JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

המיטוכונדריה תא האנדותל היא קריטית כדי לשמור על שלמות דם-מוח-מכשול. אנחנו מציגים את פרוטוקול למדידת תפקוד bioenergetic בתאי האנדותל של כלי דם מוחיים.

Abstract

היושרה של מחסום הדם-מוח-המכשול (BBB) ​​היא קריטית כדי למנוע פגיעה מוחית. האנדותל של כלי דם במוח (CVE) תאים הם אחד מסוגי התאים המרכיבים את BBB; יש תאים אלה דרישת אנרגיה גבוהה מאוד, מחייב במיטוכונדריה אופטימלי. במקרה של מחלה או פציעה, הפונקציה של המיטוכונדריה בתאים אלה ניתן לשנות, כאשר התוצאה היא מחלת או פתיחת BBB. בכתב היד הזה, אנו מציגים שיטה למדידת תפקוד המיטוכונדריה בתאים CVE באמצעות כולו, תאים שלמים וכן bioanalyzer. Assay Mito-מתח משמש לקרוא תיגר על התאים שעברו מוטרד, או פיזי או כימי, ולהעריך פונקצית bioenergetic שלהם. בנוסף, שיטה זו גם מספקת דרך יעילה להקרין רפויים חדשים בעלי השפעות ישירות על תפקוד המיטוכונדריה. יש לנו אופטימיזציה צפיפות התאים הדרושה כדי להניב שיעורי צריכת חמצן המאפשרים החישוב של מגוון רחב של פסק המיטוכונדריהמטרים, כולל ייצור ATP, נשימה מקסימלי, ואת לקיבולת. אנחנו גם להראות את הרגישות של assay על ידי הוכחה כי כניסתה של microRNA, miR-34a, מוביל לירידה בולטת לזיהוי בפעילות המיטוכונדריה. בעוד הנתונים המוצגים במאמר זה הוא אופטימיזציה עבור הקו הסלולרי bEnd.3, יש לנו גם מותאם הפרוטוקול עבור תאי CVE עיקריים, דבר המחזק את התועלת במודלים פרה-קליניים וקליניים.

Introduction

זה זוכה להכרה רחבה כי מחסום דם-מוח (BBB) ​​שהוקמה על ידי האנדותל של כלי הדם המוחיים (CVE) תאים יש מאוד מובחנת וייחודית פונקציות עליונה לביולוגיה וסקולרית. תאי אנדותל אלה להשתמש המיטוכונדריה לייצר את רוב אספקת הסלולר של אדנוזין אדנוזין (ATP) כמקור אנרגיה כימית. בנוסף לאספקת ATP עבור התאים CVE, המיטוכונדריה לווסת תהליכים תאיים שונים בתאי האנדותל של כלי הדם, כגון הסלולר איתות 1-4, אפופטוזיס 5, ובקרה על מחזור התא וצמיחה 6 תאים. Dysregulation של הפונקציה bioenergetic המיטוכונדריה בתאים CVE עשוי להשפיע biogenesis המיטוכונדריה, המוביל פעילות האנדותל של כלי דם פגומה וכן להחמיר מחלות כלי דם במוח והפרעות ניווניות, כגון שבץ 7,8 ומחלת אלצהיימר (AD) 9. אנחנו הוכחנו כי עלבונות לתאי CVE בעקבות חשיפת lipopolysaccharide (LPS) לפגוע בתפקוד המיטוכונדריה בתאים CVE ולהחמיר שבץ ותוצאות 7. טרט-butylhydroquinone (TBHQ) מגביר תמותה משבץ ידי הפרעה זרחון חמצוני בתאים CVE 10. לכן, המודל הכמותי של פונקציה bioenergetic בתאים CVE לא רק טייסים סדרת מחקרים הקשורים מנגנון מערכת העצבים המרכזית (CNS) מחלות, אלא גם מספק פריצת דרך ההקרנה סמים תרופות מיקוד במיטוכונדריה בביולוגיה וסקולרית.

