تحليل الكروموسومات الزيغ الناجم عن المواد-المحيط الجسيمات باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; النظام

Summary

يصف هذا البروتوكول تقنيات القياس الكمي وتوصيف التشوهات الكروموسومية في المختبر في الضامة الماوس RAW264.7 بعد العلاج مع المحيط الجسيمات الجوية.

Abstract

التعرض لجسيمات (PM) هو مشكلة صحية عالمية رئيسية، والتي قد تؤدي إلى تلف المكونات الخلوية المختلفة، بما في ذلك المادة الوراثية النووية. لتقييم تأثير PM على سلامة الوراثية النووية، وسجل التشوهات الكروموسومية الهيكلية في هوامش الطورية من خلايا البلاعم الماوس RAW264.7. PM يتم جمعها من الهواء المحيط مع جزيئات العينات مجموعه كبيرة الحجم مع وقف التنفيذ. وبالفاعلات المواد التي تم جمعها وتصفيتها للاحتفاظ، جزء غرامة للذوبان في الماء. تتميز الجزيئات عن التركيب الكيميائي بواسطة الرنين المغناطيسي النووي (NMR) الطيفي. يتم إضافة تركيزات مختلفة من الجسيمات تعليق على ثقافة في المختبر الضامة الماوس RAW264.7 لمجموع الوقت تعرض 72 ساعة، جنبا إلى جنب مع الخلايا السيطرة غير المعالجة. في نهاية التعرض، ويتم التعامل مع الثقافة مع colcemid إلقاء القبض على خلايا في الطورية. الخلايا ثم حصادها، وتعامل مع محلول ناقص التوتر، ثابتة في acetomethanol، دropped على الشرائح الزجاجية وملطخة أخيرا مع حل بالغيمزا. يتم فحص الشرائح لتقييم الانحرافات الهيكلية الكروموسومات (CAS) في ينتشر الطورية في 1،000X التكبير باستخدام المجهر مشرق الميدان. وسجل 50-100 انتشار الطورية لكل مجموعة العلاج. ويتم تكييف هذه التقنية للكشف عن الانحرافات الهيكلية الكروموسومات (CAS)، مثل فواصل كروماتيدي من نوع، كروماتيدي من نوع التبادل، شظايا لامركزية، الكروموسومات ذو مركزين وخاتم، دقيقة مزدوجة، تنسخ داخلي، ونقل المواقع روبرتسوني في المختبر بعد التعرض للجسيمات. وهي طريقة قوية لربط نقطة نهاية الوراثية الخلوية راسخة لتعديلات جينية.

Introduction

وتشير التقديرات إلى أن التعرض لجسيمات (PM) يسبب أكثر من 3 ملايين حالة وفاة إضافية سنويا، في المقام الأول من أمراض القلب وسرطان الرئة ^1. في الواقع، تم الاعتراف PM أنها مسرطنة للبشر من قبل الوكالة الدولية لبحوث السرطان (المجموعة 1)، وزيادة خطر الإصابة بسرطان الرئة مع زيادة مستويات التعرض للجسيمات وقد تبين ^2. ومن المثير للاهتمام، تقريبا كل الخلايا السرطانية تؤوي شذوذ الكروموسومات العددية و / أو الهيكلية. الكربون العضوي الجسيمات هو البديل، مجمع، وخليط غير متجانس، وتركيبتها وحجم التوزيع يعتمد على الانبعاثات وكذلك التحولات الفيزيائية والكيميائية. وتمثل 35-55٪ من المناطق الحضرية PM _2.5 كتلة (PM 2.5 ميكرون في الحجم وأصغر) وأكثر من 60٪ من المناطق الريفية والقاري خلفية PM _2.5 كتلة ^{3، 4.} حسابات الكسر للذوبان في الماء ل30-90٪ من الهباء الجوي العضوي. وهناك عدد كبير من المركبات العضويةتم التعرف عليها، بما في ذلك الهيدروكربونات الأليفاتية، والهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات، ومشتقاتها الاوكسيجين والمنترزة، والألدهيدات الأليفاتية والكحول والأحماض الدهنية الحرة وأملاحها، والأحماض دى الكربوكسيلية، والمركبات متعددة الوظائف، والبروتينات، والجزيئات الشبيهة الدبالية (HULIS) باستخدام طرق الكروماتوغرافي إلى جانب تقنيات قياس الطيف الكتلوي ^5-8. وتمثل هذه المركبات أقل من 10-20٪ من الكربون العضوي الجسيمات، وبالتالي معظم الكربون العضوي غير معروف ^9.

وتشير الأدلة التجريبية التي السمية الخلوية، الاكسدة، والتهاب تشارك في تطوير الحالات المرضية المرتبطة PM. وقد تبين في الآونة الأخيرة، مع ذلك، أن التعرض للجسيمات النتائج أيضا في عدد من تعديلات جينية، بما في ذلك التغيرات في الحامض النووي من العناصر المتكررة، في كل من التجريبية في أنظمة المختبر وفي المواد البشرية ^10-12. ذات أهمية خاصة هي آثارمساء يوم الحمض النووي الفضائية - الأقمار الصناعية الرئيسية والثانوية - والتي توجد في المنطقة كروماتين متغاير حول السنترومير من الكروموسومات. وقد تبين أن هذه الآثار قد تكون مستمرة بطبيعتها، لأنها يمكن أن يتم الكشف عن لا يقل عن 72 ساعة بعد التعرض ^12. تغيرات في الحامض النووي، وخاصة حول القسيم، قد يؤدي إلى تراكم النصوص مرنا الحمض النووي الأقمار الصناعية، وسط سلامة الكروموسومات خلال انقسام الخلايا، وبعد ذلك يؤدي إلى تطوير مجموعة متنوعة من الحالات المرضية ^13.

تكييف نهج الوراثي الخلوي لتحليل المصدقة بمثابة نقطة نهاية تعديلات جينية تسبب بها مساء، وبالتالي، هو من أهمية قصوى. هنا، نحن تقرير نهج لPM جمع المحيطة والإعداد، في التعرض المختبر وتحليل المصدقة استخدام نظام بلعم نموذج RAW264.7 الفئران. تشمل الضامة خط الدفاع الأول ضد الأجسام الغريبة المستنشقة، وبالتالي، ريخدم خط زنزانته كما ثابتة والأكثر استخداما نموذج في الجسيمات وعلم السموم ^{11، 12، 14، 15.}

