使用周囲粒子状物質によって誘発される染色体異常の解析<em&gt;インビトロ</em&gt;システム

要約

このプロトコルは、周囲の空気の粒子状物質で処理した後、RAW264.7マウスマクロファージにおけるin vitroで染色体異常の定量および特徴付けのための手法について説明します。

要約

粒子状物質（PM）への曝露は、核の遺伝物質を含む様々な細胞成分を損傷する恐れがあり、主要な世界的健康問題です。核遺伝的整合性にPMの影響を評価するために、構造的染色体異常は、マウスRAW264.7マクロファージ細胞の分裂中期スプレッドで採点されます。 PMは、大量の全浮遊粒子サンプラと周囲空気から収集されます。捕集された材料は、水溶性、微細な部分を保持するように可溶化し、濾過します。粒子は、核磁気共鳴（NMR）分光法による化学組成を特徴としています。粒子懸濁液の異なる濃度は、未処理対照細胞と一緒に、72時間の総露光時間のRAW264.7マウスマクロファージのインビトロ培養物に添加されます。露光の終了時に、培養は中期で細胞を停止させるコルセミドで処理されます。次いで、細胞を採取し、acetomethanolで固定低張液、Dで処理されていますガラススライド上ropped、最後にギムザ溶液で染色しました。スライドを明視野顕微鏡を用いて1,000倍の倍率で中期スプレッド構造的染色体異常（CAS）内を評価するために調べられます。 50〜100の中期スプレッドは、各処置群について採点します。この技術は、このような染色分型改、染色分型の交換、非中心フラグメント、二動原体とリング染色体、ダブル分、核内倍加、およびPMへの曝露後のin vitroでのロバートソン転座などの構造的染色体異常（CAS）の検出のために適合されています。エピジェネティックな変化に十分に確立された細胞遺伝学的エンドポイントを関連付けるために強力な方法です。

概要

主に、心肺疾患および肺癌¹から、粒子状物質（PM）への曝露は、毎年300万人を超える過剰な死亡を引き起こすと推定されています。 PMへの曝露のレベルの増加に伴う肺癌リスクの増加が^2が示されているように、実際に、PMは、国際がん研究機関（グループ1）によってヒトに発癌性として認識されました。興味深いことに、ほとんどすべての癌細胞は、数値および/または構造的染色体異常を保有します。粒状有機炭素は、その組成およびサイズ分布の排出量だけでなく、物理的、化学的変換に依存するバリアント、複雑で、不均一な混合物、です。これは、35-55（サイズのPM 2.5ミクロンと小さい）都市PM _2.5質量％と農村部と大陸背景PM _2.5質量^3、4の60％以上から占めます。水溶性画分は、有機エアロゾル30〜90％を占めます。有機化合物の多数脂肪族炭化水素、多環芳香族炭化水素、ならびにそれらの酸素化及びニトロ化誘導体、脂肪族アルデヒドおよびアルコール、遊離脂肪酸およびその塩、ジ - カルボン酸、多官能性化合物、タンパク質、及びフミン状高分子（HULIS）の使用を含む、同定されています質量分析技術^5-8と結合されたクロマトグラフィー法。これらの化合物は、このように有機炭素の大部分は⁹未知である、粒子状有機炭素未満の10〜20％を表します。

実験的証拠は、細胞毒性、酸化ストレス、および炎症はPM-関連する病理学的状態の発症に関与していることを示唆しています。それが最近示されたが、PMへの暴露はまた、 インビトロ系および ^10-12ヒト被験体の両方の実験において、反復エレメントのDNAメチル化の変化を含む、エピジェネティックな変化の数になります。特に興味深いの効果がありますメジャーとマイナーの衛星 - - の染色体のセントロメアの周りのヘテロクロマチン領域に見出されているサテライトDNA上のPM。それは暴露¹²の後、少なくとも72時間を検出することができるようにこれらの効果は、本質的に永続的であり得ることが示されました。特にセントロメアの周りのDNAメチル化の変化は、衛星DNAのmRNA転写物の蓄積をもたらす細胞分裂の際に染色体の完全性を損なうことと、その後、病理学的状態¹³の様々な開発につながることがあります。