המיטוכונדריה מבודד שמש כדי למדוד את תפקוד bioenergetic. אנחנו 7 ואחרים 11 דיווחנו הערכות של bioenergetics הסלולר בתאי CVE שלמים באמצעות bioanalyzer שטף תאי. המנתח מספק את היתרון של ערכת bioenergetic הסלולר אנדוגני. assay רגיש ועקבי זה מודד את מטבוליזם במיטוכונדריה של תאים CVE וניתן להשתמש בו כדי להעריך ירידת ערך bioenergetic ידי stiמולי, לחקור את המנגנונים של מסלולי איתות המיטוכונדריה, וסמי מסך או טיפולים המשפיעים על תפקוד המיטוכונדריה בתאי CVE. שיעור צריכת החמצן (OCR) נרשם על ידי bioanalyzer באמצעות גישה פרופיל תרופתי על ידי שילוב השימוש ארבעה משבשים המיטוכונדריה: oligomycin, קרבוניל ציאניד-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), rotenone, וא antimycin בפרוטוקול זה, פרטו לנו גישת אופטימיזציה המאפשרת למדידה וחישוב פרמטרים תפקודיים המיטוכונדריה בתאי CVE, כוללים נשימה המיטוכונדריאלי בסיס, ייצור ATP, דליפת פרוטון, נשימה מקסימלי, וקיבולת נשימת חילוף, ב assay אחד.

Protocol

הערה: התכנית של הפרוטוקול מוצגת באיור 1, לרבות לוח זמנים של הנהלים.

1. התרבות מעבר של תאים CVE

  1. תרבות תאי CVE (תאי bEnd.3) במדיום גידול מלא (גלוקוז גבוהה הבינוני של הנשר השונה של Dulbecco, DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין בתוך בקבוק תרבות 2 רקמות T75 סנטימטר. לגדול ב 37 מעלות צלזיוס חממה 2 5% CO.
  2. סר וזורק את תרבית תאים בינונית. יש לשטוף את שכבת התאים עם פתרון EDTA 0.25% טריפסין-0.03%, ולאחר מכן להוסיף 1 - 2 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA אל הבקבוק ולשמור את הבקבוק על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 - 5 דקות. שים את התאים תחת מיקרוסקופ הפוכה עד שכבת התאים מנותקת. הוסף 10 מ"ל של מדיום הגידול להשלים לשאוב את התאים על ידי pipetting בעדינות.
  3. למזוג נוזל ותאים לתוך צינור ספין צנטריפוגות 15 מ"ל ב 700 XG במשך 5 דקות כדי להסיר פסולת הסלולר.
  4. בטל supernatant מצינור צנטריפוגות. הוסף 10 מ"ל של מדיום הגידול להשלים מחדש להשעות את התא גלולה. ספין התאים ב XG 700 במשך 5 דקות.
  5. בטל supernatant מצינור צנטריפוגות. Re- להשעות את התא גלולה במדיום הגידול להשלים בריכוז של 2.0 × 10 5 תאים / מ"ל (נקבע על ידי ספירת באמצעות hemocytometer; לכלול תאים מתים על ידי מכתים Trypan כחול).
    הערה: תאים מופשרים טרי הם תת תרבות לפחות 3 קטעים לניסויים.

2. זרע ולטפל תאים על צלחות תרבית תאים

  1. תאי זרע על צלחת תרבית תאי שטף תאית 96-היטב: 80 μL / טוב. מניחים את צלחת תרבית תאים על 37 מעלות צלזיוס חממה 2 5% CO. הערה: 16 × 10 3 תאים לכל גם יגיעו 60 - 80% confluency בתוך 24 שעות.
  2. אם התאים נחשפים כימיקל, להוסיף הטיפולים פעם התאים מצורפים בתחתית הצלחת (8 - 24 שעות לאחר לראותדינג).
    הערה: בניסויים transfection, אל תוסיף אנטיביוטיקה במדיום הגידול להשלים.

הערכה 3. פונקציה מיטוכונדריאלי באמצעות Bioanalyzer

  1. לפני תחילת assay, מימה מחסנית חיישן שטף תאית עם calibrant על ידי הוספת 150 μL של תאי שטף calibrant פתרון לצלחת דוגרי O / N ב 37 מעלות צלזיוס ללא CO 2.
  2. באמצעות תחנת מכונת כביסת הצלחת, לשנות את מדיום תרבית תאים לתוך pH 7.0 בינוני assay שטף תאיים. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס ללא CO 2 למשך 30 - דקות 60.
  3. הכינו פתרונות עבודה של 8 מיקרומטר oligomycin, 4.5 מיקרומטר FCCP, 10 rotenone מיקרומטר, ו -10 מיקרומטר antimycin DMEM. טען 25 μL של פתרונות מניות לתוך יציאות הזרקה מחסנית: נמל A, oligomycin; נמל B, FCCP; נמל C, rotenone ו- A antimycin עם מדיום assay שטף תאי. הטמע את פרוטוקול assay כמתואר בטבלה 1.
  4. טען את המחסנית hydrated לתוך bioanalyzer ולבצע כיול על ידי לחיצה על כפתור "התחל". לאחר הכיול יושלם, להסיר את הצלחת התחתונה המחסנית ולטעון צלחת התא על ידי לחיצה על פקודת "ביטול טעינת המחסנית". המשך assay עד סוף כל המדידות.
  5. פתח את קובץ הנתונים ולקבל את ערכי שיעור מן bioanalyzer. לייצא את הנתונים לקובץ גיליון אלקטרוני.

4. ניתוח נתונים

הערה: החישובים עבור ניתוחי נתונים מנוסחים להלן. הערכים מתקבלים מכשיר bioanalyzer כמו OCR המוצג באיור 2.

  1. כדי לחשב נשימה בסל, להפחית את הנשימה הלא המיטוכונדריה (מדידות 10 - 12) מהערך הבסיסי (מדידה 3).
    הערה: נשימה Basal = Basal - הלא המיטוכונדריה הנשימה = דרג ③ - שיעור ⑩ ~ ⑫.
  2. כדי לחשב producti ATPעל, להפחית את הנשימה הצמודה ATP (מדידות 4 - 6) מהערך הבסיסי (מדידה 3).
    הערה: ייצור ATP = Basal - צמוד ATP נשימה = דרג ③ - שיעור ④ ~ ⑥.
  3. כדי לחשב נשימה מקסימלי, להפחית את הנשימה הלא המיטוכונדריה (מדידות 10 - 12) מן הנשימה המקסימלי (מדידות 7 - 9).
    הערה: נשימה מרבית = נשימה מקסימלי - הלא המיטוכונדריה נשימה = דרג ⑦ ~ ⑨ - שיעור ⑩ ~ ⑫.
  4. כדי לחשב את קיבולת חילוף, לחסר הערך הבסיסי (מדידת 3) מן הנשימה המקסימלי (מדידות 7 - 9).
    הערה: לקיבולת = הנשימה מקסימלי - Basal = דרג ⑦ ~ ⑨ - שיעור ③.
  5. כדי לחשב דליפת פרוטון, להפחית את הנשימה הלא המיטוכונדריה (מדידת 10 - 12) מן הנשימה הצמודה ATP (מדידת 4).
    הערה: דליפת פרוטון = נשימה צמודה ATP - הלא המיטוכונדריהl הנשימה = דרג ④ - שיעור ⑩ ~ ⑫.

תוצאות

כדי להעריך את תפקוד bioenergetic של תאים CVE בתגובה סטרס חמצוני, בחרנו הקו הסלולרי endothelia murine המוח כלי הדם bEnd.3, המציג אותם מאפיינים מחסום ההשוואה ליום לתאי אנדותל כלי הדם במוח העיקרי 12. בהתחשב בכך קינטיקה ואת העוצמת יחסי של תגובה הן מגוונים בין סוגי התאים השונים, סדרת הניסויים הראשונה נועדו להשיג רמות OCR למדידה על ידי זיהוי המספר האופטימלי של תאי bEnd.3 להשתמש ב assay על פרופיל מטבולים, המוצג איור 2. בעקבות ההערכה, הנתונים הם לכמת והציגו באיור 3. נשימה בסל, נשימה מקסימלי, וקיבולת נשימת חילוף הראתה תגובה מידתית עם צפיפות תאים. עם זאת, ייצור ATP ירד כאשר 64 × 10 3 תאים לכל טוב נבחרו, דבר המצביע על כך תרבית תאים על-ומחוברות הואלא מתאים לניסוי זה. הצפיפויות האופטימליות התא להתרחש בין 8 - 32 × 10 3 תאים לכל טוב, מבוסס על בתגובת משבשים המיטוכונדריה.

בניסויים הבאים, צפיפות זריעה של 16 × 10 3 תאים לכל גם שמשה כדי לאפשר זיהוי אופטימלי של שינויי OCR. באמצעות 16 × 10 3 תאים לכל טוב, צפינו את התגובות הצפויות OCR והוכיח כי-34a miR microRNA מפחית במיטוכונדריה בתאים CVE (איור 4). יש לנו דיווח בעבר כי miR-34a מופחת זרחון חמצוני בתאים אלה 13. הניסויים חוזרים גם הראו כי נשימה מקסימלי לקיבולת ירדו באופן משמעותי על ידי ביטוי היתר של miR-34a ב CVEs ב 24 שעות שלאחר transfection, למרות הנשימה הבסיסית, ייצור ATP, ו דליפת פרוטון לא שינויים משמעותיים (איור 4) . נתונים אלהלהגיע לרגישות של bioanalyzer כדי לזהות שינויים בתפקוד המיטוכונדריה CVEs.

figure-results-1787
איור 1. תכנון אסטרטגי עבור הניסוי. ציר הזמן בצינוק, צלחת, והכנת מחסנית מותווה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2203
איור 2. נציגי קבצי נתונים של פונקצית Bioenergetic בתאי CVE עם צפיפות תאים שונה. שיעורי חמצן צריכה נמדדו בתאי CVE עם צפיפות תאים שונה. הנתונים מייצגים ממוצע ± סטיית תקן (n = 5); OCR: שיעור צריכת חמצן; FCCP: קרבוניל ציאניד-4- (trifluoromethoxy) phenylhydrazone; רוט / Anti-A: rotenone ו antimycin א ①, ②, ו ③ מצביעים נשימה בסיסית; ④, ⑤, ו ⑥ מצביע ATP קשור נשימה; ⑦, ⑧, ו ⑨ מצביע נשימה מקסימלית; ⑩, ⑪, ו ⑫ מצביע נשימה הלא המיטוכונדריה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2979
איור 3. נציגי תוצאות של פונקצית Bioenergetic בתאי CVE עם צפיפות תאים שונה. נשימה בסל, ייצור ATP, נשימה מקסימלי, ואת לקיבולת מחושבות מתוך הנתונים הגולמיים שהופקו על ידי bioenergetics assay התפקודית באיור 2 תוך שימוש בנוסחות מפורטת בסעיף 4 . הנתונים מייצגים ממוצע ± סטיית תקן (n = 5); OCR: שיעור צריכת החמצן. f = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig3large.jpg" target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-3638
איור 4: נציג תוצאות של פונקציה Bioenergetic מתחלש מיר-34a (א) נתונים גולמיים של פונקציה מיטוכונדריאלי הבאים ביטוי יתר של miR-34a ב 24 שעות שלאחר transfection.. (ב) נשימה בסל, ייצור ATP, הנשימה מקסימלי, ואת לקיבולת מחושבים מתוך הנתונים הגולמיים שהופקו על ידי bioenergetics assay תפקודית באיור 4 א; הפרמטרים מחושבים על ידי הנוסחות מצוינות התבטאות יתר סעיף 4.-34a miR מפחית במיטוכונדריה בתאי CVE ב 24 שעות שלאחר transfection. הנתונים מייצגים ממוצע ± סטיית תקן (n = 5); OCR: שיעור צריכת החמצן. ****, P <0.0001.קבצים / ftp_upload / 54,847 / 54847fig4large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-4519
טבלת 1. פרוטוקול ההפעלה Instrument.

Discussion

פרוטוקול זה מייצג שיטה להערכה של פנוטיפ bioenergetic בתאי האנדותל של כלי דם מוחיים. הוא משמש assay בסיסי להערכת המיטוכונדריה התא האנדותל, וזה הוא אופטימלי עבור ניסויים שנועדו לחקור את המנגנונים של גירויים שעשויים להשפיע על מסלול איתות המיטוכונדריה בתאי CVE. הוא גם מספק שיטה לבדיקה רפויה פוטנציאלי עבור מחלות הקשורות BBB-הפרעה.

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול

bioanalyzers שטף התאי יש את היכולת למדוד OCR בזמן אמת. ב assay זה, זיהוי צפיפות התאים המתאים הוא קריטי. אם צפיפות התאים נמוכה מ -8 × 10 3 תאים לכל היטב, OCR הבסיס נמוך מדי כדי להיות מנותח (איור 2 ואיור 3); אם צפיפות התאים הוא מעל 32 × 10 3 תאים לכל טוב, התאים אינם מגיבים oligomycin או FCCP מתכnts (איור 2 ואיור 3). צפיפות התאים האופטימלי עבור שורות התאים במודל ניסיוני שלנו הוא 16 × 10 3 תאים לכל טוב, אשר מביא לידי ביטוי בתוצאות לשכפול ורגישות לגירויים 7 וטיפולים 10,14. אם bioanalyzer 24 גם משמש, titrations החדש של צפיפות התאים יידרש עבור assay.

זה מתועד שיש CVEs נפח גדול של המיטוכונדריה לעומת תאי אנדותל אחרים או סוגי רקמות 15,16, דבר המצביע על הצורך לייצור אנרגיה גדולים יותר פחות תאים למדידת מטבוליזם bioenergetics. בדקנו מספר סוגים של תאי אנדותל המוח, כגון יסודי וחטיבת הנציח בתאי האנדותל של כלי הדם במוח בעכברים 7 והנציח תאי האנדותל האדם כלי דם במוח (נתונים שלא פורסמו). תאים אלה נדרשים צפיפות תא דומה להגיע OCR OCR המקובל (הנשימה בסיסית תוך 40 - 160 pmol / min96-גם צלחות ו -50 - 400 pmol / min 24 גם צלחות) כאשר assay bioenergetics בוצע. Kaczara et al. דיווח מדידת חילוף החומרים bioenergetic בתאי האנדותל וריד אדם הטבור (HUVEC), אשר משמש צפיפות התאים גבוהה 17.

הקבוצה שלנו לא להעריך תאי כלי מרקמות או איברים אחרים. באופן תיאורטי, bioanalyzer עלול לשמש על כל סוג תא, אבל זה דורש אופטימיזציה של assay עבור צפיפות התאים, תרבית תאים בינוני, ותנאי תרבות (כמה תאים ספציפיים עשויים לדרוש צלחות מצופות לגדול היטב). היא נדרשת כי הניסויים הושלמו כדי להבטיח את שיעור OCR הוא בטווח המקובל. אם OCR בתאי האנדותל מאיברים אחרים הוא נמוך יותר מאשר CVEs מן המוח, הגדלת צפיפות התאים יכול לעזור כדי לקבל בטווח OCR מקובל. לחלופין, אם התאים אינם באמצעות זירחון חמצוני כמקור האנרגיה העיקרי שלהם, bioanalyzer לא יהיה אופטימהassay l.

Bioanalyzer מאפשר על ההפרעה הרציפה של שרשרת העברת אלקטרונים, המבוסס על ההסדר שבו ריאגנטים מוחלים. ראשית, oligomycin מוחל, אשר מעכב V קומפלקס המיטוכונדריה (synthase ATP). שנית, FCCP, גידול uncoupler אלקטרונים, מוחל, אשר מוביל שיבוש של שיפוע פרוטון. לבסוף, rotenone ו antimycin, אשר מעכבים לי תסביכים המיטוכונדריה ו- III, בהתאמה, מוחלים להביא עיכוב סך של זרימת אלקטרונים. סדר החשיפה לסמים חיוני כי התרופות לחסום את תגובת שרשרת העברת אלקטרונים הספציפית, והשינויים הרציפים ניתן למדוד כדי לשקף את הפונקציה של המיטוכונדריה.

שינויים ופתרון בעיות

כדי להעריך תגובה המיטוכונדריה לגירויים בתאי CVE, מומלץ כי הגירויים מוחלים על תאים לאחר שהתאים הם דבקו לתחתית צלחת תרבית תאים (ראה ציר הזמןשמוצג באיור 1; זה בדרך כלל לוקח לפחות 6 שעות). כדי להשיג תוצאות לשכפול על ידי טיפולים, חשוב מאוד לשמור על צפיפות התאים עקבית. אם pretreatments נועד לפני זריעת תאים, צפיפות תאים לכל טיפול קדם צריכה להימדד בזהירות, למעט התאים המתים זריעה. אם transfection נכלל בתכנון הניסוי, עיין בפרוטוקול transfection של היצרן. הפגינו הנתונים המוצגים באיור 4, miR-34a היה transfected לתוך התאים CVE באמצעות ערכת transfection lipofectamine, המחייב בינוני תרבית תאים ללא אנטיביוטיקה מבחן מיטו מתחים כדי להעריך את השינויים בתפקוד מטבולי עם ביטוי יתר של miR-34a . המינונים של פלסמיד עשוי גם להיות מותאם, כפי שפורסם בעבר 13. שינוי נוסף שניתן לעשות לפרוטוקול משתנה הריכוזים של חומרים כימיים. עקומת טיטרציה של oligomycin, FCCP, ו / או rotenone ו Antimycin A יכול להיות משליםטד.

בנוסף, אם assay זה משמש תפוקה גבוהה מנתח של תרופות שונות, הוא הציע לכלול assay במקביל למדוד כדאיויות תא ובחלוקה של תאים, אשר תוארה בפרסומים הקודמים שלנו 7,13. ערכי OCR מושפעים באופן מהותי מספר סלולארי (איורים 2 ו -3), ואת מבחני התפשטות כדאי תא לטובת הנורמליזציה של הנתונים. עם זאת, השלים מבחנים אלה מסורים לשיקול דעתו של כל מעבדת פרט.

מגבלות של הטכניקה

המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא שאנחנו רק משמשים מודל התרבות תאים במבחנה במחקר. נכון לעכשיו, אין מודלי vivo לשעבר זמינים או במודלים של בעלי חיים שעשויות לפתור פונקצית המיטוכונדריה תא האנדותל. דגמים חדשים צפויים להיות שפותחו עבור ההערכה של תפקוד bioenergetic in vivo ו vivo לשעבר במחקרים עתידיים.

מגבלה נוספת היא הרחבה של הערכות מחסום בעקבות צעדי bioenergetics. הניסויים לא יכול להתבצע בגלל, הראשון, לאחר השלמת המדידות bioenergetic, את הכדאיות התא היא פחתה בעקבות שיבוש מוחלט של שרשרת העברת אלקטרונים; שני, תרבית תאים ספציפיות צלחות מוסיפות נדרשות לזהות ערכי bioenergetics ואינן תואמים את מוסיף להערכות מכשול. לכן, אין מבחנים תפקודיים רבים שיכולים להסתיים לאחר assay bioenergetics. עם זאת, צפוי כי מכשירים מיוחדים ניתן לפתח כדי לבצע מבחנים פונקציונליים לפני assay bioenergetics.

משמעות של הטכניקה ביחס קיימים / שיטות חלופיות

טכניקות קודמות לאבחון תפקוד המיטוכונדריה חייבו את הבידוד של המיטוכונדריה מתא 18. ne זהטכניקת w באמצעות bioanalyzer מאפשרת מדידה של פעילות המיטוכונדריה בתאים שלמים, שומר יותר של הסביבה התאית מאשר הערכת המיטוכונדריה מבודד.

יישומים עתידיים או כיווני לאחר מאסטרינג טכניקה זו

פרוטוקול זה נועד ופתח עבור הקו הסלולרי bEnd.3, אבל זה גם תואם עם האנדותל של כלי דם מוחיים עיקריים (pCVE) תאים 7 או האנדותל אחר, ואנחנו הוכחנו זאת בפרסום הקודם שלנו באמצעות תאי pCVE 7. כאשר סוגים אחרים של האנדותל משמשים, הציפוי של הצלחת תרבות השימוש של גורמי גדילה ייתכן שיידרשו. עם זאת, assay טיטרציה מומלץ עבור סוגי תאים אחרים גם כן. פרוטוקול זה מציע שיטה כללית להינקט בהערכת bioenergetics של תאי CVE, והוא עשוי להיות מיושם נוסף ללימודי מנגנון או תגובות טיפוליות בצורה זו.

Disclosures

The authors declare no potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article. Open Access fees for this article were provided by Agilent Technologies.

Acknowledgements

This work was supported by the following grants: AHA 16SDG31170008 to X.R. and NIH P20 GM109098, P01 AG027956, and U54 GM104942 to J.W.S.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
bEnd.3 cell lineATCCCRL-229925 - 30 passages
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)ATCC30-2002
Fetal Bovine SerumAtlanta BiologicalsS1245010% final concentration
Penicillin/SteptomycinHycloneSV300101×100 stocking
0.25% trypsin, 0.03% EDTA solutionCorning25-053-CI
Sodium pyruvateCorning25-000-CI1.0 µM final concentration
GlucoseSigmaCAS 50-99-725 mM final concentration
OligomycinSigmaO48761.0 µM final concentration
Carbonilcyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)SigmaC29200.5 µM final concentration
RotenoneSigmaR88751.0 µM final concentration
Antimycin ASigmaCAS 1397-94-01.0 µM final concentration
Plate wash stationSeahorse Bioscience
Extracellular flux bioanayzer  Seahorse BioscienceXFe96
Extracellular flux cell culture plateSeahorse Bioscience102416-100
Extracellular flux sensor cartridgeSeahorse Bioscience102416-100
Extracellular flux calibrant solutionSeahorse Bioscience100840-000
Extracellular flux assay mediumSeahorse Bioscience102365-100PH buffered prior to assay

References

  1. Quintero, M., Colombo, S. L., Godfrey, A., Moncada, S. Mitochondria as signaling organelles in the vascular endothelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 5379-5384 (2006).
  2. Liu, Y., Li, H., Bubolz, A. H., Zhang, D. X., Gutterman, D. D. Endothelial cytoskeletal elements are critical for flow-mediated dilation in human coronary arterioles. Med Biol Eng Comput. 46, 469-478 (2008).
  3. Al-Mehdi, A. B., et al. Perinuclear mitochondrial clustering creates an oxidant-rich nuclear domain required for hypoxia-induced transcription. Sci Signal. 5, ra47 (2012).
  4. Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. [Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release. J Biol Chem. 280, 715-721 (2005).
  5. Sutendra, G., et al. The role of Nogo and the mitochondria-endoplasmic reticulum unit in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 3, 88ra55 (2011).
  6. Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11960-11965 (2009).
  7. Doll, D. N., et al. Mitochondrial crisis in cerebrovascular endothelial cells opens the blood-brain barrier. Stroke. 46, 1681-1689 (2015).
  8. Ren, X., Simpkins, J. W. Deciphering the Blood-Brain Barrier Damage in Stroke: Mitochondrial Mechanism. J Neuroinfect Dis. S2, e002 (2015).
  9. Pun, P. B., Lu, J., Moochhala, S. Involvement of ROS in BBB dysfunction. Free Radic Res. 43, 348-364 (2009).
  10. Sun, J., Hu, H., Ren, X., Simpkins, J. W. Tert-butylhydroquinone compromises survival in murine experimental stroke. Neurotoxicol Teratol. 54, 15-21 (2016).
  11. Modis, K., et al. Cellular bioenergetics is regulated by PARP1 under resting conditions and during oxidative stress. Biochem Pharmacol. 83, 633-643 (2012).
  12. Brown, R. C., Morris, A. P., O'Neil, R. G. Tight junction protein expression and barrier properties of immortalized mouse brain microvessel endothelial cells. Brain Res. 1130, 17-30 (2007).
  13. Bukeirat, M., et al. MiR-34a regulates blood-brain barrier permeability and mitochondrial function by targeting cytochrome c. J Cereb Blood Flow Metab. 36, 387-392 (2016).
  14. Hu, H., et al. Mitochondrial Impairment in Cerebrovascular Endothelial Cells is Involved in the Correlation between Body Temperature and Stroke Severity. Aging Dis. 7, 14-27 (2016).
  15. Oldendorf, W. H., Cornford, M. E., Brown, W. J. The large apparent work capability of the blood-brain barrier: a study of the mitochondrial content of capillary endothelial cells in brain and other tissues of the rat. Ann Neurol. 1, 409-417 (1977).
  16. Oldendorf, W. H., Brown, W. J. Greater number of capillary endothelial cell mitochondria in brain than in muscle. Proc Soc Exp Biol Med. 149, 736-738 (1975).
  17. Kaczara, P., et al. Carbon monoxide released by CORM-401 uncouples mitochondrial respiration and inhibits glycolysis in endothelial cells: A role for mitoBKCa channels. Biochim Biophys Acta. 1847, 1297-1309 (2015).
  18. Bharadwaj, M. S., et al. Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy. J Vis Exp. (96), e52350 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Neuroscience117BioenergeticBioanalyzer

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved