JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الميتوكوندريا الخلايا البطانية حاسمة للحفاظ على سلامة الدم في الدماغ من العوائق. ونحن نقدم على بروتوكول لقياس وظيفة الطاقة البيولوجية في خلايا بطانة الأوعية الدموية الدماغية.

Abstract

سلامة الدم في الدماغ من العوائق (BBB) ​​أمر بالغ الأهمية لمنع إصابات الدماغ. الدماغية البطانية الوعائية (CVE) الخلايا هي واحدة من أنواع الخلايا التي تتكون من BBB. هذه الخلايا لها رواجا جدا ذات طاقة عالية، الأمر الذي يتطلب وظيفة الميتوكوندريا المثلى. في حالة المرض أو الإصابة، وظيفة الميتوكوندريا في هذه الخلايا يمكن تغييرها، مما أدى إلى المرض أو افتتاح BBB. في هذه المخطوطة، ونحن نقدم طريقة لقياس وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا CVE باستخدام كلها، خلايا سليمة وbioanalyzer. ويتم استخدام فحص ميتو من التوتر للطعن في الخلايا التي تم مضطرب، سواء بدنيا أو كيميائيا، وتقييم وظيفتها الطاقة البيولوجية. بالإضافة إلى ذلك، يوفر هذا الأسلوب أيضا وسيلة مفيدة لفحص العلاجات الجديدة التي لها تأثيرات مباشرة على وظيفة الميتوكوندريا. لقد الأمثل لكثافة الخلايا اللازمة لانتاج معدلات استهلاك الأوكسجين التي تسمح لحساب مجموعة متنوعة من الفقرة الميتوكوندريامتر، بما في ذلك إنتاج ATP، والتنفس القصوى، والطاقة الفائضة. وتبين لنا أيضا حساسية الفحص من قبل مما يدل على أن إدخال الرنا الميكروي، مير 34A، يؤدي إلى انخفاض واضح وكشف في النشاط الميتوكوندريا. في حين أن البيانات الواردة في هذه الورقة هو الأمثل للخط الخلوي bEnd.3، لدينا أيضا إلى تحسين أداء بروتوكول للخلايا CVE الأولية، مما يشير إلى فائدة في النماذج قبل السريرية والسريرية.

Introduction

ومن المسلم به على نطاق واسع أن الدم في الدماغ من العوائق (BBB) ​​التي شكلتها خلايا المخ البطانية الوعائية (CVE) لديها وظائف مميزة جدا وفريدة من نوعها قصوى بالنسبة لعلم الأحياء الأوعية الدموية. هذه الخلايا البطانية استخدام الميتوكوندريا لتوليد معظم إمدادات الخلوي من الأدينوساين ثلاثي (ATP) كمصدر للطاقة كيميائية. وبالإضافة إلى توفير ATP للخلايا CVE، الميتوكوندريا تنظم العمليات الخلوية المختلفة في خلايا بطانة الأوعية الدموية، مثل الخلوية يشير 1-4، موت الخلايا المبرمج 5، والسيطرة على دورة الخلية ونمو الخلايا 6. ديسريغولاتيون وظيفة الطاقة البيولوجية الميتوكوندريا في الخلايا CVE قد تؤثر على نشوء حيوي الميتوكوندريا، مما يؤدي إلى ضعف النشاط البطانة الوعائية، وتفاقم الأمراض القلبية الوعائية والاضطرابات العصبية، على سبيل المثال، السكتة الدماغية 7،8 ومرض الزهايمر (AD) 9. لقد أثبتنا أن الإهانات إلى خلايا CVE بعد التعرض لlipopolysaccharide (LPS) يضعف وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا CVE وتفاقم السكتة الدماغية الحصائل 7. ثالثي butylhydroquinone (TBHQ) يزيد معدل وفيات السكتة الدماغية عن طريق التداخل مع الفسفرة المؤكسدة في الخلايا CVE 10. ولذلك، فإن نموذج كمي وظيفة الطاقة البيولوجية في خلايا CVE الطيارين ليس فقط سلسلة من الدراسات ذات الصلة آلية للنظام العصبي المركزي (CNS) الأمراض، ولكن أيضا يوفر انفراجة في فحص المخدرات من العلاجات التي تستهدف وظيفة الميتوكوندريا في علم الأحياء الأوعية الدموية.

