El análisis de la inducida por la materia particulada ambiental aberraciones cromosómicas El uso de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Sistema

Resumen

Este protocolo describe las técnicas para la cuantificación y caracterización de aberraciones cromosómicas in vitro en macrófagos de ratón RAW264.7 después del tratamiento con la materia en partículas del aire ambiente.

Resumen

La exposición a la materia particulada (PM) es un problema de salud mundial importante, lo que puede dañar varios componentes celulares, incluyendo el material genético nuclear. Para evaluar el impacto de la PM en la integridad genética nuclear, aberraciones cromosómicas estructurales se anotaron en los diferenciales de metafase de células de macrófagos de ratón RAW264.7. PM se recoge del aire ambiente, con un muestreador de partículas suspendidas totales alto volumen. El material recogido se solubiliza y se filtra para retener la porción fina soluble en agua. Las partículas se caracterizan por la composición química por resonancia magnética nuclear (RMN). Diferentes concentraciones de suspensión de partículas se añaden a un cultivo in vitro de macrófagos de ratón RAW264.7 durante un tiempo total de exposición de 72 horas, junto con las células de control no tratadas. Al final de la exposición, la cultura es tratada con colcemid para detener las células en metafase. Las células son luego recolectadas, tratados con solución hipotónica, fijado en acetomethanol, dropped en portaobjetos de vidrio y finalmente se tiñeron con solución de Giemsa. Los portaobjetos se examinaron para evaluar las aberraciones cromosómicas estructurales (AC) en metafase se propaga por el aumento de 1.000X utilizando un microscopio de campo brillante. 50-100 propagación de metafase se anotó para cada grupo de tratamiento. Esta técnica es adecuada para la detección de aberraciones estructurales cromosómicas (AC), como roturas de tipo cromátida, intercambios de tipo cromátida, fragmentos acéntricos, cromosomas dicéntricos y anillo, dobles minutos, endorreduplicación y translocaciones de Robertson in vitro después de la exposición a PM. Es un poderoso método para asociar un punto final citogenética bien establecida para las alteraciones epigenéticas.

Introducción

Se ha estimado que la exposición a la materia particulada (PM) hace más de 3 millones de muertes al año en exceso, principalmente por enfermedades cardiopulmonares y cáncer de pulmón ^1. De hecho, PM fue reconocido como carcinógeno para los seres humanos por la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (Grupo 1), como un mayor riesgo de cáncer de pulmón con el aumento de los niveles de exposición a PM se ha demostrado ^2. Curiosamente, casi todas las células cancerosas albergan anomalías cromosómicas numéricas y / o estructurales. carbono orgánico particulado es una variante, compleja y mezcla heterogénea, cuya composición y distribución del tamaño depende de las emisiones, así como las transformaciones físicas y químicas. Es cuentas desde 35-55% de la masa urbana PM _2.5 (PM 2,5 micras de tamaño y más pequeño) y más del 60% del medio rural y continental PM _2.5 masa ^{3, 4.} representa la fracción soluble en agua de un 30-90% de los aerosoles orgánicos. Un gran número de compuestos orgánicoshan sido identificados, incluyendo hidrocarburos alifáticos, hidrocarburos aromáticos policíclicos, y sus derivados oxigenados y nitrados, aldehídos alifáticos y alcoholes, ácidos grasos libres y sus sales, ácidos di-carboxílicos, compuestos multifuncionales, proteínas y macromoléculas húmicas-como (Hulis) usando métodos cromatográficos acoplados con técnicas de espectrometría de masas ^5-8. Estos compuestos representan menos del 10-20% de carbono orgánico particulado, por tanto, la mayor parte de carbono orgánico es desconocida ^9.