PMによって引き起こされるエピジェネティックな変化の終点としてCAの分析のための細胞遺伝学的アプローチの適用は、このように、非常に重要です。ここでは、マウスマクロファージRAW264.7モデルシステムを使用して、CAのインビトロでの曝露と分析で 、周囲のPM収集と準備のためのアプローチを報告しています。マクロファージは、吸入異物に対する防御の最初の行を含み、したがって、トンその細胞株を確立し、粒子毒物^{11、12、14、15}の中で最も頻繁に使用されるモデルとして役立ちます。

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プロトコル

1.粒子の収集と準備

1. 高容量全浮遊粒子サンプラのキャリブレーション
   1. マスフローコントローラからサンプラーモータを取り外し、安定したAC電源（ 図1）にモーターを接続します。
      注：フィルタは、この手順の間に使用されていません。
   2. サンプラーにキャリブレータオリフィスとトップローディングアダプタプレートをマウントします。空気の漏れが存在しないことを保証するために確実にトップローディングアダプタ押さえナットを締めます。サンプラーモータが通常の動作温度（約10〜15分）まで昇温することを可能にします。
   3. 手で口にオリフィスと圧力タップの上に穴を覆うことにより、リークテストを実施します。空気をエスケープすることにより作られた甲高いスキール音を聞きます。この音が聞こえる場合はリークが存在しているとして、トップローディングアダプタ押さえナットを締め直してください。音が低い場合、漏出は、SYSの他のガスケットの一つの近くにありますテム。
   4. ゴム製の真空管とオリフィスの側の圧力タップに水の圧力計の一方の側を接続します。大気開放圧力計の反対側にしておきます。正確な測定値を確保するために、垂直方向に圧力計を保持します。連続流レコーダーの裏側をタップすると、ペンを中心に、正確な測定値を提供するのに役立ちます。
   5. 30〜60フィート/分（約ごとに5〜6フィート³ /分）から操作する流量を表す5の流量を使用して手順を繰り返し1.1.2。 5の異なる位置に可変オリフィス上のノブを調整し、5別の読み取りを行います。
   6. 認定最後の日付、日付、サイトの場所、およびキャリブレーションシート上のオペレータのイニシャルと周囲の空気の温度、周囲気圧、サンプラーシリアル番号、オリフィスシリアル番号、オリフィススロープとインターセプトを記録します。
2. 総浮遊粒子サンプル収集および重量分析
   1. ラップアルミホイルの二つの層8 "×10"の石英繊維フィルター。炉内に包まれたフィルタを置き、550℃に温度を設定。少なくとも4時間、フィルターを焼きます。炉クールにしようとフィルターを取得します。 CaCO ₃でデシケーター中にフィルタを配置します。
   2. 10μgの精度の天秤でフィルタを計量。日中の測定3回繰り返します。個々の測定値は25μgの範囲内でなければなりません。これが達成されていない場合は、デシケーターに包まれたフィルタを返し、次の日の処理を繰り返します。
   3. 避難所のふた（ 図2）を開きます。真鍮ボルトとワッシャーが邪魔にならないようにダウンスイングすることができ、4ウィングナットを緩めて、フィルターホルダーフレームを削除します。支援画面上に、粗いサイドアップ、アルミ箔からフィルタを展開し、慎重にそれを中心に清掃鉗子を使用しています。正しく画面にフィルタを合わせます。
   4. 画面上にフレームを配置し、それを確保縁部での空気漏れを回避するために十分な圧力をかけながら真鍮ボルトとワッシャ。清潔な布でフィルターホルダーの周りの汚れの蓄積を拭いてください。慎重に避難所の蓋を閉じて固定します。
   5. すべてのコードが適切なコンセントのソケットに差し込まれており、送風機モータ圧力タップと連続流レコーダー間のチューブが接続されていることを確認します。
   6. 流れレコーダーを準備します。ペン先を高め、新しいチャートを挿入するためにペンアームリフターを押し下げます。レコーダーのドライブハブにチャートのタブの位置を合わせ、ハブ上にグラフの中心を下げるために親指で押してください。チャート上の正しい時刻が時間インデックスポインタと位置合わせされるまで、ドライブハブを時計回りに回転させることで時間を設定します。
   7. 手動サンプラーに切り替えて、収集を開始。それが正しくインキングされ、経過時間インジケータは、それが正常に動作していることを確認するために確認するためにレコーダーを監視します。
   8. サンプリング期間の終了時に、サンプラー、レコードをオフに時間が経過し、グラフを取得します。フィルタを公開するフレームを削除してください。ピンセットで端で静かに保持することによって支援画面から露出し、フィルタを削除します。サンプルは二回サンプルに触れるように縦にフィルタを折り、元のアルミホイルでそれをラップします。
   9. 計量前に少なくとも24時間のCaCO ₃とデシケーターにフィルタを保管してください。サンプリング後のフィルタの重量を測定するための手順を繰り返し1.2.2。ジップビニール袋にフィルタを配置し、分析まで-80℃に保管してください。
3. 収集した全浮遊粒子試料の分析
   1. 保存されているフィルタを取得し、アルミ箔を展開し、清潔なテフロン表面にフィルタを転送します。ピンセットやメスを使用して、フィルタの外側（白い）部分を切断して処分します。
      1. 次に、100ミリリットルのフラスコに0.5 "×0.5"の作品と場所片でフィルタをカット。超純水の50ミリリットルを追加します。超音波でフラスコを置きますバス、33±3 kHzで60分間超音波処理。
   2. フィルターを100mlの丸底フラスコに0.45μmのポリプロピレンシリンジフィルターを介して抽出します。約5mlの抽出物をフラスコ中に残るまで50℃で圧力下で回転蒸発器装置を用いて水を蒸発させます。
      1. 既知重量の15ミリリットルの梨型フラスコに残った水を蒸発させます。乾燥抽出物の入ったフラスコを計量し、乾燥抽出物の質量を記録します。
   3. 15分間超音波処理することによって、D ₂ Oの400μlの乾燥サンプルを溶解し、5ミリメートルの標準的なNMR管に移します。未溶解物質を除去するために、室温で12,000×gで5分間遠心します。
   4. D ₂ Oの300μlで繰り返しNMR管にNaN ₃を10μlの1.4％（最終濃度：w / vの0.02％）を追加します。 NMRチューブ中のD ₂ O（最終濃度0.258ミリモル）に総浮遊粒子（TSP）-d4（3.2 mg / mlで）を10μl（32μgの）を追加します。
   5. 600.17 MHzで動作するNMR分光計を用いて^、1 H NMRスペクトルを取得します。
      1. 三重共鳴凍結プローブにNMR管を挿入します。次の順序で機器を較正：ロック、曲、シム、90°パルス長較正及び受信ゲイン調整。
      2. デジタルクワッド検出モードで180の水選択パルス、8192スキャン、4ダミースキャン、8012.57ヘルツの掃引幅を使用して、1次元励起彫刻配列と25℃でのスペクトルを測定し、周波数は4.70 ppmに設定された水の信号抑制、1.70のオフセット秒の取得時間、32,768時間領域のデータポイント（TD）、1ミリ秒の持続時間の勾配（P16）、勾配後100μ秒回復遅延（D16）。
   6. 1ヘルツ及び2（65,536データポイント）倍ゼロフィリングの線幅拡大を適用することによって、プロセス¹ H NMRスペクトルを示します。手動相とベースラインを修正して、統合します。 0.0 ppmのTSP-d4のピークを設定します。

2.粒子暴露

1. 文化を設定します
   1. （37℃）、10％ウシ胎児血清（FBS）およびペニシリン - ストレプトマイシン溶液（100 U / ml）を、0.25％トリプシン溶液とカルシウムマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水浴中（PBS）を含む暖かい完全増殖培地用培養開始前に少なくとも30分。
   2. 培養されたRAW264.7細胞を含む_{、5％CO 2}インキュベーターからT75フラスコを取り出し、予め温めておいた2mlのPBSで2回細胞を洗浄します。
   3. 掻き取り、続いて予熱したトリプシン溶液1mlを使用して、組織培養容器の底から付着RAW264.7細胞を取り除きます。
   4. 組織培養容器から細胞を収集し、繰り返しピペッティングにより単一細胞懸濁液を作ります。予め温めた完全培地での100mm組織培養皿中で8,000 / cm ²で（合計500,000個の細胞）の密度で、トリパンブルー及びプレートを有する細胞の数を数えます。 50,000個の細胞の最終濃度のために10ミリリットルにメディア音量を調整1mlあたり。
      注：DNAメチル化解析も行われている場合、プレートの数を倍増。
   5. 37℃、バック、5％CO ₂インキュベーター内で新たにメッキRAW264.7細胞を置き、24時間アタッチすることができます。
   6. また、安全キャビネット内で、フィルタリングの粒子を再懸濁します。例えば、5μg/ mlの治療用量のための滅菌PBS中の0.5mg / mlの濃度で粒子を希釈および5mg /50μg/ mlの治療用量についてmlで。希釈は、予め月まで調製し、-80℃で保存することができます。
2. 粒子状物質による治療
   1. 5％CO ₂インキュベーターから細胞を取り出し、細胞増殖、細胞形態、培養条件、および汚染の倒立顕微鏡を用いて10倍の倍率で確認してください。一つは、この段階では、少なくとも30％コンフルエントの細胞を持っていることを期待するべきです。
   2. 無菌的には、滅菌ピペットを用いて培地を吸引し、2mlの37℃のPBSで培養容器を洗浄します2回完全にメディアおよび浮動または死んだ細胞を除去します。
   3. 培養容器中の新鮮な培地と粒子状物質の予め決定された投与量を追加し、5％CO ₂インキュベーター中、37℃で、所望の時間インキュベートします。本研究では、同時遺伝毒性およびepigenotoxic分析のために使用される露光と平行して72時間のPMでRAW264.7細胞を扱います。
      注：細胞毒性は、負に細胞遺伝学的解析の品質に影響を与える可能性があります。したがって、そのような細胞毒性、DNAメチル化、ウエスタンブロッティング、または遺伝子発現分析のような付加的なアッセイは、典型的に処理された細胞上で実行されます。記載されているように細胞を露出させ、所望の特定のアッセイを進めます。経験の浅いユーザーはまた、CAを検出する能力をテストするために、メチルメタンなどのポジティブコントロールを含めることができます。

3.細胞遺伝学的アッセイ

1. 中期で細胞を停止させる治療
   1. そうコルセミドを温めますリューション30分間37℃の水浴中で（10 / mlの）。汚染の危険性を最小限に抑えるために安全キャビネットの下に70％アルコールで蓋を拭きます
   2. 完全に無菌的にメディアを取り出し、2ミリリットル予め温めておいたPBSで2回培養容器を洗います。
   3. 予め温めておいた新鮮な培地を加える（2ミリリットルメディア/ 10 ⁶細胞）を培養容器中のコルセミド溶液（5μL/ ml）を含む、2時間インキュベートします。
2. 細胞収穫
   1. 30分間37℃に維持した水浴中に温かいトリプシン溶液とPBS。以降、このステップから、無菌状態を維持する必要はありません。
   2. 完全にメディアを取り出し、2回2ミリリットル37°C PBSで培養容器を洗浄し、100ミリメートル皿またはT75フラスコのために予め温めておいたトリプシン溶液（通常は60ミリメートル培養皿またはT25フラスコのための2ミリリットルと4ミリリットルの必要なボリュームを追加）、および1分間37℃、バック、5％CO ₂インキュベーター内で培養容器を配置します。
   3. ターク電子アウト培養容器を、スクレーパーを用いて細胞を剥離し、トリプシンの作用を停止するためにPBSの10ミリリットルを追加します。
   4. 上下ピペット少なくとも10回15ミリリットルコニカル遠心管に単一細胞懸濁液と転送細胞を作るために。
   5. 室温でのアウトスイング遠心機で5分間、400×gで遠心分離細胞懸濁液。
   6. 上清を取り除き、穏やかなタッピングによって細胞ペレットを破る、PBSの10ミリリットルを追加し、再び5分間遠心します。
3. 低張処理および固定
   1. 少なくとも30分間、37℃の水浴中でプレ暖かい0.075 M塩化カリウム溶液。
   2. 細胞ペレットを乱すことなく上清を除去し、PBSの約0.5ミリリットルを残します。
   3. 静かに細胞ペレットを破壊し、P200のピペットを用いて、単一細胞懸濁液を作ります。
   4. 穏やかに振盪しながら降下により予熱した塩化カリウム溶液ドロップの4ミリリットルを追加します。
   5. 低張Pで細胞をインキュベート20分間37℃の水浴中otassium塩化物溶液。
   6. 1パート氷酢酸で3部品のメタノールを加えて、新鮮なacetomethanol液を作ります。室温で、この新たに調製した固定液を保管してください。
   7. 低張処理した後、チューブに固定液の等量の（4 ml）を加え、穏やかにチューブを反転させて溶液を混合。
   8. 室温で5分間、400×gで遠心分離し、上清を除去します。この段階の細胞ペレットのサイズが大きくなる時に、白っぽいより見えるようになります。
   9. 上清を除去し、4ミリリットルに新鮮な固定液を追加し、室温で30分間保ちます。
   10. 5分間、400×gで遠心分離し、上清を除去し、4ミリリットルの固定液でさらに2回の洗浄を与えます。
4. クリーニングと中期スプレッドの準備をスライドさせ
   1. 30分間、10％の液体洗剤中に完全にスライドガラスを浸漬します。
   2. 30分間冷たいランニング水道水で十分にスライドを洗浄します。
   3. 凛SEは完全に、界面活性剤を除去蒸留水に浸し、そして将来の使用のために冷蔵庫に保存するために蒸留水で3回スライドさせます。
      注：使用が広がると中期の品質を増大させるの均一性を容易にする前に、スライドを清掃。
   4. チルド濡れたスライド上の10μlの細胞懸濁液をドロップし、それを室温で一晩乾燥を放送することを可能にします。
5. 染色および取り付け
   1. PBSの一部でギムザ染色液の一部を混合して50ミリリットルギムザ染色液を調製し、コプリンジャーに注ぎます。
   2. 20分間染色液でスライドを浸し。
   3. 過剰な汚れを除去し、すぐにヘアドライヤーを使用してスライドを乾燥させるために、蒸留水でスライドを洗浄します。
   4. 室温で一晩スライドを残します。
   5. 媒体はゆっくりとスライド上に拡散することを可能にする、そっとマウンティング培地にカバースリップを置き、スライド上の封入剤の一滴を適用し、削除ペーパータオルで余分な培地。マウントされたスライドが前に移動、またはカバースリップの動きを回避するために、顕微鏡下での表示に少なくとも1時間乾燥することができます。
      注意：このステップの間に気泡を形成することなく、慎重にカバースリップを配置することが重要です。気泡を除去するために過剰な熱の使用は推奨されません。
6. 顕微鏡観察および収差の種類
   1. 中期は良質の明視野顕微鏡を用いて100倍の倍率で広がるの構造のCAを調べます。
   2. 少なくとも50〜100中期はCAの多数を誘導治療のために、各治療群スプレッドスコア。小さい効果サイズの場合、最大300の中期スプレッドの分析をお勧めします。