وقد استخدمت الميتوكوندريا المعزولة لقياس وظيفة الطاقة البيولوجية. لدينا 7 وغيرها 11 وأفادت تقديرات الطاقة الحيوية الخلوية في الخلايا CVE سليمة باستخدام bioanalyzer تدفق خارج الخلية. يوفر محلل الاستفادة من تقييم الطاقة البيولوجية الخلوية الذاتية. هذا الاختبار حساس ويتفق يقيس استقلاب الميتوكوندريا من خلايا CVE، ويمكن استخدامها لتقييم ضعف الطاقة البيولوجية من الأمراض المنقولة جنسياالمولى، والتحقيق في آليات مسارات الإشارات الميتوكوندريا، والمخدرات الشاشة أو العلاجات التي تؤثر على وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا CVE. يتم تسجيل معدل الأكسجين استهلاك (OCR) من قبل bioanalyzer باستخدام نهج التنميط الدوائية من خلال الجمع بين استخدام أربعة اختلال الميتوكوندريا: أوليغوميسين، الكربونيل السيانيد-4 (trifluoromethoxy) فينيل هيدرازون (FCCP)، روتينون، وantimycin A. في هذا البروتوكول، نحن بالتفصيل النهج الأمثل الذي يسمح للقياس وحساب المعلمات الوظيفية الميتوكوندريا في الخلايا CVE، بما في ذلك التنفس القاعدية الميتوكوندريا، إنتاج ATP، تسرب بروتون، التنفس القصوى، وقدرة الجهاز التنفسي الغيار، في فحص واحد.

Protocol

ملاحظة: يتم عرض مخطط البروتوكول في الشكل 1، بما في ذلك جدول زمني للإجراءات.

1. الثقافة ومرور خلايا CVE

  1. ثقافة الخلايا CVE (خلايا bEnd.3) في متوسطة النمو الكامل (ارتفاع مستوى السكر في Dulbecco لتعديل النسر متوسطة، وDMEM) تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين في T75 سم 2 الأنسجة قارورة الثقافة. ينمو بمعدل 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
  2. إزالة والتخلص من مستنبت الخلية. شطف طبقة الخلايا مع 0.25٪ التربسين، 0.03٪ محلول EDTA، ثم قم بإضافة 1-2 مل من محلول التربسين-EDTA إلى القارورة والحفاظ على قارورة عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقيقة. مراقبة الخلايا تحت مجهر مقلوب حتى يتم فصل طبقة الخلايا. إضافة 10 مل من متوسط ​​النمو الكامل ونضح الخلايا عن طريق pipetting بلطف.
  3. صب السوائل والخلايا في أنبوب الطرد المركزي 15 مل وتدور في 700 x ج لمدة 5 دقائق لإزالة الحطام الخلوي.
  4. تجاهل طاف من أنبوب الطرد المركزي. إضافة 10 مل من متوسط ​​النمو الكامل وإعادة تعليق بيليه الخلية. تدور الخلايا في 700 x ج لمدة 5 دقائق.
  5. تجاهل طاف من أنبوب الطرد المركزي. إعادة تعليق بيليه خلية في المتوسط النمو الكامل في تركيز 2.0 × 10 5 خلية / مل (يحددها العد باستخدام عدادة الكريات، استبعاد الخلايا الميتة عن طريق تلطيخ التريبان الأزرق).
    ملاحظة: الخلايا إذابة طازجة، هي شبه مثقف لا يقل عن 3 ممرات للتجارب.