La evidencia experimental sugiere que la citotoxicidad, el estrés oxidativo y la inflamación están implicados en el desarrollo de estados patológicos asociados-PM. Se ha demostrado recientemente, sin embargo, que la exposición a PM también se traduce en una serie de alteraciones epigenéticas, incluyendo alteraciones en la metilación del ADN de elementos repetitivos, en tanto experimental en sistemas in vitro y en sujetos humanos ^10-12. De particular interés son los efectos dePM del ADN satélite - mayor y menor - satélites que se encuentran en la región de heterocromatina alrededor del centrómero de los cromosomas. Se ha demostrado que estos efectos pueden ser persistentes por naturaleza, ya que se pueden detectar durante al menos 72 horas después de la exposición ^12. Las alteraciones en la metilación del ADN, particularmente alrededor de los centrómeros, pueden conducir a la acumulación de transcritos de ARNm de ADN satélite, la integridad cromosómica compromiso durante la división celular y, posteriormente, como resultado el desarrollo de una variedad de estados patológicos ^13.

Adaptación de enfoque citogenética para el análisis de CA como un punto final de alteraciones epigenéticas causadas por PM, por lo tanto, es de gran importancia. Aquí, se presenta el enfoque para la recogida y preparación ambiente PM, la exposición in vitro y el análisis de AC a partir del sistema de macrófagos RAW264.7 modelo murino. Los macrófagos constituyen la primera línea de defensa contra los objetos extraños inhalados y, por lo tanto, tla línea celular sirve como un sistema establecido y el modelo más utilizado en toxicología de partículas ^{11, 12, 14, 15.}

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Protocolo

1. Recogida de partículas y Preparación de

1. La calibración del muestreador de partículas de alta volumen total suspendida
   1. Desconectar el motor toma de muestras desde el controlador de flujo de masa y conectar el motor a una fuente de alimentación de CA estable (Figura 1).
      NOTA: Un filtro no se utiliza durante este procedimiento.
   2. Montar el orificio calibrador y la placa de adaptador de carga superior a la toma de muestras. Apretar el adaptador de carga tuercas de sujeción de arriba con firmeza para asegurarse de que no hay fugas de aire están presentes. Deje que el motor toma de muestras se caliente a su temperatura normal de funcionamiento (aproximadamente 10-15 minutos).
   3. Llevar a cabo una prueba de fugas, cubriendo los agujeros en la parte superior del orificio y la presión del grifo en el orificio con las manos. Escuchar un chillido agudo hecha por escapar aire. Si se escucha este sonido, vuelva a apretar el adaptador de carga tuercas de sujeción superiores como una fuga. Si el sonido es más bajo, la fuga se encuentra cerca de una de las otras juntas en el directorio sysTEM.
   4. Conectar un lado de un manómetro de agua a la toma de presión en el lado del orificio con un tubo de vacío de caucho. Deje el lado opuesto del manómetro abierto a la atmósfera. Mantenga un manómetro vertical para asegurar lecturas precisas. Al tocar la parte trasera de la grabadora de flujo continuo ayudará a centrar la pluma y proporcionar lecturas precisas.
   5. Repita el paso 1.1.2 usando cinco velocidades de flujo que representan los caudales que operan desde 30 a 60 pies / min (aproximadamente cada 5-6 pies ³ / min). Ajuste la perilla en el orificio variable en cinco posiciones diferentes y tomar cinco lecturas diferentes.
   6. Registre la temperatura ambiente del aire, presión barométrica ambiental, número de serie de muestras, número de serie de orificios, la pendiente y la intersección con el orificio de la última fecha de certificado, la fecha, la ubicación del sitio, y las iniciales del operador en la hoja de calibración.
2. Captación total de partículas en suspensión de la muestra y análisis gravimétrico
   1. Le colocará una8 filtro de fibra de cuarzo "x 10" en dos capas de papel de aluminio. Coloque el filtro envuelto en el horno y ajustar la temperatura a 550 ° C. Hornear el filtro durante al menos 4 horas. Deje enfriar el horno y recuperar el filtro. Coloque el filtro en el desecador con CaCO _3.
   2. Pesar el filtro en una microbalanza con una precisión de 10 g. Repita la medición tres veces durante un día. las distintas medidas deben estar dentro de 25 mg. Si esto no se logra, devuelva el filtro envuelto en el desecador y repetir el proceso al día siguiente.
   3. Abra la tapa del refugio (Figura 2). Quite el marco soporte del filtro aflojando los cuatro tuercas de mariposa, permitiendo que los pernos de latón y arandelas para girar hacia abajo fuera del camino. Desplegar el filtro del papel de aluminio, y el uso de fórceps limpios para centrar con cuidado, con el lado áspero hacia arriba, en la pantalla de soporte. Alinee correctamente el filtro en la pantalla.
   4. Coloque el marco de la pantalla y fijarla conlos pernos de latón y arandelas mientras se aplica presión suficiente para evitar fugas de aire en los bordes. Limpie cualquier acumulación de polvo de todo el soporte del filtro con un paño limpio. Cerrar refugio tapa con cuidado y asegurarla.
   5. Asegúrese de que todos los cables estén enchufados en sus tomas de receptáculos apropiados y la tubería entre la toma de presión del motor del ventilador y el registrador de flujo continuo está conectado.
   6. Prepare la grabadora de flujo. Deprimir la pluma del brazo elevador para elevar el punto de la pluma e insertar un nuevo gráfico. Alinee la lengüeta de la tabla para el cubo de transmisión de la grabadora y presione con el pulgar para bajar el centro de la carta en el cubo. Establecer el tiempo girando el cubo de transmisión en sentido horario hasta que la hora correcta en el gráfico está alineado con el puntero del índice de tiempo.
   7. cambiar manualmente en la toma de muestras y comenzar la recolección. Monitorear la grabadora para asegurarse de que esté correctamente entintado y el indicador de tiempo transcurrido para asegurarse de que funciona correctamente.
   8. Al final del periodo de muestreo, desconectar el muestreador, fichael tiempo transcurrido y recuperar el gráfico. Retire el marco para exponer el filtro. Retire el filtro expuesta desde la pantalla de soporte sujetándola suavemente en los extremos con los fórceps. Doblar el filtro longitudinal que muestra que toca la muestra dos veces y lo envuelve en papel de aluminio originales.
   9. Guarde el filtro en un desecador con CaCO ₃ durante al menos 24 h antes de la pesada. Repita el paso 1.2.2 para medir el peso de los filtros después del muestreo. Coloque el filtro en una bolsa de plástico con cierre y lo almacenan en -80 ° C hasta su análisis.
3. Análisis de recogida de muestras de partículas totales en suspensión
   1. Recuperar el filtro almacenado, desplegar el papel de aluminio y trasladar el filtro sobre una superficie limpia de teflón. El uso de pinzas y bisturí, cortar (blanco) parte externa del filtro y deseche.
      1. A continuación, cortar el filtro en 0,5 pedazos "x 0,5" y colocar piezas en un matraz de 100 ml. Añadir 50 ml de agua ultrapura. Colocar el matraz en un ultrasonidobañera y sonicar durante 60 min a 33 ± 3 kHz.
   2. extracto de filtro a través de un filtro de jeringa de polipropileno de 0,45 micras a un matraz de 100 ml de fondo redondo. Se evapora el agua usando un instrumento rotavapor bajo presión a 50 ° C hasta alrededor de 5 ml de extracto se mantiene en el matraz.
      1. Se evapora el agua restante en un matraz de 15 ml en forma de pera de peso conocido. Pesar el matraz con el extracto seco y se registra la masa del extracto seco.
   3. Disolver la muestra seca con 400 l de D ₂ O por sonicación durante 15 min y transferir a un tubo de RMN de 5 mm de estándar. Centrifugar durante 5 min a 12.000 xg a la temperatura ambiente para eliminar cualquier materia sin disolver.
   4. Repetir con 300 l de D ₂ O. Añadir 10 l de _NaN3 1,4% (conc .: 0,02% w / v) en el tubo de RMN. Añadir 10 l (32 g) de las partículas en suspensión totales (TSP) -d4 (3,2 mg / ml) a D ₂ O (concentración final 0,258 mM) en el tubo de RMN.
   5. Adquirir ^{espectros de} 1H RMN utilizando un espectrómetro de RMN funciona a 600,17 MHz.
      1. Inserte tubo de RMN en la criosonda de triple resonancia. Calibrar el instrumento en el siguiente orden: bloqueo, sintonizar, cuña, calibración de la longitud 90 ° de impulsos y ajuste de ganancia del receptor.
      2. Medir los espectros a 25 ° C con una secuencia de excitación esculpir 1 D usando 180 pulsos selectivos de agua en modo de detección cuádruple digital, 8.192 exploraciones, 4 exploraciones ficticias, anchura de barrido de 8012,57 Hz, desplazamiento de frecuencia para la supresión de la señal de agua ajustado a 4,70 ppm, 1,70 tiempo de adquisición seg, 32.768 puntos de datos de dominio de tiempo (TD), 1 mseg de duración de gradiente (p16), 100 microsegundos demora la recuperación después de gradiente (d16).
   6. Proceso ¹ H espectros de RMN mediante la aplicación de una ampliación de la línea de 1 Hz y de llenado cero por un factor de 2 (65.536 puntos de datos). Corregir la fase y la línea de base e integrar de forma manual. Establecer pico TSP-d4 a 0,0 ppm.

2. Exposición de partículas

1. Cultura creó
   1. medio de crecimiento completo caliente que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) y solución de penicilina-estreptomicina (100 U / ml), solución de tripsina 0,25% y el magnesio fosfato de calcio libre de tampón salino (PBS) en un baño de agua (a 37 ° C) para al menos 30 minutos antes del inicio del cultivo.
   2. Sacar un matraz T75 del 5% de _CO2 que contiene células RAW264.7 cultivadas y se lavan las células con 2 ml de pre-calentado PBS dos veces.
   3. Separar las células RAW264.7 adherentes del fondo del recipiente de cultivo de tejidos utilizando 1 ml de solución de tripsina previamente calentada, seguido por raspado.
   4. Recoger las células de recipiente de cultivo de tejido y hacer que una única suspensión celular mediante pipeteo repetido. Contar el número de células con azul de tripano y la placa a una densidad de 8.000 / cm ² (500.000 células totales) en una placa de cultivo de tejidos de 100 mm con pre-calentado medio completo. Ajustar el volumen de los medios de comunicación a 10 ml para una concentración final de 50.000 célulaspor ml.
      NOTA: duplicar el número de placas si también se realiza el análisis de metilación del ADN.
   5. Colocar las células RAW264.7 recién chapadas de vuelta en 5% de _CO2 a 37 ° C y dejar que se unieran durante 24 horas.
   6. También en una cabina de bioseguridad, volver a suspender las partículas filtradas. Por ejemplo, diluir las partículas a una concentración de 0,5 mg / ml en PBS estéril para una dosis de tratamiento 5 mg / ml y a 5 mg / ml para una dosis de tratamiento 50 mg / ml. Las diluciones se pueden preparar hasta mes de antelación y almacenadas a -80 ° C.
2. El tratamiento con partículas
   1. Sacar las células de 5% de _CO2 y se les presentarán bajo un aumento de 10x utilizando un microscopio invertido para el crecimiento celular, la morfología celular, condiciones de cultivo, y la contaminación. Uno debe esperar a tener al menos un 30% de células confluentes en esta etapa.
   2. Asépticamente, aspirar los medios de comunicación que usa la pipeta esterilizada y lavar el recipiente de cultivo con 2 ml de PBS 37 ° Cdos veces para eliminar por completo los medios de comunicación y las células flotantes o muertos.
   3. Añadir dosis predeterminada de material particulado por medio fresco en los recipientes de cultivo y se incuba durante el tiempo deseado a 37 ° C en 5% de _CO2. En este estudio, el tratamiento de las células con RAW264.7 PM durante 72 horas paralela a la exposición utilizada para el análisis genotóxico y epigenotoxic concurrente.
      NOTA: La citotoxicidad puede afectar negativamente a la calidad del análisis citogenético. Por lo tanto, los ensayos adicionales, tales como citotoxicidad, la metilación del ADN, transferencia Western, o análisis de expresión génica se realizan normalmente en las células tratadas. Exponer las células como se describe y proceder con el ensayo específico deseado. Los usuarios inexpertos pueden también querer incluir un control positivo tal como metanosulfonato de metilo para poner a prueba su capacidad para detectar las entidades emisoras.

