L&#39;analisi del particolato ambientale indotto aberrazioni cromosomiche L&#39;utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; sistema

Riepilogo

Questo protocollo descrive le tecniche per la quantificazione e la caratterizzazione delle aberrazioni cromosomiche in vitro in RAW264.7 macrofagi di topo dopo il trattamento con particolato nell'aria ambiente.

Abstract

L'esposizione al particolato (PM) è una delle principali preoccupazioni di salute mondo, che può danneggiare i vari componenti cellulari, tra cui il materiale genetico nucleare. Per valutare l'impatto del PM sull'integrità genetica nucleare, aberrazioni cromosomiche strutturali sono segnati degli spread metafase dei macrofagi del mouse RAW264.7. PM è raccolto da aria ambiente con particelle campionatore ad alto volume totale sospeso. Il materiale raccolto viene solubilizzato e filtrato per mantenere la porzione fini idrosolubile. Le particelle si caratterizzano per la composizione chimica mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR). Differenti concentrazioni di sospensione di particelle vengono aggiunti a una coltura in vitro di RAW264.7 macrofagi di topo per un tempo di esposizione di 72 ore, insieme con cellule di controllo non trattate. Alla fine dell'esposizione, la coltura viene trattata con Colcemid di arrestare le cellule in metafase. Le cellule vengono quindi raccolte, trattate con soluzione ipotonica, fissato acetomethanol, dropped su vetrini e infine colorate con la soluzione Giemsa. I vetrini sono esaminati per valutare le aberrazioni strutturali cromosomiche (CA) in metafase propagarsi 1,000X ingrandimento utilizzando un microscopio in campo chiaro. 50 a 100 diffusione metafase vengono assegnati per ciascun gruppo di trattamento. Questa tecnica è adatta per la rivelazione di aberrazioni strutturali cromosomiche (CA), come ad esempio le pause cromatidio-tipo, gli scambi cromatidi-tipo, frammenti acentrici, cromosomi dicentrici e ad anello, doppie minuti, endoreduplicazione, e le traslocazioni robertsoniane in vitro dopo l'esposizione a PM. Si tratta di un potente metodo per associare un endpoint citogenetica consolidata ad alterazioni epigenetiche.

Introduzione

E 'stato stimato che l'esposizione al particolato (PM) fa sì che oltre 3 milioni di morti in eccesso ogni anno, soprattutto per malattie cardiopolmonari e cancro ai polmoni ^1. Infatti, PM è stata riconosciuta come cancerogena per l'uomo dall'Agenzia internazionale per la ricerca sul cancro (Gruppo 1), come un aumento del rischio di cancro ai polmoni con l'aumento dei livelli di esposizione al PM è stato indicato ^2. È interessante notare che quasi tutte le cellule tumorali porto anomalie cromosomiche numeriche e / o strutturali. Particulate carbonio organico è una variante, complessa, e la miscela eterogenea, la cui composizione e distribuzione dimensione dipende emissioni nonché trasformazioni fisiche e chimiche. Esso rappresenta 35-55% del urbana PM _2,5 di massa (PM 2,5 micron di dimensione e più piccolo) e più del 60% del fondo rurale e continentale PM _2,5 di massa ^{3, 4.} rappresenta la frazione solubile in acqua per 30-90% di aerosol organico. Un gran numero di composti organicisono stati identificati, compresi gli idrocarburi alifatici, idrocarburi policiclici aromatici, e loro derivati ​​ossigenati e nitrati, aldeidi alifatici e alcoli, acidi grassi liberi e loro sali, acidi di-carbossilici, composti multifunzionali, proteine ​​e macromolecole umiche-like (HULIS) utilizzando metodi cromatografici accoppiato con tecniche di spettrometria di massa ^5-8. Questi composti rappresentano meno del 10-20% di carbonio organico particolato, quindi la maggior parte del carbonio organico è sconosciuto ^9.

