Оценка Биоэнергетической функции в церебральный эндотелиальных клеток сосудов

Резюме

Эндотелиальные митохондрии клеток имеют решающее значение для поддержания целостности гематоэнцефалического барьера. Введем протокол для измерения биоэнергетические функции в мозговых клетках эндотелия сосудов.

Аннотация

Целостности гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) имеет решающее значение для предотвращения травм головного мозга. Церебрального сосудистого эндотелия (ССО) клетки являются одним из типов клеток, составляющих ГЭБ; эти клетки имеют спрос очень высокой энергии, что требует оптимальной митохондриальной функции. В случае болезни или травмы, митохондриальная функция в этих клетках, могут быть изменены, в результате чего при болезни или открытие ГЭБ. В этой рукописи, мы вводим метод измерения митохондриальной функции в клетках ССО, используя целые, неповрежденные клетки и Bioanalyzer. Пробирного мито-стресс используется, чтобы бросить вызов клетки, которые были возмущенные, либо физически, либо химически, и оценивать их биоэнергетического функцию. Кроме того, этот метод также обеспечивает удобный способ показать на экране новые терапевтические средства, которые оказывают прямое воздействие на митохондриальной функции. Мы оптимизировали плотность клеток нужно обеспечивать уровень потребления кислорода, которые позволяют для расчета различных митохондриальной параметров, в том числе АТФ, максимальное дыхание, и резервные мощности. Мы также показывают чувствительность анализа, продемонстрировав, что введение микроРНК, MIR-34a, приводит к выраженной и выявляемой снижением митохондриальной активности. В то время как данные, приведенные в данной статье оптимизирован для клеточной линии bEnd.3, мы также оптимизировали протокол для первичных клеток ССО, дополнительно предполагая полезность в доклинических и клинических моделей.

Введение

Широко признано, что гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), образованный церебральный сосудистый эндотелиальный (ССО) у клеток имеет очень четкие и уникальные функции, имеет первостепенное значение для сосудистой биологии. Эти эндотелиальные клетки используют митохондрии для генерации большей части клеточного питания аденозинтрифосфата (АТФ) в качестве источника химической энергии. В дополнение к обеспечению СПС для ССО клеток, митохондрии регулируют различные клеточные процессы в эндотелиальных клетках сосудов, таких как сотовые сигнализации ^1-4, апоптозе ⁵ и контроль клеточного цикла и рост клеток ^6. Нарушение регуляции митохондриальной биоэнергетической функции в клетках ССО может повлиять на митохондриальный биогенез, что приводит к нарушению сосудистого эндотелия активности, и обострить цереброваскулярных заболеваний и нейродегенеративных расстройств, например, инсульт ^7,8 и болезни Альцгеймера (AD) ^9. Мы показали, что оскорблений в адрес ССО клеток после воздействия lipopolysaccharide (LPS) ухудшают митохондриальную функцию в клетках и ССО ухудшить ход результатов ^7. Трет-бутилгидрохинон (TBHQ) увеличивает смертность инсульта, сталкиваясь с окислительного фосфорилирования в клетках ССО ^10. Таким образом, количественная модель биоэнергетической функции в ССО клетках не только пилотов серии исследований, связанных с механизмом для центральной нервной системы (ЦНС) заболеваний, но и обеспечивает прорыв в скрининге лекарственных терапевтических средств, ориентированных на митохондриальную функцию в сосудистой биологии.

Изолированные митохондрии были использованы для измерения биоэнергетические функции. Мы ⁷ и другие ¹¹ сообщили оценки клеточных биоэнергетики в интактных клетках ССО с использованием внеклеточного Bioanalyzer потока. Анализатор обеспечивает преимущество эндогенного клеточного биоэнергетической оценки. Этот чувствительный и последовательный анализ измеряет митохондриальную метаболизм ССО клеток и могут быть использованы для оценки биоэнергетического нарушения ШТИМули, исследовать механизмы митохондриальных сигнальных путей, а также препараты с плоским экраном или лечения, которые влияют на митохондриальную функцию в ССО клетках. Скорости потребления кислорода (OCR) записывается с использованием Bioanalyzer фармакологический подход профилирующей путем комбинирования использования четырех митохондриальных разрушители: олигомицином, карбонилцианид-4 (трифторметокси) фенилгидразона (FCCP), Ротенон и антимицину А. В этом протоколе, мы подробно оптимизированный подход, который позволяет для измерения и расчета митохондриальных функциональных параметров в ССО клетках, в том числе базальной митохондриального дыхания, АТФ, утечки протонов, максимального дыхания и запасной дыхательной емкости, в одном анализе.

протокол

Примечание: Схема протокола показана на рисунке 1, в том числе сроки процедур.

1. Культура и прохождение ССО клеток

1. Культура клеток (CVE bEnd.3 клетки) в полной среде роста (высокий уровень глюкозы в модифицированную Dilbecco орла Medium, DMEM) , дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина в Т75 см ² культуре ткани колбу. Grow при 37 ° С в атмосфере 5% СО ₂ инкубаторе.
2. Удаляют среду для культивирования клеток. Ополосните слой клеток с 0,25% трипсин-0,03% раствора ЭДТА, а затем добавить 1 - 2 мл раствора трипсина-ЭДТА в колбу и держать колбу при 37 ° С в течение 3 - 5 мин. Обратите внимание на клетки под инвертированным микроскопом, пока слой клеток не отсоединяется. Добавляют 10 мл полной среды для роста и аспирацию клеток осторожно пипеткой.
3. Декантируют жидкость и клетки в центрифужную пробирку и спина 15 мл при 700 мкг в течение 5 мин для удаления остатков клеток.
4. Жидкость над осадком сливают из центрифуги трубки. Добавляют 10 мл полной среды для роста и повторно приостанавливать осадок клеток. Спин клетки при 700 мкг в течение 5 мин.
5. Жидкость над осадком сливают из центрифуги трубки. Повторное приостановить осадок клеток в полной среде роста при концентрации 2,0 × 10 ⁵ клеток / мл (определено путем подсчета с помощью гемоцитометра, исключить мертвые клетки с помощью трипанового-синего окрашивания).
   Примечание: свеже-размороженные клетки субкультивироваться в течение по крайней мере 3-х проходов для экспериментов.

2. Обработка семян и Рассматривать Клетки на клеточной культуре Плиты

1. Семенной клетки на 96-луночный внеклеточной флюса культуральный планшет: 80 мкл / лунку. Поместите культуральный планшет при 37 ° С в атмосфере 5% СО ₂ инкубаторе. Примечание: 16 × 10 ³ клеток на лунку достигнет 60 - 80% слитности в течение 24 часов.
2. Если клетки подвергаются воздействию химических веществ, добавить лечения как только клетки прикреплены к нижней пластине (8 - 24 ч после того, как смдинь).
   Примечание: Для трансфекции, не добавляют антибиотики в полной среде роста.

3. Оценка митохондриальной функции Использование Bioanalyzer

1. До начала анализа, гидрат внеклеточный потока картридж датчика с калибрующего путем добавления 150 мкл внеклеточной потока калибрующего раствора к пластине и инкубирование O / N при температуре 37 ° С без СО _2.
2. Используя шайбу станции пластины, изменить среду для культивирования клеток в рН 7,0 внеклеточной поток среды для анализа. Инкубируйте клетки при 37 ° С без СО ₂ в течение 30 - 60 мин.
3. Подготовка рабочих растворов 8 мкМ олигомицином, 4,5 мкМ FCCP, 10 мкМ ротенону и 10 мкМ антимицина А в DMEM. Нагрузка 25 мкл исходных растворов в патрон портов впрыска: Порт A, олигомицином; Порт B, FCCP; Порт C, ротенон и антимицину А с внеклеточного потока среды для анализа. Реализация протокола анализа , как описано в таблице 1,
4. Загрузите гашеной картридж в Bioanalyzer и выполнить калибровку, нажав на кнопку "Пуск". После завершения калибровки, снимите нижнюю пластину картриджа и загрузите клеточную пластинку, нажав кнопку "Выгрузка картриджа" приглашение. Продолжайте анализ до конца всех измерений.
5. Откройте файл данных и получить значения скорости от Bioanalyzer. Экспорт данных в файл электронной таблицы.

4. Анализ данных

Примечание: Расчеты для анализа данных сформулированы ниже. Значения получаются из Bioanalyzer инструмента , как ОРС представлены на рисунке 2.

1. Для расчета базальной дыхание, вычитать , не митохондриальную дыхания (измерения 10 - 12) от основного значения (измерения 3).
   Примечание: Базальная дыхания = Базальный - без митохондриального дыхания = Скорость ③ - Оценить ⑩ ~ ⑫.
2. Для расчета АТФ производства пна, вычесть АТФ-связанного дыхания (измерения 4 - 6) от основного значения (измерения 3).
   Примечание: АТФ = Базальный - АТФ-сшитый дыхание = Rate ③ - Тариф ④ ~ ⑥.
3. Чтобы вычислить Максимальный дыхание, вычитать , не митохондриальную дыхания (измерения 10 - 12) от максимального дыхания (измерения 7 - 9).
   Примечание: Максимальное дыхание = Максимальное дыхание - без митохондриального дыхания = Оценить ⑦ ~ ⑨ - Оценить ⑩ ~ ⑫.
4. Для расчета резервных мощностей, вычесть базальную значение (измерение 3) от максимального дыхания (измерения 7 - 9).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Резервные мощности = Максимальное дыхание - базальный = Оценить ⑦ ~ ⑨ - Оценить ③.
5. Для расчета утечки Proton, вычесть , не дыхание митохондрий (измерение 10 - 12) от АТФ-связанного дыхания (измерение 4).
   Примечание: Proton утечка = АТФ-сшитый дыхание - не-митохондриил дыхание = Оценить ④ - Оценить ⑩ ~ ⑫.

Результаты

Для оценки биоэнергетического функции клеток ССО в ответ на окислительный стресс, мы выбрали мышиный мозг микрососудистых эндотелий клеточную линию bEnd.3, которая отображает те же сравнительные характеристики барьера как первичный микрососудистых эндотелиальных клеток головного мозга ^12. Учитывая, что кинетика и относительная интенсивность реакции варьируют между различными типами клеток, в первой серии экспериментов, были разработаны, чтобы получить измеримые уровни оптического распознавания символов путем определения оптимального количества клеток bEnd.3 использовать в анализе для метаболического профилирования, показаны в Рисунок 2. После оценки, данные количественно и представлены на рисунке 3. базального дыхания, максимальное дыхание, и запасной дыхательной емкости показала пропорциональный ответ с плотностью клеток. Тем не менее, производство АТФ снижается при 64 × 10 ³ клеток на лунку были отобраны, предполагая , что чрезмерное сливающийся культуре клетокне подходит для этого эксперимента. Оптимальные плотности клеток происходят между 8 - 32 × 10 ³ клеток на лунку, на основе ответа на митохондриальных разрушители.

Для последующих экспериментов, плотность засева 16 × 10 ³ клеток на лунку использовалась для обеспечения оптимального обнаружения изменений в OCR. С помощью 16 × 10 ³ клеток на лунку, мы наблюдали ожидаемые ответы в OCR и показали , что микроРНК микроРНК-34а уменьшает митохондриальную функцию в клетках ССО (рисунок 4). Ранее мы уже сообщали , что микроРНК-34а снижается окислительного фосфорилирования в этих клетках ^13. Повторные эксперименты также показали , что максимальное дыхание и резервные мощности были значительно уменьшились сверхэкспрессией микроРНК-34а в CVEs на 24 ч после трансфекции, хотя базального дыхания, АТФ и утечки протонов не имели каких - либо существенных изменений (Рисунок 4) , Эти данныедемонстрируют чувствительность Bioanalyzer для обнаружения изменений в митохондриальной функции в CVEs.

Рисунок 1. Стратегическое планирование для эксперимента. Временная шкала для клеток, пластины, и подготовка картриджа указывается. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Нормы расхода кислорода Рисунок 2. Представитель необработанных данных биоэнергетических функции в клетках ССО с различными плотностями Cell. Измерялись в ССО клеток с различной плотностью клеток. Данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение (n = 5); OCR: потребление кислорода Скорость; FCCP: карбонилцианид-4- (трифторметокси) фенилгидразон; Rot / Anti-A: ротенон и антимицину A. ①, ② и ③ указывают базального дыхания; ④, ⑤, и ⑥ показывают АТФ связаны дыхание; ⑦, ⑧ и ⑨ указывают максимальное дыхание; ⑩, ⑪ и ⑫ указывают на не-митохондриального дыхания. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Представитель Результаты биоэнергетические функции в клетках ССО с различными плотностями Cell. Базальная дыхания, АТФ, максимальное дыхание, и резервные мощности рассчитываются на основе исходных данных , полученных с помощью биоэнергетики функциональный анализ на рисунке 2 , с использованием формул указанных в разделе 4 . Данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение (n = 5); OCR: потребление кислорода Скорость. F = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig3large.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Представитель Результаты сниженного Биоэнергетической функции по MIR-34а (A) Исходные данные митохондриальной функции после избыточной экспрессии микроРНК-34а на 24 ч после трансфекции.. (B) Базальная дыхание, АТФ, максимальное дыхание, и резервные мощности рассчитываются на основе исходных данных , генерируемых биоэнергетике функциональном анализе на рисунке 4A; параметры рассчитываются по формулам, указанным в разделе 4. сверхэкспрессии MIR-34a уменьшает митохондриальную функцию в клетках ССО в 24 ч после трансфекции. Данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение (n = 5); OCR: потребление кислорода Скорость. ****, P <0,0001.Файлы / ftp_upload / 54847 / 54847fig4large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1. Инструмент Run Protocol.