3. ensayo citogenético

1. El tratamiento para detener a las células en metafase
   1. Se calienta la colcemid por lolución (10 mg / ml) en un 37 ° C baño de agua durante 30 min. Limpiar la tapa con alcohol 70% bajo una cabina de bioseguridad para reducir al mínimo el riesgo de contaminación
   2. Eliminar completamente los medios de comunicación de forma aséptica y lavar los recipientes de cultivo con 2 ml de pre-calentado PBS dos veces.
   3. Añadir medio fresco pre-calentado (2 ml de medio / 10 ⁶ células) que contenían solución colcemid (5 l / ml) en el recipiente de cultivo y se incuba durante 2 horas.
2. cosecha de células
   1. solución de tripsina cálido y PBS en un baño de agua a 37 ° C durante 30 min. A partir de esta etapa en adelante, no hay necesidad de mantener condiciones asépticas.
   2. Eliminar completamente los medios de comunicación, lavar los recipientes de cultivo con 2 ml 37 ° C PBS por dos veces, añadir volumen requerido de solución de tripsina previamente calentada (por lo general 2 ml de 60 mm placa de cultivo o frasco T25 y 4 ml de 100 mm plato o matraz T75 ), y colocar el recipiente de cultivo de vuelta en 5% de _CO2 a 37 ° C durante 1 min.
   3. Take fuera del recipiente de cultivo, separar las células utilizando un raspador, y añadir 10 ml de PBS para detener la acción de tripsina.
   4. Pipeta hacia arriba y abajo por lo menos diez veces para que la suspensión de una sola célula y las células de transferencia en un tubo de centrífuga de fondo cónico de 15 ml.
   5. suspensión de células Centrifugar a 400 xg durante 5 min en una centrífuga de oscilación a cabo a temperatura ambiente.
   6. Eliminar el sobrenadante, el sedimento celular romper con unos golpecitos suaves, agregar 10 ml de PBS, y de nuevo se centrifuga durante cinco minutos.
3. Tratamiento hipotónico y fijación
   1. Pre-caliente solución de cloruro de potasio 0,075 M en un baño de agua a 37 ° por lo menos por 30 min.
   2. Extraer el sobrenadante sin alterar el sedimento celular y dejar aproximadamente 0,5 ml de PBS.
   3. romper suavemente el sedimento celular y hacer suspensión de células individuales con una pipeta P200.
   4. Añadir 4 ml de solución gota cloruro de potasio pre-calentado a gota con agitación suave.
   5. Se incuban las células en hipotónica psolución de cloruro de otassium en un baño de agua a 37 ° durante 20 min.
   6. Hacer acetomethanol solución fresca mediante la adición de 3 partes de metanol con ácido acético glacial 1-parte. Mantenga este fijador recién preparada a temperatura ambiente.
   7. Después del tratamiento hipotónico, añadir un volumen equivalente (4 ml) de fijador en el tubo y mezclar suavemente la solución invirtiendo el tubo.
   8. Centrifugar a 400 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente, y se elimina el sobrenadante. En esta etapa sedimento celular aumenta el tamaño, vuelvan blanquecinas y más visible.
   9. Extraer el sobrenadante, añadir 4 ml de fijador y mantenerla a temperatura ambiente durante 30 min.
   10. Se centrifuga a 400 g durante 5 min, eliminar el sobrenadante, y dar dos lavados más con fijador 4 ml.
4. Limpieza y preparación de diapositivas metafase
   1. Sumergir los portaobjetos de vidrio completamente en detergente líquido 10% para 30 min.
   2. Enjuague los portaobjetos bien con agua fría del grifo durante 30 minutos.
   3. Rinse desliza tres veces con agua destilada para eliminar por completo el detergente, sumerja en agua destilada, y almacenar en el refrigerador para su uso futuro.
      NOTA: diapositivas de limpieza antes de su uso facilita la uniformidad de la calidad y aumenta la metafase.
   4. Caída de suspensión celular de 10 l en diapositiva húmeda fría y deje que se ventile secar durante la noche a temperatura ambiente.
5. Tinción y montaje
   1. Preparar 50 ml de solución colorante Giemsa mezclando una parte de la solución de tinción de Giemsa con una parte de PBS y se vierte en un vaso de Coplin.
   2. Sumergir los portaobjetos en solución de tinción durante 20 minutos.
   3. Enjuague los portaobjetos en agua destilada para eliminar el exceso de colorante e inmediatamente secar los portaobjetos usando un secador de pelo.
   4. Deja las diapositivas a temperatura ambiente durante la noche.
   5. Aplicar una gota de medio de montaje en la diapositiva, coloque suavemente un cubreobjetos sobre el medio de montaje, dejar que el medio se extendió sobre la diapositiva lentamente, y quitarel exceso de medio con una toalla de papel. Deje que la corredera montada se seque durante al menos 1 hora antes de mover o ver bajo el microscopio para evitar el movimiento del cubreobjetos.
      Precaución: Es importante colocar el cubreobjetos con cuidado sin que se formen burbujas de cualquier durante este paso. No se recomienda el uso de calor excesivo para eliminar las burbujas.
6. La observación microscópica y la aberración tipos
   1. Examine las AC estructurales en metafase se propaga por el aumento de 100X utilizando un microscopio de campo claro de buena calidad.
   2. Marque por lo menos 50 a 100 metafase se propaga para cada grupo de tratamiento para los tratamientos que inducen un gran número de entidades de certificación. Para los tamaños del efecto más pequeños, se recomienda el análisis de hasta 300 metafase para untar.