Prove sperimentali suggeriscono che la citotossicità, stress ossidativo, e infiammazione sono coinvolti nello sviluppo di stati patologici PM-associati. Recentemente è stato dimostrato, tuttavia, che l'esposizione a PM traduce anche in un certo numero di alterazioni epigenetiche, comprese le alterazioni nella metilazione del DNA di elementi ripetitivi, sia sperimentale sistemi in vitro ed in soggetti umani ^10-12. Di particolare interesse sono gli effetti dellaPM DNA satellite - maggiori e minori satelliti - che si trovano nella regione heterochromatic attorno al centromero dei cromosomi. E 'stato dimostrato che questi effetti possono essere persistenti per natura, in quanto possono essere rilevati per almeno 72 ore dopo l'esposizione ^12. Alterazioni nella metilazione del DNA, in particolare intorno centromeri, possono portare ad accumulo di trascritti di mRNA DNA satellite, l'integrità cromosomica compromesso durante la divisione cellulare e, successivamente, provocare lo sviluppo di una varietà di stati patologici ^13.

Adattamento di approccio per l'analisi citogenetica di CA come end-point di alterazioni epigenetiche causati da PM, quindi, è di grande importanza. Qui, riportiamo l'approccio per il PM di raccolta e preparazione ambiente, in esposizione in vitro e analisi delle CA utilizzando il sistema murino macrofagi modello RAW264.7. I macrofagi comprendono la prima linea di difesa contro i corpi estranei inalati e, di conseguenza, tla linea cellulare serve come stabilito e il modello più utilizzato in tossicologia particelle ^{11, 12, 14, 15.}

Protocollo

1. Raccolta e preparazione delle particelle

1. La calibrazione delle particelle campionatore ad alto volume totale sospeso
   1. Scollegare il motore campionatore dal controllore di flusso di massa e collegare il motore ad una sorgente di alimentazione CA stabile (figura 1).
      Nota: Un filtro non viene utilizzato durante questa procedura.
   2. Montare l'orifizio calibratore e piastra di adattamento di carico superiore al campionatore. Serrare l'adattatore di carico dadi superiori hold-down in modo sicuro per evitare perdite d'aria sono presenti. Lasciare che il motore campionatore di riscaldarsi fino alla sua normale temperatura di esercizio (circa 10-15 minuti).
   3. Eseguire un test di tenuta coprendo i fori sulla parte superiore del rubinetto dell'orifizio e la pressione sul foro con le mani. Ascoltate per un suono acuto stridio fatta da fuoriuscita dell'aria. Se si sente questo suono, serra nuovamente le adattatori di carico dadi superiori hold-down come è presente una perdita. Se il suono è bassa, la perdita è vicino ad una delle altre guarnizioni in sysTEM.
   4. Collegate un lato di un manometro ad acqua al rubinetto pressione sul lato del foro con un tubo a vuoto di gomma. Lasciare il lato opposto del manometro aperto all'atmosfera. Tenere un manometro in verticale per garantire letture precise. Toccando retro del registratore flusso continuo contribuirà a centrare la penna e fornire letture precise.
   5. Ripetere il passaggio 1.1.2 utilizzando cinque portate che rappresentano le portate che operano da 30 a 60 ft / min (circa ogni 5-6 ft ³ / min). Regolare la manopola sul orifizio variabile a cinque diverse posizioni e prendere cinque letture diverse.
   6. Registrare la temperatura ambientale dell'aria, pressione barometrica ambiente, numero di serie campionatore, numero di serie orifizio, pendenza orifizio e intercetta con ultima data di certificazione, la data, il luogo del sito, e le iniziali dell'operatore sul foglio di calibrazione.
2. Totale raccolta particelle del campione in sospensione e analisi gravimetrica
   1. avvolgere un8 filtri in fibra di quarzo "x 10" in due strati di fogli di alluminio. Posizionare il filtro avvolta nel forno e impostare la temperatura a 550 ° C. Cuocere il filtro per almeno 4 ore. Lasciare raffreddare il forno e recuperare il filtro. Posizionare il filtro in un essiccatore con _CaCO3.
   2. Pesare il filtro in una microbilancia con precisione di 10 mg. Ripetere la misurazione per tre volte nel corso di una giornata. misurazioni individuali devono essere all'interno di 25 mcg. Se questo non è raggiunto, restituire il filtro avvolto in un essiccatore e ripetere il processo il giorno seguente.
   3. Aprire il coperchio riparo (Figura 2). Rimuovere il filtro telaio titolare allentando i quattro dadi ad alette, consentendo i bulloni in ottone e rondelle ad oscillare verso il basso fuori strada. Aprire il filtro dal foglio di alluminio, e utilizzare pinze puliti per centrare attentamente, parte più ruvida up, sullo schermo di supporto. Allineare correttamente il filtro sullo schermo.
   4. Posizionare la cornice dello schermo e fissarlo coni bulloni ottone e rondelle applicando pressione sufficiente a evitare perdite d'aria ai bordi. Pulire ogni accumulo di polvere provenienti da tutto il supporto del filtro con un panno pulito. Chiudere il coperchio riparo con cura e fissarlo.
   5. Assicurarsi che tutti i cavi siano collegati a loro appropriate prese recipiente e il tubo tra la presa di pressione motore del ventilatore e il registratore flusso continuo è collegato.
   6. Preparare il registratore di flusso. Premere penna braccio sollevatore per sollevare punto di penna e inserire un nuovo grafico. Allineare la scheda del grafico per il mozzo del registratore e premere con il pollice per abbassare il centro grafico sul mozzo. Imposta ora facendo ruotare il mozzo in senso orario fino al momento corretto sul grafico è allineato con il puntatore indice temporale.
   7. passare manualmente sul campionatore e iniziare la raccolta. Monitorare il registratore per assicurarsi che sia correttamente inchiostrazione e l'indicatore del tempo trascorso per essere sicuri che funzioni correttamente.
   8. Alla fine del periodo di campionamento, spegnere il campionatore, registrareil tempo trascorso e recuperare il grafico. Rimuovere il telaio per esporre il filtro. Rimuovere il filtro esposto dalla schermata di supporto tenendolo dolcemente alle estremità con la pinza. Piegare il filtro longitudinalmente in modo che tocchi campione campione due volte e avvolgerla in un foglio di alluminio originale.
   9. Conservare il filtro in un essiccatore con CaCO ₃ per almeno 24 ore prima della pesata. Ripetere il passo 1.2.2 per misurare il peso dei filtri dopo il prelievo. Posizionare il filtro in un sacchetto di plastica con cerniera e conservarla in -80 ° C fino al momento dell'analisi.
3. Analisi di raccolta del campione sospesi totali di particelle
   1. Recupero del filtro memorizzato, aprire il foglio di alluminio e trasferire il filtro su una superficie pulita Teflon. Utilizzando pinze e bisturi, tagliare (bianco) esterno parte del filtro e smaltire.
      1. Quindi, tagliare il filtro in 0,5 "x 0,5" pezzi e pezzi in un pallone da 100 ml. Aggiungere 50 ml di acqua ultrapura. Porre il pallone in un ultrasuonobagno e ultrasuoni per 60 minuti a 33 ± 3 kHz.
   2. Estratto del filtro attraverso un 0,45 micron filtro in polipropilene siringa per 100 ml pallone da fondo. Evaporare l'acqua usando uno strumento evaporatore rotante sotto pressione a 50 ° C fino a circa 5 ml di estratto rimane nel pallone.
      1. Evaporare l'acqua residua in 15 ml pallone a pera di peso noto. Pesare il pallone con l'estratto secco e registrare la massa dell'estratto secco.
   3. Sciogliere il campione secco con 400 ml di D ₂ O da sonicating per 15 minuti e trasferire in un tubo NMR standard di 5 mm. Centrifugare per 5 minuti a 12.000 xg a temperatura ambiente per rimuovere qualsiasi questione non disciolto.
   4. Ripetere con 300 ml di D ₂ O. Aggiungere 10 ml di NaN ₃ 1,4% (conc finale .: 0,02% w / v) nel tubo NMR. Aggiungere 10 microlitri (32 ug) di polveri totali sospese (TSP) -d4 (3,2 mg / ml) di D ₂ O (concentrazione finale 0,258 mM) nel tubo NMR.
   5. Acquisire ¹ spettri H NMR utilizzando uno spettrometro NMR operante a 600,17 MHz.
      1. Inserire il tubo NMR nella cryoprobe tripla risonanza. Calibrare lo strumento nel seguente ordine: serratura, sintonia, lo spessore, la calibrazione lunghezza impulso a 90 ° e la regolazione guadagno del ricevitore.
      2. Misurare spettri a 25 ° C con un 1 D sequenza di eccitazione scultura con 180 impulsi selettivi-acqua in modalità di rilevamento Quad digitale, 8.192 scansioni, 4 scansioni fittizi, larghezza spazzata di 8012,57 Hz, frequenza di offset per la soppressione del segnale dell'acqua fissato a 4,70 ppm, 1,70 sec tempo di acquisizione, 32.768 punti di dati in tempo dominio (TD), 1 msec durata gradiente (P16), 100 msec ritardare il recupero dopo il gradiente (d16).
   6. Processo ¹ H NMR spectra applicando un allargamento linea di 1 Hz e riempimento di zero per un fattore 2 (65.536 punti dati). Correggere la fase e linea di base manuale e integrare. Set TSP-d4 picco a 0,0 ppm.

Esposizione 2. particelle

1. Cultura istituito
   1. mezzi di crescita completo caldo contenente 10% di siero fetale bovino (FBS) e la soluzione di penicillina-streptomicina (100 U / ml), soluzione di tripsina 0,25% e magnesio calcio libero tampone fosfato salino (PBS) in un bagno d'acqua (a 37 ° C) per almeno 30 minuti prima dell'inizio della cultura.
   2. Estrarre un pallone T75 dal 5% di CO ₂ incubatore contenente cellule in coltura RAW264.7 e lavare le cellule con 2 ml di pre-riscaldato PBS due volte.
   3. Staccare le cellule aderenti RAW264.7 dal fondo del recipiente di coltura tissutale con 1 ml di soluzione di pre-riscaldato tripsina seguite da raschiare.
   4. Raccogliere le cellule dal recipiente di coltura tissutale e fare una sospensione singola cella pipettando ripetutamente. Contare il numero di cellule con trypan blu e la piastra ad una densità di 8.000 / cm ² (500.000 cellule totali) in un tessuto coltura piatto 100 mm con supporti completa pre-riscaldato. Regolare volume di supporto a 10 ml per una concentrazione finale di 50.000 celluleper ml.
      NOTA: il doppio del numero di piastre se viene eseguita anche l'analisi della metilazione del DNA.
   5. Mettere le cellule RAW264.7 recente placcato indietro nel 5% di CO ₂ incubatore a 37 ° C e permettono di collegare per 24 ore.
   6. Anche in un armadio biosicurezza, risospendere le particelle filtrate. Ad esempio, diluire particelle ad una concentrazione di 0,5 mg / ml in PBS sterile per una dose di trattamento 5 ug / ml e 5 mg / ml per una dose di trattamento 50 ug / ml. Le diluizioni possono essere preparate fino a mese in anticipo e conservati a -80 ° C.
2. Il trattamento con particolato
   1. Estrarre le cellule dal 5% di CO ₂ incubatore e visualizzate a 10 ingrandimenti utilizzando un microscopio invertito per la crescita cellulare, la morfologia delle cellule, la condizione della cultura, e la contaminazione. Si dovrebbe aspettare di avere almeno il 30% di cellule confluenti in questa fase.
   2. Asetticamente, aspirare i media con una pipetta sterile e lavare il recipiente di coltura con 2 ml 37 ° C PBSdue volte per rimuovere completamente i mezzi di comunicazione e le cellule galleggianti o morti.
   3. Aggiungere dosaggio predeterminato di particolato con mezzi freschi nei recipienti di coltura e incubare per tempo desiderato a 37 ° C in 5% CO ₂ incubatore. In questo studio, il trattamento di cellule RAW264.7 con PM per 72 ore in parallelo all'esposizione utilizzato per l'analisi genotossico e epigenotoxic concorrente.
      NOTA: La citotossicità può influire negativamente sulla qualità delle analisi citogenetica. Pertanto, saggi aggiuntivi come citotossicità, metilazione del DNA, Western blotting, o analisi di espressione genica sono tipicamente eseguite su cellule trattate. Esporre le cellule come descritto e procedere con il test specifico desiderato. Gli utenti inesperti possono anche voler includere un controllo positivo, come metansulfonato metile per testare la loro capacità di rilevare CA.

3. test citogenetico

1. Il trattamento di arrestare le cellule in metafase
   1. Scaldare il Colcemid cosìluzione (10 ug / ml) in un bagno di acqua a 37 ° C per 30 min. Pulire il coperchio con il 70% di alcool sotto un armadio biosicurezza per minimizzare il rischio di contaminazione
   2. Rimuovere completamente i mezzi di comunicazione in modo asettico e lavare i recipienti di coltura con 2 ml di pre-riscaldato PBS due volte.
   3. Aggiungere mezzi freschi pre-riscaldato (2 ml supporti / 10 ⁶ celle) contenenti soluzione Colcemid (5 ml / ml) nel recipiente di coltura e incubare per 2 ore.
2. la raccolta delle cellule
   1. soluzione tripsina caldo e PBS in un bagno d'acqua mantenuto a 37 ° C per 30 min. Da questo punto in poi, non vi è alcuna necessità di mantenere condizioni asettiche.
   2. Rimuovere completamente i media, lavare i recipienti di coltura con 2 ml 37 ° C PBS per due volte, aggiungere il volume richiesto di soluzione pre-riscaldato tripsina (di solito 2 ml per 60 millimetri piatto cultura o pallone T25 e 4 ml per piatto 100 mm o pallone T75 ), e posizionare il recipiente di coltura nel 5% CO ₂ incubatore a 37 ° C per 1 min.
   3. Take il recipiente di coltura, staccare le cellule con un raschietto, e aggiungere 10 ml di PBS per fermare l'azione tripsina.
   4. Pipetta su e giù per almeno dieci volte per fare sospensione cellulare unico e le cellule di trasferimento in un 15 ml conica tubo fondo centrifuga.
   5. sospensione cellulare Centrifugare a 400 xg per 5 min in un'oscillazione fuori centrifuga a temperatura ambiente.
   6. Rimuovere il surnatante, rompere il pellet cellulare con lievi colpetti, aggiungere 10 ml di PBS, e di nuovo centrifugare per cinque minuti.
3. Trattamento ipotonico e la fissazione
   1. Pre-warm 0,075 M soluzione di cloruro di potassio in un bagnomaria a 37 ° C per almeno 30 min.
   2. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet cellulare e lasciare circa 0,5 ml di PBS.
   3. rompere delicatamente il pellet di cellule e rendere la sospensione singola cella utilizzando una pipetta P200.
   4. Aggiungere 4 ml di soluzione di cloruro di potassio goccia pre-riscaldato a goccia agitando delicatamente.
   5. Incubare le cellule a ipotonica psoluzione di cloruro otassium a bagnomaria C 37 ° per 20 min.
   6. Fai la soluzione acetomethanol fresco con l'aggiunta di 3 parti metanolo con acido acetico glaciale 1-parte. Tenere questo fissativo appena preparato a temperatura ambiente.
   7. Dopo il trattamento ipotonico, aggiungere un volume uguale (4 ml) di fissativo nel tubo e mescolare delicatamente la soluzione capovolgendo la provetta.
   8. Centrifugare a 400 xg per 5 min a temperatura ambiente, e rimuovere il surnatante. A questo aumento delle dimensioni pellet cellulare palco, diventano biancastre e più visibile.
   9. Rimuovere il surnatante, aggiungere 4 ml di fissativo aperta e mantenerlo a temperatura ambiente per 30 min.
   10. Centrifugare a 400 xg per 5 minuti, rimuovere il surnatante, e dare più due lavaggi con 4 ml di fissativo.
4. Pulizia scivolo e preparazione diffusione metafase
   1. Immergere vetrini completamente in 10% di detergente liquido per 30 min.
   2. Sciacquare i vetrini completamente in acqua fredda rubinetto aperto per 30 minuti.
   3. Rinse vetrini tre volte con acqua distillata per rimuovere completamente il detersivo, immergere in acqua distillata, e conservare in frigorifero per uso futuro.
      NOTA: scivoli pulizia prima dell'uso facilita uniformità di applicazione e aumenta la qualità metafase.
   4. Goccia sospensione cellulare 10 microlitri sul vetrino bagnato freddo e lasciarlo all'aria asciugare per una notte a temperatura ambiente.
5. Colorazione e montaggio
   1. Preparare 50 ml di soluzione colorante Giemsa mescolando una parte della soluzione colorante Giemsa con una parte di PBS e versare in una vaschetta Coplin.
   2. Immergere i vetrini nella soluzione colorante per 20 min.
   3. Sciacquare i vetrini in acqua distillata per rimuovere l'eccesso macchia e immediatamente asciugare le diapositive utilizzando un asciugacapelli.
   4. Lasciare le diapositive a temperatura ambiente per una notte.
   5. Applicare una sola goccia di mezzo di montaggio sul vetrino, inserire delicatamente un coprioggetto sul mezzo di montaggio, consentono il supporto di diffondere sul vetrino lentamente, e rimuovereil mezzo eccesso con un tovagliolo di carta. Lasciare che il vetrino montato ad asciugare per almeno 1 ora prima di spostare o la visualizzazione al microscopio per evitare movimenti del vetrino.
      Attenzione: è importante mettere il vetrino accuratamente senza formare eventuali bolle durante questa fase. L'uso del calore eccessivo per rimuovere bolle non è raccomandato.
6. Tipi osservazione al microscopio e di aberrazione
   1. Esaminare le CA strutturali in metafase si diffonde a ingrandimento 100X utilizzando un campo chiaro microscopio di buona qualità.
   2. Segna almeno 50 a 100 metafase diffonde per ciascun gruppo di trattamento per i trattamenti che inducono un gran numero di CA. Per dimensioni dell'effetto più piccoli, si consiglia l'analisi di un massimo di 300 spread metafase.

