агарозы, чтобы предотвратить высыхание. Поскольку каждый ломтик разрезать, удалить его из vibratome с помощью 26 G иглы шприца, и переносят на спотовом пластину, содержащую холодный 0,5% PBSTx (500 мкл / лунку).
    5. Сбор активности-положительных срезов ткани-3 & beta; Hsd, проверяя под микроскопом рассечение, и передать секции пиPette наконечник с его конечным отсечкой (около 1 мм внутренний диаметр при открытии) в 96-луночный планшет, содержащий холодный 0,5% PBSTx (150 мкл / лунку). Образцы ткани, как правило, диссоциируют из блока агарозы после этого шага.
  4. Пермеабилизирующего и стиральная
    1. Промыть срезы 6х в течение 15 мин в 0,5% PBSTx при комнатной температуре 10 мин в PBS, и 4x в течение 10 мин в PBS с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина / 1% ДМСО / 0,1% Тритон Х-100 (PBDTx).
  5. блокирование
    1. Инкубируйте ломтики в течение 1 ч в 2% фетальной телячьей сыворотки (FCS) в PBDTx при комнатной температуре.
  6. Первичная реакция антител
    1. Инкубируйте ломтики в течение 1,5 дней в PBDTx содержащих первичное антитело (например, кроличьи поликлональные антитела против человеческого фибронектина и мышиное анти-человеческого фокусного адгезионная киназа) при температуре 4 ° С.
  7. Мойка
    1. Промыть срезы 6х течение 10 мин в PBDTx при комнатной температуре.
  8. блокирование
    1. Инкубируйте ломтики в течение 1 часа в 2% FCS в PBDTx при комнатной температуре.
  9. Вторичная реакция антитела
    1. Инкубируйте ломтики на 1,5 дней в PBDTx, содержащее вторичное антитело (флуорофора-конъюгированный козий анти-кроличий или анти-мышь IgG) при 4 ° С.
  10. Мойка
    1. Промыть срезы 6х течение 10 мин в PBDTx при комнатной температуре и в 4 раза в течение 10 мин в PBST при комнатной температуре.
      Примечание: Для конфокальной микроскопического анализа, очистить образцы с 50% глицерина в PBS.

4. Анализ конфокальной

  1. Обратите внимание на всю гору эмбрион и раздел с помощью конфокальной микроскопа, снабженного 10X / 20X и 0,5 / 0,75 объектива.
  2. Для одновременного обнаружения флуоресценции и окрашивания 3β-HSD, установите многодорожечный режим следующим образом: 488 нм аргонового лазера и 505-530 нм полосовой фильтр для обнаружения GFP; 543 нм лазер Гелий-неоновый и 560-615 нм полосовой фильтр для обнаружения mCherry; и передают световой канал для обнаружения 3β-HSD окрашивания.Обскура размер 1 Аирей единица, а разрешение составляет 1024 х 1024 пикселей.
  3. Соберите Z стеки (с интервалом 6 мкм) в качестве 3D-проекции, и объединить проекцию и яркое поле, с помощью встроенного программного обеспечения конфокальной.

Результаты

Для того, чтобы определить , как стероидогенных codevelops интерреналовой ткани с pronephric клубочков почек и его нарождающейся сосудистую систему , анализ ферментативной активности 3β-HSD была выполнена на двойном трансгенной Tg (wt1b: GFP) li1; Tg (kdrl: mCherry) CI5 эмбрионов ...

Обсуждение

Сила сигнала активности 3β-HSD увеличилось в течение реакции. Четкие сигналы активности 3β-HSD были обнаружены после 4 часов реакции на стадии с 28 часов после оплодотворения и далее. Тем не менее, продолжительность реакции требует эмпирического определения, в зависимости от цели анализа. В ...

Раскрытие информации

The authors have no competing financial interests to declare.

Благодарности

Мы благодарим профессора Кристофа Englert и профессор Didier Stainier для подарив Т.Г. (wt1b: GFP) li1 и Tg (kdrl: EGFP) s843 штаммы, соответственно, и Тайвань рерио Основной фонд для обеспечения Tg (kdrl: mCherry) CI5. Это исследование было поддержано грантами Министерства Тайваня по науке и технике (96-2628-B-029-002-MY3, 101-2313-B-029-001, 102-2628-B-029-002-MY3, 102- 2321-B-400-018).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Confocal microscopeCarl Zeiss LSM510 
DMSOSigmaD8418 
GlycerolUSBUS16374
Hyclone Fetal Calf Serum GE Healthcare Life SciencesSH30073
NicotinamideSigmaN0636
β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrateSigmaN1636
4-Nitro blue tetrazoliumPromegaS380C
Nusieve GTGLonza50081
ParaformaldehydeSigmaP6148
PhenylthioureaSigma P7629
Phosphate buffered salineSigmaP4417-100Tab
PYREX Spot PlateCorning7220-85
Reef SaltAZOOAZ28001
trans-DehydroandrosteroneSigmaD4000
Triton X-100SigmaT8787
Tween 20SigmaP9416
VibratomeLeicaVT1000M

Ссылки

  1. Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b. Development. 130, 2107-2116 (2003).
  2. To, T. T., et al. Pituitary-interrenal interaction in zebrafish interrenal organ development. Mol Endocrinol. 21, 472-485 (2007).
  3. Liu, Y. W. Interrenal organogenesis in the zebrafish model. Organogenesis. 3, 44-48 (2007).
  4. Cravioto, M. D., et al. A new inherited variant of the 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase-isomerase deficiency syndrome: evidence for the existence of two isoenzymes. J Clin Endocrinol Metab. 63, 360-367 (1986).
  5. Lachance, Y., et al. Characterization of human 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta 5-delta 4-isomerase gene and its expression in mammalian cells. J Biol Chem. 267, 3551 (1992).
  6. Simard, J., et al. Molecular biology of the 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta5-delta4 isomerase gene family. Endocr Rev. 26, 525-582 (2005).
  7. Lin, J. C., et al. Two zebrafish hsd3b genes are distinct in function, expression, and evolution. Endocrinology. 156, 2854-2862 (2015).
  8. Grassi Milano, E., Basari, F., Chimenti, C. Adrenocortical and adrenomedullary homologs in eight species of adult and developing teleosts: morphology, histology, and immunohistochemistry. Gen Comp Endocrinol. 108, 483-496 (1997).
  9. Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ. Dev Biol. 260, 226-244 (2003).
  10. Liu, Y. W., Gao, W., Teh, H. L., Tan, J. H., Chan, W. K. Prox1 is a novel coregulator of Ff1b and is involved in the embryonic development of the zebra fish interrenal primordium. Mol Cell Biol. 23, 7243-7255 (2003).
  11. Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ. Dev. Biol. 260, 226-244 (2003).
  12. Chou, C. W., Zhuo, Y. L., Jiang, Z. Y., Liu, Y. W. The hemodynamically-regulated vascular microenvironment promotes migration of the steroidogenic tissue during its interaction with chromaffin cells in the zebrafish embryo. PLoS One. 9, e107997 (2014).
  13. Liu, Y. W., Guo, L. Endothelium is required for the promotion of interrenal morphogenetic movement during early zebrafish development. Dev Biol. 297, 44-58 (2006).
  14. Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
  15. Proulx, K., Lu, A., Sumanas, S. Cranial vasculature in zebrafish forms by angioblast cluster-derived angiogenesis. Dev Biol. 348, 34-46 (2010).
  16. Perner, B., Englert, C., Bollig, F. The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros. Dev Biol. 309, 87-96 (2007).
  17. Chou, C. W., Chiu, C. H., Liu, Y. W. Fibronectin mediates correct positioning of the interrenal organ in zebrafish. Dev Dyn. 242, 432-443 (2013).
  18. Chiu, C. H., Chou, C. W., Takada, S., Liu, Y. W. Development and fibronectin signaling requirements of the zebrafish interrenal vessel. PLoS One. 7, e43040 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1183vibratome

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены