Analyse de la Aberrations chromosomiques Ambient particules induite par l&#39;aide d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; système

Résumé

Ce protocole décrit des techniques pour la quantification et la caractérisation des aberrations chromosomiques in vitro dans les macrophages murins RAW264.7 après le traitement avec la matière particulaire de l' air ambiant.

Résumé

L'exposition aux matières particulaires (PM) est un problème majeur de santé dans le monde, ce qui peut endommager divers composants cellulaires, y compris le matériel génétique nucléaire. Pour évaluer l'impact des PM sur l'intégrité génétique nucléaire, des aberrations chromosomiques structurelles sont notées dans les spreads métaphase de cellules macrophages RAW264.7 de la souris. PM est recueillie à partir de l'air ambiant avec un échantillonneur de particules totale de volume élevé suspendu. Le matériel recueilli est solubilisé et filtré pour retenir la portion bien soluble dans l'eau. Les particules sont caractérisées par la composition chimique par résonance magnétique nucléaire (RMN). Différentes concentrations de suspension de particules sont ajoutés sur une culture in vitro de macrophages de souris RAW264.7 pendant une durée totale d'exposition de 72 heures, ainsi que des cellules témoins non traitées. A la fin de l'exposition, la culture est traitée avec colcémide pour arrêter les cellules en métaphase. Les cellules sont ensuite récoltées, traitées avec une solution hypotonique, fixée dans acetomethanol, dropped sur des lames de verre et enfin colorées avec une solution Giemsa. Les lames sont examinées pour évaluer les aberrations chromosomiques structurelles (CA) en métaphase se propage à 1,000X grossissement à l'aide d'un microscope à champ clair. 50 à 100 métaphase propagation sont marqués pour chaque groupe de traitement. Cette technique est adaptée pour la détection des aberrations de structure chromosomiques (CA), tels que les pauses de type chromatide, des échanges de type chromatide, des fragments acentriques, chromosomes dicentriques et anneaux, doubles minutes, endoreduplication et translocations in vitro après l' exposition au PM. Il est une méthode puissante pour associer un critère d'évaluation cytogénétique bien établie de modifications épigénétiques.

Introduction

Il a été estimé que l' exposition aux particules (PM) provoque plus de 3 millions de décès supplémentaires par an, principalement de maladies cardio - pulmonaires et le cancer du poumon ^1. En effet, PM a été reconnu comme cancérogène pour l' homme par l'Agence internationale pour la recherche sur le cancer (Groupe 1), a montré un risque accru de cancer du poumon avec l' augmentation des niveaux d'exposition aux PM ^2. Fait intéressant, presque toutes les cellules cancéreuses abritent des anomalies chromosomiques numériques et / ou structurelles. carbone organique particulaire est une variante, complexe et mélange hétérogène, dont la composition et la taille de distribution dépend des émissions ainsi que des transformations physiques et chimiques. Il représente 35-55% des zones urbaines masse des PM _2,5 (PM 2,5 um et moins) et plus de 60% du milieu rural et continental PM _2,5 masse ^{3, 4.} représente la fraction soluble dans l'eau pour 30-90% des aérosols organiques. Un grand nombre de composés organiquesont été identifiées, y compris les hydrocarbures aliphatiques, les hydrocarbures aromatiques polycycliques et leurs dérivés oxygénés et nitrés, des aldéhydes et des alcools aliphatiques, des acides gras libres et leurs sels, les acides di-carboxyliques, des composés multifonctionnels, des protéines et macromolécules humiques-like (HULIS) en utilisant des méthodes chromatographiques associées à des techniques de spectrométrie de masse ^5-8. Ces composés représentent moins de 10-20% de carbone organique particulaire, donc la plupart du carbone organique est inconnu ^9.

Des preuves expérimentales suggèrent que la cytotoxicité, le stress oxydatif et l'inflammation sont impliqués dans le développement d'états pathologiques associés PM-. Il a été récemment montré, cependant, que l' exposition aux particules entraîne également un certain nombre de modifications épigénétiques, y compris des altérations de méthylation de l' ADN d'éléments répétitifs, à la fois expérimental dans des systèmes in vitro et chez des sujets humains ^10-12. D'un intérêt particulier sont les effetsPM sur l'ADN par satellite - grands et petits satellites - qui se trouvent dans la région hétérochromatique autour du centromère des chromosomes. Il a été montré que ces effets peuvent être persistants par la nature, car ils peuvent être détectés pendant au moins 72 heures après l' exposition ^12. Les modifications de méthylation de l' ADN, en particulier autour de centromères, peuvent entraîner une accumulation de transcrits d'ARNm d'ADN par satellite, l' intégrité chromosomique de compromis lors de la division cellulaire et, par la suite, se traduire par le développement d'une variété d'états pathologiques ^13.

Adaptation de l'approche cytogénétique pour l'analyse des CA en tant que point final des altérations épigénétiques causés par PM, donc, est d'une grande importance. Nous rapportons ici l'approche de la collecte de PM ambiante et de la préparation, l'exposition in vitro et l' analyse des CA en utilisant le système de modèle de RAW264.7 de macrophage murin. Macrophages comprennent la première ligne de défense contre les corps étrangers inhalés et, par conséquent, tsa lignée cellulaire sert d'établi et le modèle le plus fréquemment utilisé en toxicologie des particules ^{11, 12, 14, 15.}

Protocole

1. Collecte de particules et préparation

1. Calibration des particules sampler total élevé du volume suspendu
   1. Déconnecter le moteur d'échantillonnage du régulateur de débit massique et de connecter le moteur à une source d'alimentation en courant alternatif stable (figure 1).
      REMARQUE: Un filtre est pas utilisé pendant cette procédure.
   2. Monter l'orifice du calibrateur et chargement par le dessus plaque d'adaptation à l'échantillonneur. Serrer l'adaptateur de chargement top écrous de fixation en toute sécurité pour assurer qu'aucune fuite d'air sont présents. Permettre au moteur de l'échantillonneur se réchauffer à la température normale de fonctionnement (environ 10-15 min).
   3. Effectuer un test de fuite en couvrant les trous sur le dessus de l'orifice et la pression du robinet sur l'orifice avec les mains. Écoutez un son crissement aigu fait en échappant l'air. Si ce bruit se fait entendre, resserrez l'adaptateur de chargement top écrous de fixation comme une fuite est présente. Si le son est plus faible, la fuite est proche de l'un des autres joints dans le system.
   4. Connecter un côté d'un manomètre à eau au robinet de pression sur le côté de l'orifice d'un tube à vide en caoutchouc. Laisser le côté opposé du manomètre ouvert à l'atmosphère. Tenir un manomètre verticalement pour assurer des lectures précises. En appuyant sur le dos de l'enregistreur de flux continu contribuera à centrer la plume et de fournir des lectures précises.
   5. Répétez l' étape 1.1.2 en utilisant cinq débits représentant exploitation des débits de 30 à 60 ft / min (environ tous les 5-6 pi ³ / min). Réglez le bouton sur l'orifice variable à cinq positions différentes et prendre cinq lectures différentes.
   6. Enregistrer la température de l'air ambiant, la pression barométrique ambiante, le numéro de série sampler, le numéro de série de l'orifice, orifice pente et l'intersection avec la dernière date certifiée, la date, l'emplacement du site, et les initiales de l'opérateur sur la feuille d'étalonnage.
2. Collection suspendue de l' échantillon de particules Total et analyse gravimétrique
   1. Envelopper un8 "x 10" filtre à fibres de quartz à deux couches de feuille d'aluminium. Placer le filtre enveloppé dans le four et réglez la température à 550 ° C. Cuire le filtre pendant au moins 4 heures. Laissez le four refroidir et récupérer le filtre. Placez le filtre dans le dessiccateur avec _CaCO3.
   2. Peser le filtre dans une microbalance avec une précision de 10 ug. Répétez la mesure à trois reprises au cours d'une journée. Mesures individuelles devraient être à moins de 25 pg. Si ce n'est pas atteint, retourner le filtre enveloppé dans le dessiccateur et répétez le processus le jour suivant.
   3. Ouvrez le couvercle du logement (Figure 2). Retirer le cadre de support du filtre en desserrant les écrous à oreilles quatre, ce qui permet les boulons en laiton et rondelles pour basculer vers le bas de la route. Déplier le filtre de la feuille d'aluminium, et l'utilisation de pinces nettoyées pour centrer soigneusement, côté rugueux haut, sur l'écran à l'appui. Aligner correctement le filtre à l'écran.
   4. Placez le cadre sur l'écran et le fixer avecles boulons et les rondelles en laiton tout en appliquant une pression suffisante pour éviter les fuites d'air au niveau des bords. Essuyez toute accumulation de poussière à travers le porte-filtre avec un chiffon propre. Fermer l'abri couvercle soigneusement et fixez-le.
   5. Assurez-vous que tous les cordons sont branchés dans leurs prises de récipients appropriés et le tube entre la prise de pression du moteur du ventilateur et l'enregistreur de flux continu est connecté.
   6. Préparer l'enregistreur de flux. Enfoncer stylo bras de levage pour élever le point de stylo et insérez une nouvelle carte. Aligner l'onglet du graphique pour le moyeu d'entraînement de l'enregistreur et appuyez avec le pouce pour abaisser le centre de la carte sur le moyeu. Régler l'heure en tournant le moyeu d'entraînement aiguilles d'une montre jusqu'à ce que l'heure correcte sur le graphique est aligné avec l'index de temps pointeur.
   7. commuter manuellement sur l'échantillonneur et commencer la collection. Surveiller l'enregistreur pour être sûr qu'il est correctement encrage et l'indicateur de temps écoulé pour être sûr qu'il fonctionne correctement.
   8. A la fin de la période d'échantillonnage, éteignez l'échantillonneur, recordle temps écoulé et récupérer le tableau. Retirez le cadre pour exposer le filtre. Retirer le filtre exposé à partir de l'écran de support en le tenant délicatement aux extrémités avec la pince. Plier le filtre de la longueur de telle sorte que l'échantillon touche l'échantillon deux fois et l'envelopper dans du papier d'aluminium d'origine.
   9. Conservez le filtre dans un dessiccateur avec _CaCO3 pendant au moins 24 heures avant la pesée. Répétez l'étape 1.2.2 pour mesurer le poids des filtres après l'échantillonnage. Placer le filtre dans un sac en plastique zip et le stocker dans -80 ° C jusqu'à l'analyse.
3. L' analyse de l' échantillon recueilli en suspension des particules
   1. Récupérer le filtre stocké, déplier la feuille d'aluminium et transférer le filtre sur une surface de Teflon propre. En utilisant des pinces et scalpel, couper (blanc) partie extérieure du filtre et d'en disposer.
      1. Ensuite, coupez le filtre à 0,5 "x 0,5" morceaux et placer des morceaux dans un flacon de 100 ml. Ajouter 50 ml d'eau ultrapure. Placer la fiole dans une échographiebaignoire et sonication pendant 60 min à 33 ± 3 kHz.
   2. extrait de filtre à travers un filtre en polypropylène de seringue de 0,45 um à 100 ml de ballon à fond rond. Évaporer l'eau en utilisant un instrument évaporateur rotatif sous pression à 50 ° C jusqu'à environ 5 ml d'extrait reste dans le ballon.
      1. Évaporer l'eau résiduelle dans un flacon de 15 ml en forme de poire de poids connu. Peser le ballon avec l'extrait sec et enregistrer la masse de l'extrait sec.
   3. Dissoudre l'échantillon sec avec 400 ul de D ₂ O par sonication pendant 15 min et transférer dans un tube de RMN classique de 5 mm. Centrifuger pendant 5 minutes à 12.000 xg à température ambiante pour éliminer toute matière non dissoute.
   4. Répéter avec 300 pi de D ₂ O. Ajouter 10 pl de _NaN3 1,4% (de conc .: 0,02% p / v) dans le tube RMN. Ajouter 10 ul (32 ug) du total des particules en suspension (PTS) -d4 (3,2 mg / ml) à D ₂ O (concentration finale de 0,258 mM) dans le tube RMN.
   5. Acquérir les spectres ¹ H RMN en utilisant un spectromètre de RMN fonctionnant à 600,17 MHz.
      1. Insérez RMN tube dans la cryosonde triple résonance. Calibrer l'appareil dans l'ordre suivant: verrouillage, air, shim, calibrage de longueur 90 ° d'impulsion et de réglage de gain du récepteur.
      2. Mesure des spectres à 25 ° C avec une séquence d'excitation de la sculpture 1 D en utilisant 180 impulsions sélectives d'eau en mode de détection Quad numérique, 8192 scans, 4 scans factices, largeur de balayage de 8012,57 Hz, décalage de fréquence pour la suppression du signal de l'eau fixé à 4,70 ppm, 1,70 sec temps d'acquisition, des points de données de domaine 32.768 de temps (TD), 1 msec gradient de durée (p16), 100 microsecondes retard de récupération après gradient (d16).
   6. Procédé de spectres ¹ H - RMN par application d' un élargissement des raies de 1 Hz et de remplissage zéro par un facteur de 2 (65.536 points de données). Corrigez la phase et la ligne de base manuellement et à intégrer. Set TSP-d4 pic à 0,0 ppm.

2. L'exposition des particules

1. Culture a mis en place
   1. un milieu de croissance complet chaud contenant 10% de sérum de fœtus bovin (FBS) et d'une solution de pénicilline-streptomycine (100 U / ml), une solution de trypsine à 0,25% et de magnésium et de calcium libre du tampon phosphate salin (PBS) dans un bain d'eau (à 37 ° C) au moins 30 min avant initiation de la culture.
   2. Prendre un flacon T75 de 5% de CO ₂ incubateur contenant des cellules cultivées RAW264.7 et laver les cellules avec 2 ml de PBS deux fois préchauffée.
   3. Déloger les cellules adhérentes RAW264.7 du fond du récipient de culture tissulaire en utilisant 1 ml de solution préchauffée de la trypsine, suivie par grattage.
   4. Recueillir les cellules du tissu récipient de culture et faire une suspension cellulaire unique par pipetage répété. Comptez le nombre de cellules avec du bleu trypan et de la plaque à une densité de 8000 / cm ² (500 000 cellules totales) dans une boîte de culture tissulaire de 100 mm avec un milieu complet préchauffé. Ajuster le volume de média à 10 ml pour une concentration finale de 50.000 cellulespar ml.
      NOTE: Doubler le nombre de plaques si l'analyse de méthylation d'ADN est également effectuée.
   5. Placez les cellules RAW264.7 nouvellement plaquées retour dans 5% de CO ₂ incubateur à 37 ° C et laisser attacher pendant 24 heures.
   6. Aussi dans une enceinte de sécurité biologique, resuspendre particules filtrées. Par exemple, on dilue des particules à une concentration de 0,5 mg / ml dans du PBS stérile pour une dose de traitement de 5 pg / ml et 5 mg / ml pour une dose de traitement à 50 pg / ml. Des dilutions peuvent être préparées à l'avance mois et stockés à -80 ° C.
2. Le traitement avec les matières particulaires
   1. Sortez les cellules de 5% de CO ₂ incubateur et vérifier sous un grossissement de 10x à l' aide d' un microscope inversé pour la croissance cellulaire, la morphologie des cellules, l' état de la culture, et la contamination. On devrait attendre d'avoir au moins 30% de cellules confluentes à ce stade.
   2. Aseptiquement, aspirer le support en utilisant une pipette stérile et laver le récipient de culture avec 2 ml de PBS à 37 ° Cdeux fois pour éliminer complètement les médias et les cellules flottantes ou morts.
   3. Ajouter dose prédéterminée de la matière particulaire avec un milieu frais dans les récipients de culture et incuber pendant le temps désiré à 37 ° C dans 5% de CO ₂ incubateur. Dans cette étude, le traitement des cellules avec RAW264.7 PM pendant 72 heures à l'exposition parallèle utilisé pour l'analyse génotoxique et epigenotoxic concurrente.
      NOTE: La cytotoxicité peut affecter négativement la qualité de l'analyse cytogénétique. Par conséquent, des essais supplémentaires, tels que la cytotoxicité, la méthylation d'ADN, transfert de Western, ou une analyse d'expression génique sont généralement effectuées sur des cellules traitées. Exposer les cellules comme décrit et procéder à l'analyse spécifique souhaitée. Les utilisateurs inexpérimentés peuvent également inclure un contrôle positif tel que le méthanesulfonate de méthyle pour tester leur capacité à détecter les CA.

3. Essai cytogénétique

1. Traitement pour arrêter les cellules à la métaphase
   1. Chauffer le colcémide donclution (10 pg / ml) dans un bain d'eau à 37 ° pendant 30 min. Essuyez le couvercle avec 70% d'alcool sous une armoire de biosécurité pour minimiser le risque de contamination
   2. Enlever complètement les médias aseptique et laver les récipients de culture avec 2 ml préchauffée PBS deux fois.
   3. Ajouter un milieu frais préchauffé (2 ml de milieu / 10 ⁶ cellules) contenant une solution colcémide (5 pl / ml) dans le récipient de culture et incuber pendant 2 heures.
2. Récolte cellulaire
   1. solution de trypsine chaud et PBS dans un bain d'eau maintenu à 37 ° C pendant 30 min. A partir de cette étape en avant, il n'y a pas besoin de maintenir des conditions aseptiques.
   2. Enlever complètement les médias, laver les récipients de culture avec 2 ml 37 ° C PBS deux fois, ajouter du volume requis de solution préchauffée trypsine (généralement 2 ml pour 60 mm boîte de culture ou T25 flacon et 4 ml pour boîte de 100 mm ou flacon T75 ), et placer le récipient de culture avant 5% de CO ₂ incubateur à 37 ° C pendant 1 min.
   3. Take le récipient de culture, détacher les cellules à l'aide d'un grattoir, et ajouter 10 ml de PBS pour arrêter l'action de la trypsine.
   4. Pipette haut et bas au moins dix fois pour faire suspension cellulaire unique et les cellules de transfert dans un tube conique de fond de centrifugeuse de 15 ml.
   5. suspension de cellules Centrifugeuse à 400 xg pendant 5 min dans une balançoire en centrifugeuse à température ambiante.
   6. Retirer le surnageant, briser le culot cellulaire en tapotant doucement, ajouter 10 ml de PBS, et encore centrifuger pendant cinq minutes.
3. Traitement hypotonique et la fixation
   1. Préchauffer la solution de chlorure de potassium 0,075 M dans un bain d'eau à 37 ° au moins pendant 30 minutes.
   2. Retirer le surnageant sans perturber le culot cellulaire et laisser environ 0,5 ml de PBS.
   3. casser doucement le culot de cellules et de faire suspension cellulaire unique à l'aide d'une pipette P200.
   4. Ajouter 4 ml de solution goutte préchauffée de chlorure de potassium à goutte en agitant doucement.
   5. Incuber les cellules p hypotoniqueune solution de chlorure otassium dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 20 min.
   6. Faire une solution de acetomethanol en ajoutant de 3-parties de methanol avec de l'acide acétique glacial 1-partie. Gardez ce fixateur fraîchement préparé à la température ambiante.
   7. Après un traitement hypotonique, ajouter un volume égal (4 ml) de fixatif dans le tube et mélanger doucement la solution en inversant le tube.
   8. Centrifuger à 400 g pendant 5 min à température ambiante, et retirer le surnageant. A cette cellule à granulés de stade taille augmente, devenir blanchâtre et plus visible.
   9. Retirer le surnageant, ajouter 4 ml de fixateur et la maintenir à la température ambiante pendant 30 min.
   10. Centrifuger à 400 g pendant 5 minutes, retirer le surnageant et donnent encore deux lavages avec 4 ml de fixatif.
4. Faites glisser le nettoyage et la préparation métaphase de propagation
   1. Immerger les lames de verre complètement dans 10% de détergent liquide pendant 30 min.
   2. Rincer les lames à fond dans l'eau du robinet froide pendant 30 min.
   3. Rinse glisse trois fois avec de l'eau distillée pour éliminer complètement le détergent, plonger dans l'eau distillée, et stocker dans le réfrigérateur pour une utilisation future.
      REMARQUE: Le nettoyage des lames avant utilisation facilite l'uniformité de propagation et augmente la qualité de la métaphase.
   4. Déposer 10 ul suspension de cellules sur la lame humide froide et le laisser à l'air sécher pendant la nuit à la température ambiante.
5. Coloration et montage
   1. Préparer 50 ml de solution de coloration Giemsa en mélangeant une partie de la solution de Giemsa avec une partie de PBS et verser dans un bocal de Coplin.
   2. Plonger les lames dans une solution de coloration pendant 20 minutes.
   3. Rincer les lames dans de l'eau distillée pour éliminer l'excès de colorant et sécher immédiatement les lames en utilisant un sèche-cheveux.
   4. Laisser les lames à la température ambiante pendant une nuit.
   5. Appliquer une seule goutte de milieu de montage sur la diapositive, placez doucement une lamelle sur le support de montage, permettent le moyen de se propager sur la lame lentement et enleverle moyen excès avec une serviette en papier. Laisser la lame montée à sécher pendant au moins 1 h avant de se déplacer ou regarder sous un microscope pour éviter tout mouvement de la lamelle.
      Attention: Il est important de placer soigneusement la lamelle sans former de bulles lors de cette étape. L'utilisation de la chaleur excessive pour éliminer les bulles n'est pas recommandé.
6. Types d'observation microscopique et aberration
   1. Examiner les CA structurelles en métaphase se propage au grossissement 100X au moyen d'un champ lumineux microscope de bonne qualité.
   2. Score au moins 50 à 100 métaphase se propage pour chaque groupe de traitement pour les traitements qui induisent un grand nombre de CA. Pour les petites tailles d'effet, l'analyse de jusqu'à 300 spreads métaphase est conseillé.

Résultats

Un grand soin doit être pris dans le choix de l'emplacement de l'échantillonneur de TSP, ainsi que le temps de l'année où la collecte est effectuée. La composition chimique, ainsi que la taille des particules peuvent influencer sensiblement les résultats. Le matériel collecté doit être visible contre le filtre blanc. Une métaphase propagation de la souris normale aura 40 chromosomes acentriques. L'objectif de cette technique est de démontrer une modification (o...

Discussion

étude cytogénétique ou analyse microscopique des nombres ou des structures de chromosomes, principalement dans les écarts de métaphase, fournit des informations cruciales pour le pronostic, l'évaluation des risques, et le traitement de diverses maladies. Il est maintenant bien établi que les anomalies cytogénétiques sont liées à la progression et le développement de plusieurs maladies, y compris le cancer. À ce jour, les CA ont été trouvés dans tous les types de tumeurs majeurs. Les CA peuvent surven...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Total suspended particulate sampler	Tisch Environmental	TE-5170
Bruker Avance III NMR spectrometer	Bruker	NA
TopSpin 3.5/pl2 software	Bruker	NA
ACD/NMR Processor Academic Edition	ACD/Labs	NA
RAW264.7 murine macrophages	ATCC	ATCC TIB-71
High glucose DMEM GlutaMAX media	ThermoFisher	10569010	Warm in a 37 °C waterbath before use
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher	16000044	Warm in a 37 °C waterbath before use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	ThermoFisher	15140163	Warm in a 37 °C waterbath before use
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher	25200056	Warm in a 37 °C waterbath before use
PBS, pH 7.4	ThermoFisher	10010049	Warm in a 37 °C waterbath before use
KaryoMAX Colcemid Solution in PBS	ThermoFisher	15212012	Warm in a 37 °C waterbath before use
KaryoMAX Potassium Chloride Solution	ThermoFisher	10575090	Warm in a 37 °C waterbath before use
Methanol (HPLC)	Fisher Scientific	A452N1-19
Acetic Acid, Glacial	Fisher Scientific	BP1185-500
Decon Contrad 70 Liquid Detergent	Fisher Scientific	04-355-1
Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions	Fisher Scientific	23-200733
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-100
Axio Imager 2	Zeiss	NA