Обсуждение

Этот протокол представляет собой метод оценки биоэнергетического фенотипа в церебральных сосудистых эндотелиальных клеток. Он служит в качестве основного для анализа митохондриальной оценки эндотелиальных клеток, и это является оптимальным для экспериментов, направленных на изучение механизмов стимулов, которые могут повлиять на митохондриальную сигнального пути в клетках ССО. Она также обеспечивает способ тестирования потенциальных терапевтических средств для лечения ВВВ-нарушение-ассоциированных заболеваний.

Критические шаги в рамках Протокола

Внеклеточного bioanalyzers потока имеют возможность измерения OCR в реальном времени. В этом анализе, определение соответствующей плотности клеток имеет решающее значение. Если плотность клеток ниже 8 × 10 ³ клеток на лунку, базальная OCR слишком мала , чтобы быть проанализированы (Рисунок 2 и Рисунок 3); если плотность клеток превышает 32 × 10 ³ клеток на лунку, клетки не реагируют на олигомицину или FCCP обработкNTS (рисунок 2 и рисунок 3). Оптимальная плотность клеток для этой клеточной линии в нашей экспериментальной модели составляет 16 × 10 ³ клеток на лунку, которая демонстрирует воспроизводимые результаты и чувствительность к стимулам ⁷ и лечения ^10,14. Если Bioanalyzer 24-скважина используется, новые титрование плотности клеток потребовалось бы для анализа.

Это документально подтверждено , что CVEs имеют большой объем митохондрий по сравнению с другими эндотелиальных клеток или типов тканей ^15,16, что указывает на необходимость увеличения производства энергии и меньшее количество клеток для измерения биоэнергетический метаболизм. Мы протестировали несколько типов эндотелиальных клеток головного мозга, такие как первичный и увековечил мышиные цереброваскулярных эндотелиальные клетки ⁷ и увековечил цереброваскулярных эндотелиальные клетки человека (неопубликованные данные). Эти клетки необходимы аналогичные плотности клеток, чтобы достичь приемлемого OCR (базальные дыхания OCR в пределах 40 - 160 пмоль / мин для96-луночные планшеты и 50 - 400 пмоль / мин в течение 24-луночные планшеты), когда анализ биоэнергетика проводилась. Kaczara и др. Сообщили измерения биоэнергетического метаболизма в эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC), которые использовали более высокую плотность ¹⁷ клеток.

Наша группа не оценивали клетки сосудов из других тканей или органов. Теоретически Bioanalyzer потенциально могут быть использованы на любом типе клеток, но она требует оптимизации анализа для плотности клеток, клеточной культуральной среды и условий культивирования (некоторые специфические клетки могут потребовать покрытием пластин хорошо растут). Необходимо, чтобы эксперименты будут завершены, чтобы обеспечить скорость распознавания текста находится в пределах допустимого диапазона. Если ОРС в эндотелиальных клетках других органов ниже, чем CVEs из головного мозга, увеличивая плотность клеток может помочь получить в пределах приемлемого диапазона оптического распознавания символов. В качестве альтернативы, если клетки не используют окислительного фосфорилирования в качестве основного источника энергии, то Bioanalyzer бы не быть Optimaл анализ.

Bioanalyzer допускает последовательное разрушение цепи переноса электронов, на основании порядка, в котором применяются реагенты. Во-первых, олигомицином применяется, который ингибирует митохондриальный комплекс V (АТФ-синтазы). Во-вторых, FCCP, электронный разобщитель, применяется, что приводит к нарушению протонного градиента. И, наконец, ротенон и антимицину А, которые ингибируют митохондриальную комплексы I и III, соответственно, применяются к привести к полному ингибированию потока электронов. Порядок воздействия лекарственного средства имеет важное значение, так как препараты блокируют специфический перенос электронов цепной реакции, и последовательные изменения могут быть измерены, чтобы отражать митохондриальной функции.

Модификации и устранение неисправностей

Для оценки митохондриальной ответ на стимулы в ССО клетках, рекомендуется, чтобы стимулы применяются к клеткам, после того, как клетки прилипают к нижней части клеточной культуры пластины (см графикпоказано на рисунке 1; как правило, занимает не менее 6 ч). Чтобы получить воспроизводимые результаты с помощью лечения, чрезвычайно важно сохранить плотность клеток последовательно. Если предварительная обработка разработаны до посева клеток, плотность клеток для каждой предварительной обработки, должны быть тщательно измерены, за исключением мертвых клеток для засева. Если трансфекцию входит в экспериментальной конструкции, относятся к протоколу трансфекция изготовителя. Демонстрируется в данных , представленных на рисунке 4, микроРНК-34а трансфицировали в ССО клеток с использованием набора Липофектамин трансфекции, которая требует антибиотиков свободные среды для культивирования клеток и тест мито-стресс для оценки изменений в метаболической функции с избыточной экспрессии микроРНК-34а , Дозы плазмиды также могут быть оптимизированы, так как ранее опубликована ^13. Еще одно изменение, которое может быть сделано с протоколом изменяет концентрации реагентов. Титрование кривая олигомицином, FCCP, и / или ротенону и антимицина А может быть КомплексыТед.

Кроме того, если этот анализ используют для высокой пропускной способности анализа различных препаратов, предлагается включать в параллельный анализ для измерения жизнеспособности клеток и пролиферацию клеток, который был описан в предыдущих публикациях ^7,13. Значения OCR существенно зависит от количества клеток (Рисунки 2 и 3), а также клеточной пролиферации и жизнеспособности анализов на пользу нормализации данных. Тем не менее, завершение этих количественных анализов по усмотрению каждой отдельной лаборатории.

Ограничения техники

Основным недостатком этого протокола является то , что мы только использовали экстракорпорального модель культуры клеток в в исследовании. В настоящее время нет в наличии естественных условиях модели бывшие или животные модели , которые можно будет рассмотреть эндотелиальных клеток митохондриальной функции. Новые модели , как ожидается , будут разработаны для оценки биоэнергетического функции в естественных условиях и ех естественных условиях в будущих исследованиях.

Другим ограничением является продолжением оценки барьерных следующих мер биоэнергетики. Эксперименты не может быть выполнено, так как, во-первых, после завершения биоэнергетических измерений, жизнеспособность клеток уменьшается после полной разрушения цепи переноса электронов; во-вторых, специфические для клеточных культур пластины и вставки необходимы для определения значений Биоэнергетика и не подходят вставки для оценки барьера. Таким образом, существует не так много функциональных анализов, которые могут быть завершены после анализа биоэнергетики. Тем не менее, предполагается, что специальные устройства могут быть разработаны для выполнения функциональных анализов до анализа биоэнергетиком.

Значимость техники в отношении существующих / альтернативных методов

Предыдущие методы для оценки митохондриальной функции обусловили необходимость выделения митохондрий из клеток ^18. Это пеW метод с использованием Bioanalyzer позволяет для измерения митохондриальной активности в интактных клетках, сохраняющей более клеточной среды, чем оценка изолированные митохондрии.

Будущие приложения или направления после освоения этой техники

Этот протокол разработан и создан для клеточной линии bEnd.3, но он также совместим с первичным церебральный сосудистый эндотелиальный (pCVE) клеток ⁷ или других эндотелий, и мы продемонстрировали это в нашей предыдущей публикации с использованием pCVE клеток ^7. Когда другие типы эндотелий используются, могут потребоваться покрытие культуральной пластины и использование факторов роста. Тем не менее, анализ Титрование рекомендуется для других типов клеток, а также. Этот протокол обеспечивает общий метод, который будет принят в оценке биоэнергетике ССО клеток, и может быть дополнительно применен для изучения механизма или терапевтических реакций таким образом.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
bEnd.3 cell line	ATCC	CRL-2299	25 - 30 passages
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S12450	10% final concentration
Penicillin/Steptomycin	Hyclone	SV30010	1×100 stocking
0.25% trypsin, 0.03% EDTA solution	Corning	25-053-CI
Sodium pyruvate	Corning	25-000-CI	1.0 µM final concentration
Glucose	Sigma	CAS 50-99-7	25 mM final concentration
Oligomycin	Sigma	O4876	1.0 µM final concentration
Carbonilcyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)	Sigma	C2920	0.5 µM final concentration
Rotenone	Sigma	R8875	1.0 µM final concentration
Antimycin A	Sigma	CAS 1397-94-0	1.0 µM final concentration
Plate wash station	Seahorse Bioscience
Extracellular flux bioanayzer	Seahorse Bioscience	XFe96
Extracellular flux cell culture plate	Seahorse Bioscience	102416-100
Extracellular flux sensor cartridge	Seahorse Bioscience	102416-100
Extracellular flux calibrant solution	Seahorse Bioscience	100840-000
Extracellular flux assay medium	Seahorse Bioscience	102365-100	PH buffered prior to assay