Risultati

Grande attenzione dovrebbe essere presa nella scelta della posizione del campionatore TSP, nonché il tempo dell'anno in cui viene eseguita la raccolta. La composizione chimica e le dimensioni delle particelle possono influenzare notevolmente i risultati. Il materiale raccolto deve essere visibile contro il filtro bianco. Un normale del mouse metafase diffusione avrà 40 cromosomi acentrici. L'obiettivo della tecnica è quello di dimostrare un cambiamento (o assenza) nella propor...

Discussione

studio citogenetica o analisi microscopica dei numeri o strutture di cromosomi, soprattutto in spread metafase, fornisce informazioni cruciali per la prognosi, la valutazione del rischio, e il trattamento per varie malattie. E 'ormai ben stabilito che le anomalie citogenetiche sono collegati con la progressione e lo sviluppo di diverse malattie, compreso il cancro. Fino ad oggi, le CA sono stati trovati in tutti i principali tipi di tumore. CA può sorgere spontaneamente o da entrambi gli stimoli esterni o interni, ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Total suspended particulate sampler	Tisch Environmental	TE-5170
Bruker Avance III NMR spectrometer	Bruker	NA
TopSpin 3.5/pl2 software	Bruker	NA
ACD/NMR Processor Academic Edition	ACD/Labs	NA
RAW264.7 murine macrophages	ATCC	ATCC TIB-71
High glucose DMEM GlutaMAX media	ThermoFisher	10569010	Warm in a 37 °C waterbath before use
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher	16000044	Warm in a 37 °C waterbath before use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	ThermoFisher	15140163	Warm in a 37 °C waterbath before use
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher	25200056	Warm in a 37 °C waterbath before use
PBS, pH 7.4	ThermoFisher	10010049	Warm in a 37 °C waterbath before use
KaryoMAX Colcemid Solution in PBS	ThermoFisher	15212012	Warm in a 37 °C waterbath before use
KaryoMAX Potassium Chloride Solution	ThermoFisher	10575090	Warm in a 37 °C waterbath before use
Methanol (HPLC)	Fisher Scientific	A452N1-19
Acetic Acid, Glacial	Fisher Scientific	BP1185-500
Decon Contrad 70 Liquid Detergent	Fisher Scientific	04-355-1
Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions	Fisher Scientific	23-200733
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-100
Axio Imager 2	Zeiss	NA