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結果

細心の注意は、TSPサンプラーの場所だけでなく、収集が行われる年の時間を選択する際に注意すべきです。化学組成並びに粒子のサイズは、実質的に結果に影響を与え得ます。収集した材料は、白色フィルタに対して表示されるはずです。正常マウスの中期スプレッドは40無動原染色体を持つことになります。技術の目標は、対対照処理細胞における染色体異常の割?...

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ディスカッション

細胞遺伝学的研究や数字や、主に中期スプレッド中の染色体の構造の顕微鏡分析は、様々な疾患の予後、リスク評価、および治療のための重要な情報を提供しています。現在では、細胞遺伝学的異常は、癌を含むいくつかの疾患の進行と開発にリンクされていることを十分に確立されています。現在までに、CAは、すべての主要な腫瘍タイプで発見されています。細胞遺伝学的改変¹⁶?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Total suspended particulate sampler	Tisch Environmental	TE-5170
Bruker Avance III NMR spectrometer	Bruker	NA
TopSpin 3.5/pl2 software	Bruker	NA
ACD/NMR Processor Academic Edition	ACD/Labs	NA
RAW264.7 murine macrophages	ATCC	ATCC TIB-71
High glucose DMEM GlutaMAX media	ThermoFisher	10569010	Warm in a 37 °C waterbath before use
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher	16000044	Warm in a 37 °C waterbath before use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	ThermoFisher	15140163	Warm in a 37 °C waterbath before use
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher	25200056	Warm in a 37 °C waterbath before use
PBS, pH 7.4	ThermoFisher	10010049	Warm in a 37 °C waterbath before use
KaryoMAX Colcemid Solution in PBS	ThermoFisher	15212012	Warm in a 37 °C waterbath before use
KaryoMAX Potassium Chloride Solution	ThermoFisher	10575090	Warm in a 37 °C waterbath before use
Methanol (HPLC)	Fisher Scientific	A452N1-19
Acetic Acid, Glacial	Fisher Scientific	BP1185-500
Decon Contrad 70 Liquid Detergent	Fisher Scientific	04-355-1
Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions	Fisher Scientific	23-200733
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-100
Axio Imager 2	Zeiss	NA