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Resultados

Gran se debe tener cuidado en la elección de la ubicación de la toma de muestras TSP, así como el tiempo del año, cuando se lleva a cabo colección. La composición química, así como el tamaño de las partículas pueden influir sustancialmente los resultados. El material recogido debe ser visible contra el filtro blanco. Una propagación de metafase ratón normal tendrá 40 cromosomas acéntricos. El objetivo de la técnica es demostrar un cambio (o la ausencia de la misma) en la p...

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Discusión

Estudio citogenético o análisis microscópico de los números o las estructuras de los cromosomas, principalmente en metafase para untar, proporciona información crucial para el pronóstico, la evaluación de riesgos, y el tratamiento de diversas enfermedades. Ahora está bien establecido que anomalías citogenéticas están vinculados con la progresión y el desarrollo de varias enfermedades, incluyendo el cáncer. Hasta la fecha, CAs se han encontrado en todos los tipos de tumores importantes. AC puede surgir de fo...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Total suspended particulate sampler	Tisch Environmental	TE-5170
Bruker Avance III NMR spectrometer	Bruker	NA
TopSpin 3.5/pl2 software	Bruker	NA
ACD/NMR Processor Academic Edition	ACD/Labs	NA
RAW264.7 murine macrophages	ATCC	ATCC TIB-71
High glucose DMEM GlutaMAX media	ThermoFisher	10569010	Warm in a 37 °C waterbath before use
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher	16000044	Warm in a 37 °C waterbath before use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	ThermoFisher	15140163	Warm in a 37 °C waterbath before use
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher	25200056	Warm in a 37 °C waterbath before use
PBS, pH 7.4	ThermoFisher	10010049	Warm in a 37 °C waterbath before use
KaryoMAX Colcemid Solution in PBS	ThermoFisher	15212012	Warm in a 37 °C waterbath before use
KaryoMAX Potassium Chloride Solution	ThermoFisher	10575090	Warm in a 37 °C waterbath before use
Methanol (HPLC)	Fisher Scientific	A452N1-19
Acetic Acid, Glacial	Fisher Scientific	BP1185-500
Decon Contrad 70 Liquid Detergent	Fisher Scientific	04-355-1
Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions	Fisher Scientific	23-200733
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-100
Axio Imager 2	Zeiss	NA