Protocol

1. الجسيمات جمع وإعداد

1. معايرة الجسيمات العينات مجموعه كبيرة الحجم مع وقف التنفيذ
   1. قطع المحرك العينات من وحدة تحكم التدفق الجماعي وربط المحرك إلى مستقر مصدر طاقة تيار متردد (الشكل 1).
      ملاحظة: لا يتم استخدام فلتر أثناء هذا الإجراء.
   2. جبل فتحة تدريج وأعلى تحميل لوحة محول لأخذ العينات. تشديد أعلى محول تحميل المكسرات عقد لأسفل بشكل آمن لضمان عدم تسرب الهواء موجودة. السماح للمحرك العينات في عملية الاحماء لفي درجة حرارة التشغيل العادية (حوالي 10-15 دقيقة).
   3. إجراء اختبار تسرب من خلال تغطية الثقوب على رأس الفوهة والضغط الحنفية على فوهة مع اليدين. الاستماع لصوت الأنين عالي النبرة التي الهروب الهواء. إذا سمع هذا الصوت، وإعادة تشديد أعلى محول تحميل المكسرات عقد لأسفل كما تسرب موجودا. إذا كان الصوت هو أقل من ذلك، وتسرب بالقرب من الحشوات الأخرى في تميز الكليةتيم.
   4. ربط جانب واحد من مقياس الماء لضغط الصنبور على جانب الفوهة مع فراغ أنبوب المطاط. ترك الجانب الآخر من مقياس مفتوح إلى الغلاف الجوي. عقد مقياس عموديا لضمان قراءات دقيقة. والتنصت على مساعدات من مسجل تدفق مستمر مساعدة لتوسيط القلم وتوفير قراءات دقيقة.
   5. كرر الخطوة 1.1.2 باستخدام خمسة معدلات تدفق تمثل العاملة معدلات تدفق 30-60 قدم / دقيقة (تقريبا كل 5-6 قدم ³ / دقيقة). ضبط مقبض الباب على فوهة متغيرة إلى خمسة مواقع مختلفة، ويستغرق خمس قراءات مختلفة.
   6. تسجيل درجة حرارة الغرفة الهواء والضغط الجوي المحيط، والرقم التسلسلي العينات، فتحة الرقم التسلسلي، منحدر فوهة واعتراض مع آخر موعد مصدق، تاريخ، موقع الموقع، والأحرف الأولى المشغل على ورقة المعايرة.
2. مجموع جمع الجسيمات العالقة العينة والتحليل الوزني
   1. التفاف على8 "× 10" فلتر الألياف الكوارتز في طبقتين من رقائق الألومنيوم. وضع مرشح ملفوفة في الفرن وضبط درجة الحرارة عند 550 درجة مئوية. خبز مرشح للا يقل عن 4 ساعة. دع بارد الفرن واسترداد التصفية. وضع مرشح في مجفف مع كربونات الكالسيوم _3.
   2. تزن مرشح في توازن دقيق مع دقة 10 ميكروغرام. كرر القياس ثلاث مرات خلال يوم واحد. وينبغي أن تكون القياسات الفردية ضمن 25 ميكروغرام. وإذا لم يتحقق هذا، والعودة مرشح ملفوفة إلى مجفف وتكرار هذه العملية في اليوم التالي.
   3. فتح غطاء المأوى (الشكل 2). إزالة فلتر إطار حامل من خلال تخفيف الجوز الجناح أربعة، والسماح للمسامير النحاس وغسالات للتأرجح أسفل للخروج من الطريق. تتكشف مرشح من رقائق الألومنيوم، واستخدام ملقط تنظيفها إلى مركز بعناية، جنبا عورة حتى، على الشاشة الداعمة. صحيح محاذاة مرشح على الشاشة.
   4. وضع الإطار على الشاشة وضمان الحصول عليها معمسامير النحاس وغسالات أثناء تطبيق ما يكفي من الضغط لتجنب تسرب الهواء عند الحواف. مسح أي تراكم الغبار من جميع أنحاء حامل مرشح بقطعة قماش نظيفة. انهيار المأوى غطاء بعناية وضمان الحصول عليها.
   5. تأكد من توصيل جميع الأسلاك إلى مآخذ عاء المناسبة ويتم توصيل الأنابيب بين ضغط الصنبور منفاخ السيارات ومسجل تدفق مستمر.
   6. إعداد مسجل التدفق. خفض القلم ذراع الرافعة لرفع نقطة القلم وإدراج مخطط جديد. محاذاة علامة التبويب الرسم البياني إلى محور محرك مسجل والضغط مع الإبهام لخفض مركز الرسم البياني على المحور. ضبط الوقت عن طريق تناوب محور حملة عقارب الساعة حتى يتم محاذاة الوقت الصحيح على الرسم البياني مع مؤشر الرقم القياسي الوقت.
   7. التبديل يدويا على العينات والبدء في جمع. مراقبة مسجل للتأكد من أنه يتم التحبير بشكل صحيح ومؤشر الوقت المنقضي للتأكد من أنها تعمل بشكل صحيح.
   8. في نهاية فترة أخذ العينات، وإيقاف العينات، سجلفي الوقت المنقضي واسترداد الرسم البياني. إزالة الإطار لفضح مرشح. إزالة عامل التصفية يتعرض من الشاشة دعم بوضعها بلطف في نهايات مع ملقط. أضعاف مرشح بالطول بحيث تلامس تلك العينة العينة مرتين والتفاف عليه في رقائق الألومنيوم الأصلي.
   9. تخزين مرشح في مجفف مع كربونات الكالسيوم ₃ لا يقل عن 24 ساعة قبل وزنها. كرر الخطوة 1.2.2 لقياس الوزن من المرشحات بعد أخذ العينات. وضع مرشح في كيس من البلاستيك والرمز البريدي وتخزينه في -80 درجة مئوية حتى التحليل.
3. تحليل عينة جمعت مجموع الجسيمات العالقة
   1. استرداد مرشح المخزنة، تتكشف رقائق الألومنيوم ونقل مرشح على سطح تفلون نظيفة. باستخدام ملقط ومشرط، وقطع الخارجي (الأبيض) جزءا من تصفية والتخلص منها.
      1. المقبل، وقطع مرشح في 0.5 "س 0.5" القطع والقطع مكان في قارورة 100 مل. إضافة 50 مل من الماء عالى النقاء. ضع قارورة في الموجات فوق الصوتيةحمام ويصوتن لمدة 60 دقيقة في 33 ± 3 كيلو هرتز.
   2. استخراج مرشح من خلال 0.45 ميكرون البولي بروبلين حقنة مرشح إلى 100 مل قارورة أسفل جولة. تتبخر المياه باستخدام أداة rotavap تحت الضغط عند 50 درجة مئوية حتى حوالي 5 مل من استخراج يبقى في قارورة.
      1. تتبخر المياه المتبقية في 15 مل قارورة على شكل كمثرى من الوزن المعروفة. وزن القارورة مع استخراج الجافة وتسجيل كتلة استخراج الجافة.
   3. حل العينة الجافة مع 400 ميكرولتر من D ₂ O من قبل sonicating لمدة 15 دقيقة ونقل إلى 5 مم أنبوب NMR القياسية. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 12000 x ج في درجة حرارة الغرفة لإزالة أي مواد غير منحل.
   4. كرر مع 300 ميكرولتر من D ₂ O. إضافة 10 ميكرولتر من نان ₃ 1.4٪ (اضرب النهائي: 0.02٪ ث / ت) في أنبوب NMR. إضافة 10 ميكرولتر (32 ميكروغرام) من مجموع الجسيمات العالقة (TSP) -d4 (3.2 ملغ / مل) إلى D ₂ O (تركيز النهائي 0.258 ملم) في أنبوب NMR.
   5. الحصول على ¹ أطياف H NMR باستخدام مطياف الرنين المغناطيسي التي تعمل على 600.17 ميغاهيرتز.
      1. إدراج أنبوب NMR في مسبار بالبرد الرنين الثلاثي. معايرة أجهزة القياس في الترتيب التالي: قفل، لحن، الرقائق، 90 ° النبض طول معايرة وضبط الربح الاستقبال.
      2. قياس أطياف عند 25 درجة مئوية مع 1 D الإثارة النحت تسلسل باستخدام 180 البقول انتقائية في الماء في وضع الكشف رباعية الرقمية، 8192 بالاشعة، 4 بالاشعة دمية، عرض اكتساح 8012.57 هرتز، تردد تعويض لقمع إشارة المياه وضعت في 4.70 جزء من المليون، 1.70 ثانية اكتساب الوقت، 32،768 مرة نقاط البيانات المجال (TD)، 1 مللي ثانية مدة التدرج (P16)، و 100 μsec تأخير الانتعاش بعد التدرج (D16).
   6. عملية ¹ H NMR الأطياف من خلال تطبيق توسيع خط 1 هرتز والصفر ملء بمعامل 2 (65،536 نقاط البيانات). تصحيح المرحلة والأساس يدويا والاندماج. تعيين TSP-D4 الذروة عند 0.0 جزء في المليون.

2. الجسيمات التعرض

1. ثقافة أقامت
   1. دافئ وسائط النمو الكامل تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) وحل البنسلين ستربتومايسين (100 U / مل)، 0.25٪ حل التربسين والمغنيسيوم والكالسيوم فوسفات الحرة عازلة المالحة (PBS) في حمام مائي (عند 37 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل بدء الثقافة.
   2. أخرج قارورة T75 من 5٪ CO ₂ الحاضنة تحتوي على خلايا RAW264.7 مثقف وغسل الخلايا مع 2 مل من درجة حرارة قبل برنامج تلفزيوني مرتين.
   3. إزاحة الخلايا الملتصقة RAW264.7 من الجزء السفلي من السفينة زراعة الأنسجة باستخدام 1 مل من قبل حرارة حل التربسين تليها كشط.
   4. جمع الخلايا من السفينة زراعة الأنسجة وجعل التعليق خلية واحدة من قبل pipetting المتكررة. حساب عدد الخلايا مع التريبان الأزرق ولوحة في مناطق ذات كثافة من 8000 / سم ² (500،000 خلايا الكلية) في 100 ملم صحن زراعة الأنسجة مع وسائل الإعلام كاملة استعد مسبقا. ضبط حجم وسائل الإعلام إلى 10 مل لتركيز النهائي من 50،000 خلايالكل مل.
      ملاحظة: مضاعفة عدد من لوحات إذا أجري أيضا تحليل الحامض النووي.
   5. وضع خلايا RAW264.7 مطلية حديثا مرة أخرى في 5٪ CO ₂ حاضنة عند 37 درجة مئوية، والسماح لنعلق لمدة 24 ساعة.
   6. أيضا في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية، و resuspend الجسيمات التي تمت تصفيتها. على سبيل المثال، وتمييع الجسيمات بتركيز 0.5 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني العقيمة ل/ جرعة العلاج مل 5 ميكروغرام وفي 5 ملغ / مل ل/ جرعة العلاج مل 50 ميكروغرام. التخفيفات يمكن إعداد لمدة شهر مقدما وتخزينها في -80 درجة مئوية.
2. العلاج مع الجسيمات
   1. إخراج الخلايا من 5٪ CO ₂ الحاضنة والاختيار تحت التكبير 10x باستخدام مجهر مقلوب لنمو الخلايا، مورفولوجيا الخلايا، شرط الثقافة، والتلوث. ينبغي للمرء أن يتوقع أن يكون خلايا متكدسة 30٪ على الأقل في هذه المرحلة.
   2. جو معقم و مطهر، نضح في وسائل الإعلام باستخدام ماصة معقمة وغسل سفينة الثقافة مع 2 مل 37 درجة مئوية في برنامج تلفزيونيمرتين لإزالة تماما وسائل الإعلام والخلايا العائمة أو ميتا.
   3. إضافة جرعة محددة مسبقا من الجسيمات مع وسائل الإعلام الجديدة في الأوعية الثقافة واحتضان لمدة الوقت المطلوب عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ الحاضنة. في هذه الدراسة، وعلاج الخلايا RAW264.7 مع رئيس الوزراء لمدة 72 ساعة موازية التعرض المستخدمة لتحليل السمية وepigenotoxic المتزامنة.
      ملاحظة: السمسة قد تؤثر سلبا على نوعية التحليل الوراثي الخلوي. لذلك، فحوصات إضافية مثل السمية الخلوية، الحامض النووي، غرب النشاف، أو تحليل التعبير الجيني تتم عادة على الخلايا المعالجة. كشف الخلايا كما هو موضح والمضي قدما في فحص معين المطلوب. مستخدمين عديمي الخبرة قد تحتاج أيضا لتشمل مراقبة إيجابية مثل methanesulphonate الميثيل لاختبار قدرتها على كشف المصدقة.

3. الفحص الوراثي الخلوي

1. العلاج لاعتقال خلايا في الطورية
   1. تدفئة colcemid ذلكlution (10 ميكروغرام / مل) في 37 ° C حمام الماء لمدة 30 دقيقة. مسح الغطاء مع 70٪ من الكحول في إطار مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية للحد من مخاطر التلوث
   2. تماما إزالة وسائل الإعلام جو معقم و مطهر وغسل الأوعية الثقافة مع 2 مل قبل تحسنت برنامج تلفزيوني مرتين.
   3. إضافة وسائط جديدة استعد مسبقا (2 مل سائل الإعلام / 10 ⁶ خلايا) التي تحتوي على حل colcemid (5 ميكرولتر / مل) في سفينة الثقافة واحتضان لمدة 2 ساعة.
2. حصاد الخلايا
   1. دافئ حل التربسين وبرنامج تلفزيوني في حمام مائي الحفاظ على 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. من هذه الخطوة فصاعدا، ليست هناك حاجة للحفاظ على حالة العقيم.
   2. تماما إزالة وسائل الإعلام، وغسل الأوعية الثقافة مع 2 مل 37 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني لمرتين، إضافة إلى حجم المطلوب من قبل حرارة حل التربسين (عادة 2 مل لطبق ثقافة 60 ملم أو قارورة T25 و 4 مل لطبق 100 ملم أو قارورة T75 )، ووضع سفينة الثقافة مرة أخرى في 5٪ CO ₂ حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
   3. تاكه من سفينة الثقافة، فصل الخلايا باستخدام مكشطة، وإضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني لوقف العمل التربسين.
   4. ماصة صعودا وهبوطا عشر مرات على الأقل لجعل تعليق خلية واحدة ونقل الخلايا في 15 مل المخروطية أنبوب أسفل الطرد المركزي.
   5. تعليق خلية أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في أرجوحة من أجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة.
   6. إزالة طاف، وكسر بيليه الخلية عن طريق التنصت لطيف، إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني، ومرة ​​أخرى أجهزة الطرد المركزي لمدة خمس دقائق.
3. علاج ناقص التوتر والتثبيت
   1. قبل دافئ 0.075 محلول كلوريد البوتاسيوم M في حمام ماء C 37 درجة على الأقل لمدة 30 دقيقة.
   2. إزالة طاف دون الإخلال بيليه الخلية وترك ما يقرب من 0.5 مل من برنامج تلفزيوني.
   3. كسر بلطف بيليه الخلية وتقديم تعليق خلية واحدة باستخدام ماصة P200.
   4. إضافة 4 مل من قبل حرارة كلوريد البوتاسيوم انخفاض حل قطرة مع اهتزاز لطيف.
   5. احتضان الخلايا في ص منخفض التوترمحلول كلوريد otassium في 37 ° C حمام الماء لمدة 20 دقيقة.
   6. جعل حل acetomethanol وذلك بإضافة 3 أجزاء الميثانول مع 1 جزء حمض الخليك الجليدي. الحفاظ على هذا تثبيتي الطازجة في درجة حرارة الغرفة.
   7. بعد العلاج ناقص التوتر، إضافة حجم مساو (4 مل) من تثبيتي في أنبوب وتخلط بلطف الحل عن طريق أنبوب للقلب.
   8. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإزالة طاف. في هذه المرحلة الخلية بيليه زيادة حجم، وتصبح بيضاء وأكثر وضوحا.
   9. إزالة طاف، إضافة 4 مل مثبت الطازجة والحفاظ على درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
   10. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق، وإزالة طاف، وإعطاء اثنين من أكثر يغسل مع تثبيتي 4 مل.
4. تنظيف الشريحة والطورية إعداد انتشار
   1. تزج الشرائح الزجاجية تماما في 10٪ المنظفات السائلة لمدة 30 دقيقة.
   2. شطف الشرائح جيدا في ماء الصنبور البارد الجاري لمدة 30 دقيقة.
   3. رينحد ذاته ينزلق ثلاث مرات مع الماء المقطر لإزالة المنظفات، وتزج في الماء المقطر، وتخزينها في الثلاجة لاستخدامها في المستقبل.
      ملاحظة: تنظيف الشرائح قبل الاستخدام يسهل توحيد الانتشار ويزيد من جودة الطورية.
   4. إسقاط تعليق خلية 10 ميكرولتر على الشريحة الرطب المبردة والسماح للهواء الجاف بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
5. تلطيخ والتركيب
   1. تجهيز 50 مل بالغيمزا حل تلطيخ عن طريق خلط جزء واحد من بالغيمزا حل وصمة عار مع جزء واحد من برنامج تلفزيوني وتصب في جرة Coplin.
   2. تزج الشرائح في حل تلطيخ لمدة 20 دقيقة.
   3. شطف الشرائح في الماء المقطر لإزالة وصمة عار الزائدة وعلى الفور تجف الشرائح باستخدام مجفف الشعر.
   4. ترك الشرائح في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
   5. تطبيق قطرة واحدة من تصاعد المتوسطة على الشريحة، ضع بلطف ساترة على المتوسطة المتزايدة، تسمح على المديين المتوسط ​​وتنتشر على الشريحة ببطء، وإزالةالمتوسط ​​الزائدة مع منشفة ورقية. السماح للشريحة التي شنت لتجف لمدة لا تقل عن 1 ساعة قبل نقل أو عرض تحت المجهر لتجنب حركة ساترة.
      تحذير: من المهم أن تضع ساترة بعناية دون تشكيل أي فقاعات خلال هذه الخطوة. لا ينصح استخدام الحرارة المفرطة لإزالة الفقاعات.
6. الملاحظة المجهرية وانحراف أنواع
   1. دراسة الاكاديمية الهيكلية في الطورية ينتشر في التكبير 100X باستخدام نوعية جيدة المجهر مشرق الميدان.
   2. تسجيل ما لا يقل عن 50 لينتشر 100 الطورية لكل مجموعة لعلاج العلاجات التي تحفز على عدد كبير من الاكاديمية. لأحجام تأثير أصغر، وينصح تحليل ما يصل الى 300 ينتشر الطورية.

النتائج

يجب توخي الحذر الشديد في اختيار الموقع من العينات TSP، فضلا عن الوقت من السنة عندما يتم تنفيذ مجموعة. التركيب الكيميائي وكذلك حجم الجسيمات قد تؤثر بشكل كبير على النتائج. المواد التي تم جمعها يجب أن تكون واضحة ضد مرشح أبيض. وهناك الفأر العادي انتشار ال?...

Discussion

وتقدم الدراسة الوراثية الخلوية أو التحليل المجهري للأرقام أو هياكل الكروموسومات، في المقام الأول في هوامش الطورية، معلومات مهمة للتشخيص وتقييم المخاطر، والعلاج لمختلف الأمراض. والآن راسخة أن تشوهات الوراثية الخلوية وترتبط مع التقدم والتطور من العديد من الأمراض، ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Total suspended particulate sampler	Tisch Environmental	TE-5170
Bruker Avance III NMR spectrometer	Bruker	NA
TopSpin 3.5/pl2 software	Bruker	NA
ACD/NMR Processor Academic Edition	ACD/Labs	NA
RAW264.7 murine macrophages	ATCC	ATCC TIB-71
High glucose DMEM GlutaMAX media	ThermoFisher	10569010	Warm in a 37 °C waterbath before use
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher	16000044	Warm in a 37 °C waterbath before use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	ThermoFisher	15140163	Warm in a 37 °C waterbath before use
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher	25200056	Warm in a 37 °C waterbath before use
PBS, pH 7.4	ThermoFisher	10010049	Warm in a 37 °C waterbath before use
KaryoMAX Colcemid Solution in PBS	ThermoFisher	15212012	Warm in a 37 °C waterbath before use
KaryoMAX Potassium Chloride Solution	ThermoFisher	10575090	Warm in a 37 °C waterbath before use
Methanol (HPLC)	Fisher Scientific	A452N1-19
Acetic Acid, Glacial	Fisher Scientific	BP1185-500
Decon Contrad 70 Liquid Detergent	Fisher Scientific	04-355-1
Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions	Fisher Scientific	23-200733
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-100
Axio Imager 2	Zeiss	NA