2. البذور وعلاج الخلايا على لوحات زراعة الخلايا

  1. خلايا البذور على التمويه لوحة الثقافة خلية خارج الخلية 96-جيدا: 80 ميكرولتر / جيد. وضع لوحة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة. ملاحظة: 16 × 10 3 خلايا لكل بئر تصل إلى 60-80٪ confluency خلال 24 ساعة.
  2. إذا تم التعرض للخلايا لمادة كيميائية، إضافة العلاج مرة واحدة هي التي تعلق على الخلايا إلى أسفل لوحة (8-24 ساعة بعد رؤيةدينغ).
    ملاحظة: للحصول على تجارب ترنسفكأيشن، لا إضافة المضادات الحيوية في وسط النمو الكامل.

3. تقييم الميتوكوندريا وظيفة باستخدام Bioanalyzer

  1. قبل بدء الفحص، هيدرات وخارج الخلية تدفق خرطوشة الاستشعار مع calibrant بإضافة 150 ميكرولتر من خارج الخلية تدفق calibrant حل لوحة واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية دون CO 2.
  2. باستخدام محطة غسالة لوحة، وتغيير مستنبت الخلية إلى 7.0 درجة الحموضة خارج الخلية تدفق مقايسة المتوسطة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية دون CO 2 ل30-60 دقيقة.
  3. إعداد حلول العمل من 8 أوليغوميسين ميكرومتر، 4.5 ميكرومتر FCCP، 10 روتينون ميكرومتر، و 10 ميكرومتر أنتيمايسين إيه في DMEM. تحميل 25 ميكرولتر من الحلول الأسهم في خرطوشة الموانئ حقن: ميناء A، أوليغوميسين. ميناء B، FCCP. ميناء C، روتينون وأنتيمايسين إيه مع الخلية المتوسطة فحص التدفق. تنفيذ بروتوكول الفحص كما هو موضح في الجدول رقم 1.
  4. تحميل خرطوشة المائية في bioanalyzer وإجراء المعايرة عن طريق النقر على زر "ابدأ". بعد معايرة كاملة، وإزالة لوحة أسفل خرطوشة وتحميل لوحة الخلية عن طريق النقر على "إلغاء تحميل خرطوشة" موجه. مواصلة الفحص حتى نهاية جميع القياسات.
  5. فتح ملف البيانات والحصول على قيم معدل من bioanalyzer. تصدير البيانات إلى ملف البيانات.

4. تحليل البيانات

ملاحظة: تصاغ الحسابات لتحليل البيانات أدناه. ويتم الحصول على القيم من الصك bioanalyzer كما قدم التعرف الضوئي على الحروف في الشكل 2.

  1. لحساب التنفس القاعدية، وطرح التنفس غير الميتوكوندريا (القياسات 10-12) من القيمة القاعدية (قياس 3).
    ملاحظة: التنفس القاعدية = بصل - التنفس غير الميتوكوندريا = معدل ③ - معدل ⑩ ~ ⑫.
  2. لحساب producti لاعبي التنس المحترفينعلى، وطرح التنفس المرتبطة ATP (القياسات 4-6) من القيمة القاعدية (قياس 3).
    ملاحظة: إنتاج ATP = بصل - ATP المرتبطة التنفس = معدل ③ - معدل ④ ~ ⑥.
  3. لحساب التنفس القصوى، وطرح التنفس غير الميتوكوندريا (القياسات 10-12) من التنفس الحد الأقصى (القياسات 7-9).
    ملاحظة: التنفس القصوى = التنفس الحد الأقصى - غير الميتوكوندريا التنفس = معدل ⑦ ~ ⑨ - معدل ⑩ ~ ⑫.
  4. لحساب قدرة احتياطية، طرح القيمة القاعدية (قياس 3) من التنفس الحد الأقصى (القياسات 7-9).
    ملاحظة: القدرة الانتاجية الاحتياطية = التنفس الحد الأقصى - بصل = معدل ⑦ ~ ⑨ - معدل ③.
  5. لحساب بروتون تسرب، طرح التنفس غير الميتوكوندريا (قياس 10-12) من التنفس المرتبطة ATP (قياس 4).
    ملاحظة: بروتون تسرب = المرتبطة ATP التنفس - عدم الميتوكوندريا،ل التنفس = معدل ④ - معدل ⑩ ~ ⑫.

النتائج

لتقييم وظيفة الطاقة البيولوجية للخلايا CVE ردا على الاكسدة، اخترنا الفئران الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ خط الخلية بطائن bEnd.3، الذي يعرض نفس الخصائص حاجز المقارنة نتيجة الابتدائية الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ الخلايا البطانية 12. وبالنظر إلى أن وتتنوع حركية وكثافة النسبية للاستجابة بين أنواع الخلايا المختلفة، وقد صممت السلسلة الأولى من التجارب للحصول على مستويات OCR يمكن قياسها عن طريق تحديد العدد الأمثل من الخلايا bEnd.3 لاستخدامها في فحص لتحديد ملامح التمثيل الغذائي، كما هو موضح في الشكل 2. وبعد التقييم، يتم قياس كميات البيانات وعرضها في الشكل (3). التنفس القاعدية، والتنفس القصوى، وأظهر قدرة الجهاز التنفسي الغيار ردا متناسبا مع كثافة الخلية. ومع ذلك، انخفض إنتاج ATP عندما تم اختيار 64 × 10 3 خلايا لكل بئر، مما يشير إلى أن زراعة الخلايا الإفراط في متموجة هيلا تصلح لهذه التجربة. تحدث كثافة الخلية المثلى بين 8-32 × 10 3 خلايا لكل بئر، استنادا إلى استجابة إلى اختلال الميتوكوندريا.

لتجارب لاحقة، تم استخدام كثافة البذر من 16 × 10 3 خلايا لكل بئر للسماح للكشف عن الأمثل للتغيرات في التعرف الضوئي على الحروف. باستخدام 16 × 10 3 خلايا لكل بئر، لاحظنا ردود المتوقع في التعرف الضوئي على الحروف وأثبتت أن الرنا الميكروي مير 34A يقلل من وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا CVE (الشكل 4). لقد ذكرت سابقا أن مير 34A خفض الفسفرة التأكسدية في هذه الخلايا 13. وأظهرت التجارب المتكررة أيضا أن التنفس القصوى والطاقة الانتاجية الفائضة تراجع بشكل كبير من قبل overexpression من مير 34A في CVEs في 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن، على الرغم من أن التنفس القاعدية، إنتاج ATP، وتسرب بروتون ليس لديه تغييرات كبيرة (الشكل 4) . هذه البياناتإظهار حساسية bioanalyzer للكشف عن تغيرات في وظيفة الميتوكوندريا في CVEs.

figure-results-2033
الشكل 1. التخطيط الاستراتيجي للتجربة. الجدول الزمني للخلية، لوحة، ويشار إعداد خرطوشة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2449
تم قياس الشكل 2. الممثل بيانات أولية من وظيفة الطاقة البيولوجية في خلايا CVE مع كثافات مختلفة خلية معدلات استهلاك الأكسجين في خلايا CVE مع كثافة مختلفة من الخلايا. البيانات تمثل يعني ± SD (ن = 5)؛ التعرف الضوئي على الحروف: الأوكسجين معدل استهلاك. FCCP: الكربونيل السيانيد-4- (trifluoromethoxy) فينيل هيدرازون. تعفن / نظام مضاد للA: روتينون وantimycin A. ①، ②، و③ تشير التنفس القاعدية. ④، ⑤، و⑥ تشير إلى ATP المرتبطة التنفس. ⑦، ⑧، و⑨ تشير إلى الحد الأقصى التنفس. ⑩، ⑪، و⑫ تشير التنفس غير الميتوكوندريا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3289
يتم احتساب الرقم 3. ممثل النتائج من وظيفة الطاقة البيولوجية في خلايا CVE مع كثافات خلية مختلفة. التنفس القاعدية، إنتاج ATP، والتنفس القصوى، والقدرة الاحتياطية من البيانات الخام الناتجة عن الطاقة الحيوية فحص وظيفي في الشكل 2 باستخدام الصيغ أشار في القسم 4 . تمثل البيانات يعني ± SD (ن = 5)؛ التعرف الضوئي على الحروف: الأوكسجين معدل استهلاك. و = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig3large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3981
الشكل 4: ممثل النتائج من انخفاض وظيفة الطاقة البيولوجية من قبل مير 34A (A) البيانات الخام من الميتوكوندريا الدالة التالية overexpression من مير 34A في 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن. وتحسب (B) التنفس القاعدية، إنتاج ATP، والتنفس القصوى، والقدرة الاحتياطية من البيانات الخام الناتجة عن الطاقة الحيوية فحص وظيفي في الشكل 4A. وتحسب المعلمات من الصيغ المشار إليها في المادة 4. overexpression من مير 34A يقلل من وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا CVE في 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن. البيانات تمثل يعني ± SD (ن = 5)؛ التعرف الضوئي على الحروف: الأوكسجين معدل استهلاك. ****، P <0.0001.ملفات / ftp_upload / 54847 / 54847fig4large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4915
الجدول 1. بروتوكول تشغيل الآلات.

Discussion

ويمثل هذا البروتوكول وسيلة لتقييم النمط الظاهري الطاقة البيولوجية في خلايا بطانة الأوعية الدموية الدماغية. وهو بمثابة فحص أساسي لتقييم الميتوكوندريا الخلايا البطانية، وأنه هو الأمثل للتجارب تهدف إلى تحقيق آليات المحفزات التي قد تؤثر على مسار الإشارات الميتوكوندريا في الخلايا CVE. كما أنه يوفر طريقة لاختبار العلاجات المحتملة لأمراض المرتبطة BBB-اضطراب.

خطوات حاسمة في إطار بروتوكول

bioanalyzers تدفق خارج الخلية لديها القدرة على قياس التعرف الضوئي على الحروف في الوقت الحقيقي. في هذا الاختبار، وتحديد كثافة الخلية المناسبة أمر بالغ الأهمية. إذا كانت كثافة الخلية أقل من 8 × 10 3 خلايا لكل بئر، والتعرف الضوئي على الحروف القاعدية منخفضة جدا بحيث لا يمكن تحليلها (الشكل 2) والشكل (3)؛ إذا كانت كثافة الخلية فوق 32 × 10 3 خلايا لكل بئر، فإن الخلايا لا تستجيب للأوليغوميسين أو FCCP محطات الصرف الصحياليلة (الشكل 2 والشكل 3). كثافة الخلية المثلى لهذا الخط خلية في نموذج تجريبي لدينا هو 16 × 10 3 خلايا لكل بئر، والذي يدل على النتائج قابلة للتكرار وحساسية للمحفزات 7 والعلاجات 10،14. إذا تم استخدام bioanalyzer 24-جيدا، معايرات جديدة من كثافة الخلايا ستكون هناك حاجة لفحص.

تم توثيقه أن CVEs ديك كمية كبيرة من الميتوكوندريا مقارنة مع الخلايا البطانية أخرى أو أنواع الأنسجة 15،16، مما يشير إلى الحاجة إلى زيادة إنتاج الطاقة وأقل من الخلايا لقياس الطاقة الحيوية الأيض. اختبرناها عدة أنواع من الخلايا البطانية الدماغ، مثل الابتدائية وخلدت الفئران الخلايا البطانية الدماغية 7 و خلدت الخلايا البطانية الدماغية البشرية (بيانات غير منشورة). هذه الخلايا المطلوبة كثافة خلية مماثلة للوصول إلى مقبول التعرف الضوئي على الحروف (OCR التنفس القاعدية داخل 40-160 بمول / دقيقة للوحات 96-جيدا و50-400 بمول / دقيقة لمدة 24 لوحات أيضا) عندما تم إجراء فحص الطاقة الحيوية. Kaczara وآخرون. وذكرت قياس استقلاب الطاقة البيولوجية في السرة المنوال الخلايا البطانية الإنسان (HUVEC)، والتي تستخدم أعلى كثافة الخلية 17.

لم مجموعتنا يتم تقييم الخلايا سفينة من الأنسجة أو الأعضاء الأخرى. من الناحية النظرية، وbioanalyzer يحتمل أن تستخدم في أي نوع من الخلايا، ولكنه يتطلب تحقيق الاستفادة المثلى من فحص لكثافة الخلايا، خلية ثقافة المتوسط، والظروف والثقافة (قد تتطلب بعض خلايا معينة لوحات مغلفة لتنمو بشكل جيد). كان المطلوب أن يتم الانتهاء من التجارب للتأكد من معدل OCR ضمن النطاق المقبول. إذا كان التعرف الضوئي على الحروف في الخلايا البطانية من الأجهزة الأخرى هي أقل من CVEs من العقول، وزيادة كثافة الخلايا يمكن أن تساعد على الحصول في غضون مجموعة OCR مقبول. بدلا من ذلك، إذا كانت الخلايا لا تستخدم الفسفرة التأكسدية كمصدر رئيسي للطاقة، وbioanalyzer لن يكون أوبتيمال فحص.

وbioanalyzer يسمح لتعطيل متتابعة من سلسلة نقل الإلكترون، استنادا إلى الترتيب الذي يتم تطبيق الكواشف. أولا، يتم تطبيق أوليغوميسين، مما يعوق الخامس مجمع الميتوكوندريا (ATP سينسيز). ثانيا، FCCP، وهو uncoupler الإلكترون، يتم تطبيق، الأمر الذي يؤدي إلى اختلال تدرج البروتونات. وأخيرا، روتينون وأنتيمايسين إيه، التي تمنع الميتوكوندريا المجمعات الأول والثالث على التوالي، وتطبق أن يؤدي إلى تثبيط الكلي للتدفق الإلكترونات. ترتيب التعرض للمخدرات ضروري لأن المخدرات عرقلة نقل الإلكترون ردة فعل معينة سلسلة، ويمكن قياس التغييرات متتابعة لتعكس وظيفة الميتوكوندريا.

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

لتقييم استجابة الميتوكوندريا إلى المحفزات في الخلايا CVE، فمن المستحسن أن يتم تطبيق محفزات لخلايا بعد الالتزام الخلايا إلى أسفل لوحة زراعة الخلايا (انظر الجدول الزمنيهو مبين في الشكل 1؛ انها عادة ما يستغرق 6 ساعة على الأقل). للحصول على نتائج قابلة للتكرار من العلاج، من المهم للغاية للحفاظ على كثافة الخلية متسقة. إذا صممت المعالجة المسبقة قبل البذر الخلية، وكثافة الخلايا لكل مرحلة ما قبل المعالجة يجب أن تقاس بدقة، باستثناء الخلايا الميتة عن البذر. إذا تم تضمين ترنسفكأيشن في التصميم التجريبي، الرجوع إلى بروتوكول ترنسفكأيشن الشركة المصنعة. موضح في البيانات المقدمة في الشكل (4)، وكان transfected مير 34A إلى خلايا CVE استخدام عدة lipofectamine ترنسفكأيشن، الأمر الذي يتطلب مستنبت الخلية خالية من المضادات الحيوية واختبار ميتو من التوتر لتقييم التغيرات في وظيفة التمثيل الغذائي مع overexpression من مير 34A . ويمكن أيضا أن يكون الأمثل الجرعات البلازميد، كما نشرت سابقا (13). تغيير آخر التي يمكن إدخالها على بروتوكول يتغير تركيزات المواد الكيميائية. منحنى المعايرة من أوليغوميسين، FCCP، و / أو روتينون وأنتيمايسين إيه يمكن أن يكون COMPLEتيد.

وبالإضافة إلى ذلك، إذا كان هذا الفحص يستخدم لإنتاجية عالية ويحلل من مختلف انواع المخدرات، ويقترح لتشمل فحص مواز لقياس بقاء الخلية وتكاثر الخلايا، والتي وصفت في المنشورات السابقة لدينا 7،13. تتأثر القيم التعرف الضوئي على الحروف بشكل كبير من عدد الخلايا (الشكلان 2 و 3)، وفحوصات تكاثر الخلايا وقدرتها على البقاء تستفيد تطبيع البيانات. ومع ذلك، والانتهاء من هذه القياسات ليست في تقدير كل مختبر الفردية.

القيود المفروضة على تقنية

الحد الأكبر من هذا البروتوكول هو أننا تستخدم فقط في المختبر نموذج الثقافة خلية في الدراسة. حاليا، لا توجد خارج الحي النماذج المتاحة أو النماذج الحيوانية التي يمكن أن تعالج الخلايا البطانية وظيفة الميتوكوندريا. ومن المتوقع أن يتم تطويرها لتقييم وظيفة الطاقة البيولوجية في الجسم الحي نماذج جديدة و خارج الحي في الدراسات المستقبلية.

الحد الآخر هو امتداد لتقييم حاجز التالية التدابير الطاقة الحيوية. لا يمكن إجراء التجارب لأنه، أولا، وبعد الانتهاء من القياسات الطاقة البيولوجية، وقللت من بقاء الخلية بعد تعطل كامل لسلسلة نقل الإلكترون. ثانيا، هناك حاجة لوحات وإدراج ثقافة خلية محددة للكشف عن القيم الطاقة الحيوية ولا تناسب إدراجات لتقييم الحاجز. لذلك، ليس هناك العديد من المقايسات الفنية التي يمكن أن يتم الانتهاء بعد الفحص الطاقة الحيوية. ومع ذلك، فإنه من المتوقع أن الأجهزة الخاصة يمكن تطويرها لأداء المقايسات الفنية السابقة للفحص الطاقة الحيوية.

أهمية تقنية مع الاحترام لالحالية / الطرق البديلة

التقنيات السابقة لتقييم وظيفة الميتوكوندريا اقتضت عزل الميتوكوندريا من الخلايا 18. هذا نيتقنية ث باستخدام bioanalyzer تسمح لقياس النشاط الميتوكوندريا في خلايا سليمة، الذي يحفظ أكثر من البيئة الخلوية من تقييم الميتوكوندريا المعزولة.

التطبيقات المستقبلية أو الاتجاهات بعد اتقان هذه التقنية

تم تصميم هذا البروتوكول وضعت للخط الخلوي bEnd.3، وإنما هو أيضا متوافقة مع الأولية الدماغية البطانية الوعائية (pCVE) خلايا 7 أو غيرها من البطانة، ولقد أثبتنا هذا في المنشور السابق لدينا باستخدام خلايا pCVE 7. عندما يتم استخدام أنواع أخرى من البطانة، قد تكون هناك حاجة لطلاء لوحة الثقافة واستخدام عوامل النمو. ومع ذلك، فمن المستحسن فحص المعايرة لأنواع الخلايا الأخرى كذلك. يوفر هذا البروتوكول طريقة عامة ليتم اعتمادها في تقييم الطاقة الحيوية من خلايا CVE، وأنه يمكن مواصلة تطبيقها على دراسات آلية أو الاستجابات العلاجية في هذه الطريقة.

Disclosures

The authors declare no potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article. Open Access fees for this article were provided by Agilent Technologies.

Acknowledgements

This work was supported by the following grants: AHA 16SDG31170008 to X.R. and NIH P20 GM109098, P01 AG027956, and U54 GM104942 to J.W.S.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
bEnd.3 cell lineATCCCRL-229925 - 30 passages
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)ATCC30-2002
Fetal Bovine SerumAtlanta BiologicalsS1245010% final concentration
Penicillin/SteptomycinHycloneSV300101×100 stocking
0.25% trypsin, 0.03% EDTA solutionCorning25-053-CI
Sodium pyruvateCorning25-000-CI1.0 µM final concentration
GlucoseSigmaCAS 50-99-725 mM final concentration
OligomycinSigmaO48761.0 µM final concentration
Carbonilcyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)SigmaC29200.5 µM final concentration
RotenoneSigmaR88751.0 µM final concentration
Antimycin ASigmaCAS 1397-94-01.0 µM final concentration
Plate wash stationSeahorse Bioscience
Extracellular flux bioanayzer  Seahorse BioscienceXFe96
Extracellular flux cell culture plateSeahorse Bioscience102416-100
Extracellular flux sensor cartridgeSeahorse Bioscience102416-100
Extracellular flux calibrant solutionSeahorse Bioscience100840-000
Extracellular flux assay mediumSeahorse Bioscience102365-100PH buffered prior to assay

References

  1. Quintero, M., Colombo, S. L., Godfrey, A., Moncada, S. Mitochondria as signaling organelles in the vascular endothelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 5379-5384 (2006).
  2. Liu, Y., Li, H., Bubolz, A. H., Zhang, D. X., Gutterman, D. D. Endothelial cytoskeletal elements are critical for flow-mediated dilation in human coronary arterioles. Med Biol Eng Comput. 46, 469-478 (2008).
  3. Al-Mehdi, A. B., et al. Perinuclear mitochondrial clustering creates an oxidant-rich nuclear domain required for hypoxia-induced transcription. Sci Signal. 5, ra47 (2012).
  4. Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. [Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release. J Biol Chem. 280, 715-721 (2005).
  5. Sutendra, G., et al. The role of Nogo and the mitochondria-endoplasmic reticulum unit in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 3, 88ra55 (2011).
  6. Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11960-11965 (2009).
  7. Doll, D. N., et al. Mitochondrial crisis in cerebrovascular endothelial cells opens the blood-brain barrier. Stroke. 46, 1681-1689 (2015).
  8. Ren, X., Simpkins, J. W. Deciphering the Blood-Brain Barrier Damage in Stroke: Mitochondrial Mechanism. J Neuroinfect Dis. S2, e002 (2015).
  9. Pun, P. B., Lu, J., Moochhala, S. Involvement of ROS in BBB dysfunction. Free Radic Res. 43, 348-364 (2009).
  10. Sun, J., Hu, H., Ren, X., Simpkins, J. W. Tert-butylhydroquinone compromises survival in murine experimental stroke. Neurotoxicol Teratol. 54, 15-21 (2016).
  11. Modis, K., et al. Cellular bioenergetics is regulated by PARP1 under resting conditions and during oxidative stress. Biochem Pharmacol. 83, 633-643 (2012).
  12. Brown, R. C., Morris, A. P., O'Neil, R. G. Tight junction protein expression and barrier properties of immortalized mouse brain microvessel endothelial cells. Brain Res. 1130, 17-30 (2007).
  13. Bukeirat, M., et al. MiR-34a regulates blood-brain barrier permeability and mitochondrial function by targeting cytochrome c. J Cereb Blood Flow Metab. 36, 387-392 (2016).
  14. Hu, H., et al. Mitochondrial Impairment in Cerebrovascular Endothelial Cells is Involved in the Correlation between Body Temperature and Stroke Severity. Aging Dis. 7, 14-27 (2016).
  15. Oldendorf, W. H., Cornford, M. E., Brown, W. J. The large apparent work capability of the blood-brain barrier: a study of the mitochondrial content of capillary endothelial cells in brain and other tissues of the rat. Ann Neurol. 1, 409-417 (1977).
  16. Oldendorf, W. H., Brown, W. J. Greater number of capillary endothelial cell mitochondria in brain than in muscle. Proc Soc Exp Biol Med. 149, 736-738 (1975).
  17. Kaczara, P., et al. Carbon monoxide released by CORM-401 uncouples mitochondrial respiration and inhibits glycolysis in endothelial cells: A role for mitoBKCa channels. Biochim Biophys Acta. 1847, 1297-1309 (2015).
  18. Bharadwaj, M. S., et al. Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy. J Vis Exp. (96), e52350 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

117 Bioanalyzer

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved