JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

Abstract

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau's heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.

Introduction

واحدة من التحديات الرئيسية التي تواجه الرعاية الصحية في القرن الحادي و21 هي أمراض الاعصاب مثل الإصابة بمرض الزهايمر (AD). تاو هو بروتين المرتبط أنيبيب الذي يحفز أنيبيب (MT) تشكيل. وتشارك تاو على قدم المساواة في العديد من الاضطرابات العصبية، يسمى tauopathies، والتي من أشهرها هو م. في هذه الاضطرابات، وجدت تاو المجاميع الذاتي في خيوط حلزونية تقرن (PHFs) وتعديلها على العديد من المخلفات التي تعديلات posttranslational (PTMs) مثل الفسفرة 1. تورط الفسفرة من البروتين تاو في كل تنظيم وظيفة فسيولوجية لاستقرار طن متري، وفقدان المرضية من وظيفة الخلايا العصبية التي تميز م.

وعلاوة على ذلك، بروتين تاو، عند دمجها في PHFs في الخلايا العصبية المريضة، وhyperphosphorylated دائما 2. على عكس تاو الطبيعي أن يحتوي على 2-3 مجموعة الفوسفات، وتاو hyperphosphorylated في PHFs يحتوي على 5-9 الفوسفاطالمجموعات الإلكترونية 3. Hyperphosphorylation من تاو يتوافق على حد سواء لزيادة العناصر المتفاعلة في بعض المواقع والفسفرة من المواقع الإضافية التي تسمى مواقع المرضية من الفسفرة. ومع ذلك، يوجد تداخل بين الميلادي وأنماط البالغين الطبيعية من الفسفرة، على الرغم من الاختلافات الكمية في مستوى 4. كيف محددة الأحداث الفسفرة وظيفة النفوذ واختلال وظيفي تاو لا تزال مجهولة إلى حد كبير. ونحن نهدف إلى فك تنظيم تاو كتبها PTMs على المستوى الجزيئي.

لتعميق فهم الجوانب الجزيئية تاو، لدينا لمعالجة التحديات التقنية. أولا، تاو هو بروتين المختلين جوهريا (IDP) عندما معزولة في الحل. هذه البروتينات تفتقر محددة جيدا هيكل ثلاثي الأبعاد في ظل الظروف الفسيولوجية وتتطلب معينة الطرق الفيزيائية الحيوية لدراسة وظيفة (ق) والخصائص الهيكلية. تاو هو نموذج لفئة متزايدة من النازحين، وكثيرا ما وجدت المرتبطةالأمراض مثل الأمراض العصبية، وبالتالي زيادة الفائدة على فهم المعلمات الجزيئية الكامنة وراء وظائفهم. ثانيا، توصيف تاو الفسفرة هو التحدي التحليلي، مع 80 موقعا الفسفرة المحتملة على طول سلسلة من أطول 441 الأحماض الأمينية تاو الإسوي. وقد تم تطوير عدد من الأجسام المضادة ضد الحواتم فسفرته من تاو وتستخدم للكشف عن تاو المرضية في الخلايا العصبية أو أنسجة المخ. يمكن أن الأحداث الفسفرة يومي لا يقل عن 20 المواقع المستهدفة من قبل تحركات الموجه البرولين، معظمهم على مقربة داخل المنطقة البرولين الغنية. النوعي (المواقع التي؟) وتوصيف كمي (ما رياضيات الكيمياء؟) صعبة حتى من قبل تقنيات MS أحدث 5.

مطيافية الرنين النووي المغناطيسي يمكن استخدامها لتحقيق البروتينات المختلين التي هي غاية الأنظمة الديناميكية تتألف من مجموعات من المتشاكلات. كان عالية الدقة الرنين المغناطيسي الطيفي تطبيق صحيفةإد للتحقيق في كل من هيكل ووظيفة البروتين تاو. وبالإضافة إلى ذلك، أدى إلى تعقيد الملف الشخصي الفسفرة تاو لتطوير الأدوات الجزيئية وطرق تحليلية جديدة باستخدام الرنين المغناطيسي لتحديد المواقع الفسفرة 6-8. الرنين المغناطيسي النووي باعتباره المنهج التحليلي تسمح لتحديد المواقع الفسفرة تاو بطريقة العالمية، والتصور من جميع التعديلات في موقع واحد في تجربة واحدة، وتقدير مدى التأسيس الفوسفات. هذه نقطة أساسية منذ الرغم من أن الدراسات الفسفرة على تاو وتكثر في الأدب، ومعظمهم تم تنفيذها مع الأجسام المضادة، وترك درجة كبيرة من عدم اليقين بشأن الوضع الكامل من الفسفرة وبالتالي التأثير الحقيقي للأحداث الفسفرة الفردية. تحركات المؤتلف بما في ذلك PKA، الجليكوجين-سينسيز كيناز 3β (Gsk3β)، السيكلين التي تعتمد كيناز 2 / السيكلين ألف (CDK2 / CycA)، كيناز السيكلين التي تعتمد 5 (CDK5) / P25 عمل البروتين ivator، تنظم خارج الخلية إشارة كيناز 2 (ERK2) وأنيبيب-التنظيم تقارب كيناز (MARK)، والتي تظهر نشاط الفسفرة نحو تاو، يمكن أن تكون مستعدة في شكل نشط. وبالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام المسوخ تاو التي تسمح لتوليد الأشكال الإسوية بروتين تاو محددة مع أنماط الفسفرة جيدا اتسم فك شفرة الفسفرة تاو. ثم يتم استخدام الرنين المغناطيسي الطيفي لتحديد خصائص العينات تاو تعديل إنزيمي 6-8. على الرغم من أن في المختبر الفسفرة تاو هو أكثر صعوبة من شبه الفسفرة مثل قبل الطفرة المحدد سر / منتدى المجالس الرومانسية إلى حمض الجلوتاميك (غلو) المخلفات، وهذا النهج مزاياه. في الواقع، لا المعلمات تأثير ولا التفاعل الهيكلية للالفسفرة يمكن دائما تحاكي بواسطة الأحماض الجلوتاميك. ومن الأمثلة على ذلك عزر بدوره لاحظ حول phosphoserine 202 (pSer202) / phosphothreonine 205 (pThr205)، والتي لا تتكرر مع الطفرات غلو 9.

SS = "jove_content"> هنا، وسيتم وصف إعداد تاو المسمى isotopically للتحقيقات الرنين المغناطيسي النووي أولا. يتم تعديل بروتين تاو فسفرته بواسطة ERK2 على مواقع عديدة وصفها بأنها مواقع المرضية من الفسفرة، وبالتالي يمثل نموذجا للاهتمام من تاو hyperphosphorylated. ويرد بروتوكول مفصلة من تاو في الفسفرة المختبر بواسطة كيناز ERK2 المؤتلف. يتم تنشيط ERK2 من الفسفرة من قبل mitogen تنشيط بروتين كيناز / إرك كيناز (مجاهدي خلق) 10-12. بالإضافة إلى إعداد تعديل، بروتين تاو المسمى isotopically، يوصف استراتيجية NMR تستخدم لتحديد PTMs.

Protocol

1. إنتاج 15 N، 13 C-تاو (الشكل 1)

  1. تحويل pET15b-تاو T7 المؤتلف التعبير البلازميد 13،14 في BL21 (DE3) المختصة كولاي الخلايا البكتيرية 15.
    ملاحظة: الترميز [كدنا لأطول (441 بقايا الأحماض الأمينية) تاو الإسوي هو استنساخ بين المواقع تقييد جنة التحقيق الوطنية السودانية وXhoI في البلازميد pET15b.
    1. المزيج بلطف 50 ميكرولتر من BL21 المختصة (DE3) خلايا، وتشكيل 1-5 × 10 7 المستعمرات في ميكروغرام من البلازميد، مع 100 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد في أنبوب بلاستيكي 1.5 مل.
      ملاحظة: تسلسل معلومات النظام الجيني-الاستخدام الأمثل السلالات البكتيرية للتعبير كدنا] حقيقية النواة ليست ضرورية لإنتاج تاو البشري.
    2. ضع الخليط الخلية على الجليد لمدة 30 دقيقة ثم الصدمة الحرارية لمدة 10 ثانية في 42 درجة مئوية. وضع أنبوب مرة أخرى على الجليد لمدة 5 دقائق وإضافة 1 مل من درجة حرارة الغرفة LB (لوريا، Bertani) متوسطة. احتضان تعليق البكتيرية عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تحت لطيفالإثارة.
  2. انتشر استخدام حلقة التلقيح 100 ميكرولتر من تعليق خلية بالتساوي على لوحة آغار المتوسطة LB تحتوي على 100 ميكروغرام / مل من المضادات الحيوية الأمبيسلين.
  3. احتضان لوحة اختيار لمدة 15 ساعة على 37 درجة مئوية.
  4. الحفاظ على لوحة الاختيار في 4 درجات مئوية حتى الانتقال الى الخطوة الثقافة، لمدة أقصاها 2 أسابيع تقريبا.
    ملاحظة: المخزون الجلسرين للثقافة البكتيرية (50٪ الجلسرين) وتخزينها في -80 درجة مئوية، يمكن أن تكون على استعداد لبدء الثقافة في مرحلة لاحقة.
  5. إضافة 1 مل 1 م MgSO 4، 1 مل 100 ملي CaCl 2، 10 مل 100X MEM فيتامين مكمل، 1 مل 100 ملغ / الأمبيسلين مل إلى 1 لتر من الأملاح M9 تعقيمها (6 ز نا 2 هبو 4، 3 ز KH 2 PO 4 ، 0.5 غرام كلوريد الصوديوم).
    ملاحظة: سوف راسب أبيض تشكل على إضافة محلول CaCl 2 إلى أملاح M9 أن تبدد بسرعة.
  6. إذابة 300 ملغ من 15 N، متوسطة 13 C-كاملة، 1 غرام من 15NH 4 Cl و 2 غرام من 13 C 6 -glucose في 10 مل من M9 المتوسطة. تصفية تعقيم الحل النظائر باستخدام فلتر 0.2 ميكرون، مباشرة في وسط M9.
  7. تعليق باستخدام التلقيح مستعمرة حلقة واحدة من pET15b-تاو تحول البكتيريا من لوحة التحديد في 20 مل من LB المتوسطة تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين.
  8. احتضان المتوسطة تلقيح عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات.
  9. قياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD 600) في 1 مل من التخفيف عشرة أضعاف من ثقافة البكتيرية في مطياف كفيت بلاستيكية.
    ملاحظة: العكارة للثقافة البكتيرية الموافق OD 600 من 3،0-4،0 يشير إلى أن يتم التوصل إلى مرحلة النمو التشبع.
  10. إضافة 20 مل من ثقافة LB المشبعة إلى 1 لتر من M9 متوسط ​​النمو تستكمل مع الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل تركيز النهائي)، في 2 L مخروطي البلاستيك ثقافة حيرة قارورة.
  11. ضع قارورة الثقافة في حاضنة برمجة مجموعة إلى 10 درجةC و 50 دورة في الدقيقة. برنامج الحاضنة للتبديل إلى 200 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية في وقت مبكر من صباح اليوم التالي.
  12. قياس OD 600 في 1 مل من ثقافة البكتيرية في كفيت مطياف البلاستيك. إضافة 400 ميكرولتر من 1 M IPTG (الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside) حل سهم (الاحتفاظ بها في -20 درجة مئوية) عندما OD 600 تصل قيمتها بحوالي 1.0 للحث على التعبير عن بروتين تاو المؤتلف.
  13. تستمر الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات إضافية. جمع الخلايا البكتيرية بواسطة الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 20 دقيقة.
  14. تجميد بيليه البكتيريا في -20 درجة مئوية. الحفاظ المجمدة حتى خطوة التنقية، لفترة طويلة إذا لزم الأمر.

2. تنقية 15 N، 13 C-تاو (الشكل 2)

  1. الأوتوكلاف الموجبة لتبادل (CEX) مخازن تنقية في 121 درجة مئوية تحت 15 رطل لمدة 20 دقيقة. مخزن مخازن في 4 درجات مئوية.
  2. ذوبان الجليد بيليه الخلية البكتيرية و resuspend بدقة في 45 ملاستخراج CEX مخزن مؤقت (50 ملي نابي عازلة درجة الحموضة 6.5، 1 ملم EDTA) تستكمل حديثا مع مثبط البروتياز 1X كوكتيل (1 قرص) وDNAseI (2000 وحدة).
  3. تعطيل الخلايا البكتيرية باستخدام الخالط الضغط العالي في 20000 رطل. ضرورية 3-4 يمر. أجهزة الطرد المركزي في 20000 x ج لمدة 40 دقيقة لإزالة المواد غير القابلة للذوبان.
  4. تسخين استخراج الخلايا البكتيرية لمدة 15 دقيقة في 75 درجة مئوية باستخدام حمام مائي.
    ملاحظة: لوحظ راسب أبيض بعد بضع دقائق.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 20 دقيقة والحفاظ على طاف التي تحتوي على بروتين تاو للحرارة مستقرة.
  6. مخزن في -20 درجة مئوية حتى الخطوة تنقية التالية، إذا لزم الأمر.
  7. إجراء اللوني الموجبة لتبادل على الراتنج CEX قوي معبأة كعمود 5 مل السرير باستخدام بروتين سريع اللوني السائل (FPLC) نظام (الشكل 3).
    1. تعيين معدل التدفق إلى 2.5 مل / دقيقة.
    2. تتوازن العمود في CEX مخزن مؤقت
    3. تحميل heated- 60-70 ملاستخراج تحتوي تاو باستخدام مضخة عينة، أو ضخ بدلا من A، وفقا للنظام. جمع التدفق من خلال لتحليل للتحقق من أن بروتين تاو وملزمة بكفاءة إلى الراتنج (انظر 2.8).
    4. غسل الراتنج مع CEX مخزن مؤقت حتى الامتصاصية في 280 نانومتر هو العودة إلى القيمة الأساسية.
    5. أزل تاو من العمود باستخدام ثلاث خطوات كلوريد الصوديوم التدرج التي حصلت عليها زيادة تدريجية العازلة CEX ب (CEX مخزن مؤقت مع 1 M كلوريد الصوديوم). برنامج FPLC على النحو التالي: الخطوة الأولى من التدرج إلى 25٪ عازلة CEX B في 10 مجلدات العمود (CV) للوصول إلى 250 مم كلوريد الصوديوم، الخطوة الثانية إلى 50٪ عازلة CEX B في 5 السيرة الذاتية لتصل إلى 500 مم كلوريد الصوديوم، والخطوة الثالثة إلى 100٪ عازلة CEX B في 2 السيرة الذاتية ليصل إلى 1 M كلوريد الصوديوم. جمع 1.5 مل الكسور خلال الخطوات شطف.
  8. تحليل 10 ميكرولتر من الكسور التي تم جمعها خلال الخطوة شطف بواسطة SDS-PAGE (12٪ هلام SDS الأكريلاميد) وCoomassie تلطيخ (الشكل 3 أ) 16. تحقق الخطوة تحميل على العمود وكذلك عن طريق analyزينغ 10 ميكرولتر من التدفق من خلال.
  9. اختيار الكسور التي تحتوي تاو وتجميع هذه الكسور للخطوة التالية.
  10. إجراء التبادل عازلة حول الكسور التي تحتوي على تاو المجمعة (الشكل 3 B).
    1. تتوازن عمود تحلية من 53 مل G25 الراتنج السرير معبأة (26 × 10 سم) في 50 ملي بيكربونات الأمونيوم (عازلة متقلبة) باستخدام نظام FPLC.
    2. مجموعة معدل التدفق إلى 5 مل / دقيقة. حقن عينة تاو على العمود عن طريق حقن حلقة 5 مل. جمع الكسور الموافق ذروة امتصاص عند 280 نانومتر.
    3. تكرار الحقن 3-4 مرات، وهذا يتوقف على حجم حوض السباحة CEX الأولي.
  11. حساب كمية البروتين تاو النقي باستخدام منطقة ذروة اللوني عند 280 نانومتر (1 ملغ من تاو يتوافق مع 140 ماو * مل).
    ملاحظة: معامل الانقراض من البروتين تاو في 280 نانومتر هي 7550 م -1 سم -1. تاو لا يحتوي على أية بقايا التربتوفان.
  12. تجمع كل الأجزاء تاو.
  13. أليكور العينة في أنابيب تحتوي على ما يعادل 1-5 ملغ من تاو. اختيار هذه الأنابيب بحيث يتم صغيرة بالمقارنة مع حجم حل لحجم الأنبوب (على سبيل المثال 5 مل من محلول في أنبوب 50 مل).
  14. لكمة ثقوب في مباراة دولية أنبوب باستخدام إبرة. تجميد عينات تاو في -80 درجة مئوية.
  15. عينات يجفد تاو. يمكن أن تظل بروتين تاو المجففة بالتبريد عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لفترات طويلة من الزمن.

3. في المختبر الفسفرة من 15 N-تاو

  1. حل 5 ملغ من تاو مجفف بالتجميد في 500 العازلة ميكرولتر الفسفرة (50 ملي HEPES · كوه، ودرجة الحموضة 8.0، 12.5 ملي MgCl 2، 1 ملم EDTA، 50 مم كلوريد الصوديوم).
  2. إضافة 2.5 ملي اعبي التنس المحترفين (25 ميكرولتر من 100 ملي حل الأسهم أبقى في -20 درجة مئوية)، 1 ملم DTT (1 ميكرولتر من 1 حل M الأسهم أبقى في -20 درجة مئوية)، 1 ملي EGTA (2 ميكرولتر من الأسهم 0.5 M الحل)، كوكتيل 1X مثبط البروتياز (25 ميكرولتر من الأسهم 40X التي تم الحصول عليها عن طريق إذابة 1 قرص في المخزن 1 مل الفسفرة) و 181؛ M تنشيط صاحب-ERK2 (250 ميكرولتر العازلة في المحافظة 10 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.3، 1 ملم DTT و 5 ملي MgCl 2، 100 مم كلوريد الصوديوم، و 10٪ الجلسرين وتخزينها في -80 درجة مئوية) في حجم العينة الكلي لل 1 مل.
    ملاحظة: تنشيط صاحب-ERK2 يمكن أن تكون مستعدة في المنزل 5،8 من الفسفرة مع كيناز مجاهدي خلق.
  3. احتضان 3 ساعة على 37 درجة مئوية.
  4. تسخين العينة على 75 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة إلى تعطيل إرك كيناز.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 20000 x ج لمدة 15 دقيقة. جمع والحفاظ على طاف.
  6. تحلية العينة البروتين إلى 50 بيكربونات الأمونيوم مم باستخدام عمود من 3.45 مل G25 الراتنج السرير معبأة (1.3 X 2.6 سم)، الذي هو مناسبة لعينة 1 مل.
  7. تشغيل 12٪ SDS-PAGE 16 مع 2.5 ميكرولتر من عينة البروتين إلى التحقق من كل سلامتها والفسفرة كفاءة (الشكل 4).
  8. يجفد العينة تاو فسفرته. تخزين مسحوق عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.

4. اكتساب NMR الأطياف (فايجوري 5)

  1. إذابة 4 ملغ من مجفف بالتجميد 15 N، 13 C-إرك فسفرته-تاو في 400 العازلة ميكرولتر NMR (50 ملي نابي أو 50 ملي بالديوتيريوم Tris- D11 .Cl، ودرجة الحموضة 6.5، 30 ملي كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي EDTA و1 ملم DTT).
  2. إضافة 5٪ D 2 O لتأمين مجال مطياف الرنين المغناطيسي النووي و1 ملم اجتماع الدول الأطراف الثالث (3- (trimethylsilyl) البروبيونيك-2،2،3،3-د 4 حامض الصوديوم الملح)) كمرجع إشارة NMR الداخلية. إضافة 10 ميكرولتر من محلول 40X تقييم كامل الكوكتيل مثبط البروتياز.
  3. نقل العينة في أنبوب NMR 5 مم باستخدام حقنة الإلكترونية مع إبرة طويلة أو ماصة باستير. إغلاق أنبوب الرنين المغناطيسي باستخدام المكبس. إزالة أي فقاعة الهواء المحبوس بين المكبس وسائل حركات الغطاس.
  4. وضع أنبوب الرنين المغناطيسي في الدوار. ضبط موقفها العمودي في الدوار مع المقياس المناسب للرئيس NMR التحقيق المستخدمة، مثل أن معظم محلول العينة ستكون داخل لفائف NMR.
  5. بدء تدفق الهواء: اضغط رفع طن نافذة نظام التحكم المغناطيسي. وضع بعناية الدوار مع أنبوب في تدفق الهواء في الجزء العلوي من تجويف المغناطيس. وقف تدفق الهواء (انقر أسانسير) والسماح للأنبوب ينزل إلى مكان داخل الرأس التحقيق في المغناطيس.
  6. درجة الحرارة تعيين إلى 25 درجة مئوية (298 K).
  7. باملوالفة شبه التلقائي ومطابقة للرئيس التحقيق لنقل الطاقة الأمثل. اكتب atmm على سطر الأوامر.
  8. قفل تردد الطيف باستخدام إشارة D 2 O من العينة المسجلة على قناة الديوتيريوم. انقر القفل في إطار نظام التحكم المغناطيسي.
  9. بدء إجراء الملئ لتحسين تجانس الحقل المغناطيسي للأرض في الموقف من العينة. اكتب topshim واجهة المستخدم الرسومية على سطر الأوامر لفتح نافذة الرقائق. انقر فوق ابدأ في نافذة الرقائق. تحقق من B0 قيمة الاختلاف القياسية المتبقية للتحقق من أن الحشوات هي الأمثل (أقل من 2 هرتز جيد).
  10. معايرة المعلمة P1 (طول بروتوننبض الترددات الراديوية في μsec)، وهو أمر ضروري للحصول على 90 درجة دوران يدور البروتون. تهدف لنبض 360 درجة باستخدام الطيف 1D من البروتونات الماء (الشكل 6).
  11. ضبط تردد يقابله تعيين المعلمة O1 (في هرتز) إلى تردد المياه بروتون في الطيف 1D (الشكل 6).
  12. بدء الاستحواذ على الطيف بروتون 1D (تسلسل النبض مع تسلسل ووترغيت لقمع إشارة المياه، على سبيل المثال zggpw5) للتحقق من إشارات من عينة (الشكل 7). التكيف مع عدد من المسح إلى تركيز البروتين النسبي. اكتب ZG على سطر الأوامر لبدء عملية الاستحواذ.
  13. إعداد المعلمات إضافية لاقتناء 2D [1 H، 15 N] HSQC الطيف (نبض تسلسل hsqcetfpf3gpsi، أرقام 8-9).
    1. ل15 N، وصفت 13 C عينة، فصل 13 مئوية خلال تطور غير مباشر 15 N.
    2. تعيين عدد من النقاط والعرض الطيفي (جزء في المليون) في 1 H (F2) و 15 N أبعاد (F1).
      ملاحظة: تكييف عدد من نقاط البيانات الاستحواذ إلى الميدان مطياف للحفاظ على عدد مماثل من هرتز لكل نقطة وللحد من فصل مرات: استخدام 3072 نقطة في 900 ميغاهرتز و 2048 نقطة في 600 ميغاهيرتز، في البعد 1 H.
    3. تحسين معلمات إضافية في تسلسل نبض الموافق التأخير، أطوال نبض، ويقابل الترددات، ومستويات الطاقة. نوع ASED على سطر الأوامر لعرض كافة المعلمات ذات الصلة للتجربة.
  14. تعيين المعلمات لاقتناء 3D [1 H، N 15، 13 C] الطيف HNCACB (تسلسل نبض hncacbgpwg3d، الشكل 10A) في 600 ميغاهيرتز.
  15. تعيين المعلمات ل3D [1 H، N 15، 15 N] التجربة HNCANNH (نبض تسلسل hncannhgpwg3d) في 600 ميغاهيرتز. تعيين عدد من النقاط إلى 2048 في H 1، و64و 128 نقطة في يومين 15 N الأبعاد. تحديد الاعراض الطيفية إلى 14، 25، 25 أجزاء في المليون (جزء في المليون) تركزت على 4.7، 119، 119 جزء في المليون في 1 H، N 15 و 15 N أبعاد. مدة الحيازة مع 16 بالاشعة هي 1 يوم و 22 ساعة.

5. تحديد مواقع الفسفرة

  1. عملية الأطياف باستخدام اقتناء وتجهيز NMR البرمجيات.
    1. إجراء تحول فورييه من البيانات (الشكل 7). نوع قدم لطيف 1D، xfb لطيف 2D أو ft3d لطيف 3D، على سطر الأوامر.
    2. مرحلة ومرجعية كل الأطياف (الشكل 7C) باستخدام النوافذ التفاعلية.
  2. تحديد الأصداء من الاهتمام في 2D HSQC يحتمل الموافق فسفرته بقايا سر ومنتدى المجالس الرومانسية (الشكل 9، مربع أحمر).
  3. طائرات استخراج (أي 2D 1 ح 13 C الأطياف) منوC طيف 3D 1 ح 15 N- 13 باستخدام 15 N التحولات الكيميائية من الأصداء من الاهتمام في 2D. استخدام المؤشر من البعد 2 (W2) لاختيار تردد 15 N المقابلة لطائرة (W1-W3) أن تصور (الشكل 10B).
  4. اختيار ترددات الرنين من "كاليفورنيا" و "سي بي" 13 نواة C من 'ط' والمخلفات "ط-1" (مجموعة أضعف من إشارات مقارنة مع تلك المخلفات ط) لكل [1 H، 15 N] صدى من الفائدة في الطيف HNCACB 3D عن طريق النقر على الرنين، في القائمة وضع مؤشر تجد / إضافة الذروة، لإضافة قيمة التحول الكيميائية في ملف قمة القائمة.
    1. تحديد نوع ط بقايا، pSer أو pThr، من خلال مقارنة التبدلات الكيماوية في قائمة الذروة إلى القيم المعروفة من كاليفورنيا والتحولات CB الكيميائي للpSer وpThr 17.
    2. تحديد وجود بقايا برو في ط + 1 موقف من قبل مميزة إضافية +2 جزء في المليون تحول سو قيمة التحول CA الكيماوية 18.
    3. مقارنة القيم التحول الكيميائي للCA و CB الأصداء المقابلة لبقايا ط 1 إلى جدول التحولات الكيميائية وتوقع لتاو بقايا الأحماض الأمينية 19 إلى التعرف على طبيعة المخلفات في موقف ط 1.
  5. اختيار ترددات الرنين من 15 N نوى من 'ط' و 'ط 1 "بقايا لكل بالرنين [1 H، 15 N] من الفائدة في الطيف HNCANNH.
  6. مقارنة 15 N القيم التحول الكيميائي على احالة التحول الكيميائي للبروتين تاو 20-23.
  7. مقارنة dipeptides تحديدها مع تسلسل تاو لتحديد المهمة المحددة التسلسل.

النتائج

ويبين الشكل 3A ذروة امتصاص الرئيسية في 280 نانومتر لوحظت خلال التدرج شطف. هذه الذروة يتوافق مع بروتين تاو تنقيته كما هو ظاهر على هلام الأكريلاميد فوق اللوني. ويبين الشكل 3B ذروة امتصاص فصل جيدا في 280 نانومتر، وذروة الموصلية، وضمان أن إزالة الأملاح من البروتين فعال...

Discussion

وقد استخدمنا مطيافية الرنين النووي المغناطيسي لتحديد خصائص العينات تاو تعديل إنزيمي. يمكن كذلك التعبير المؤتلف وتنقية وصفها هنا للحصول على كامل طول البروتين تاو البشري أن تستخدم لإنتاج متحولة تاو تاو أو المجالات. نظائريا هناك حاجة إلى البروتين المخصب لمطيافية الرن...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The NMR facilities were funded by the Région Nord, CNRS, Pasteur Institute of Lille, European Community (FEDER), French Research Ministry and the University of Sciences and Technologies of Lille. We acknowledge support from the TGE RMN THC (FR-3050, France), FRABio (FR 3688, France) and Lille NMR and RPE Health and Biology core facility. Our research is supported by grants from the LabEx (Laboratory of Excellence) DISTALZ (Development of Innovative Strategies for a Transdisciplinary approach to Alzheimer's disease), EU ITN TASPPI and ANR BinAlz.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
pET15B recombinant T7 expression plasmidNovagen69257Keep at -20 °C
BL21(DE3) transformation competent E. coli bacteriaNew England BiolabsC2527IKeep at -80 °C
Autoclaved LB Broth, Lennox DIFCO240210Bacterial Growth Medium
MEM vitamin complements 100xSigma58970CBacterial Growth Medium Supplement
15N, 13C-ISOGRO complete medium powderSigma608297Bacterial Growth Medium Supplement
15NH4ClSigma299251Isotope
13C6-GlucoseSigma389374Isotope
Protease inhibitor tablets Roche5056489001Keep at 4 °C
1 tablet in 1 ml is 40x solution that can be kept at -20 °C
DNaseIEUROMEDEX1307Keep at -20 °C
Homogenizer (EmulsiFlex-C3)AVESTINLysis is realized at 4 °C
Pierce™ Unstained Protein MW MarkerPierce266109
Active human MEK1 kinase, GST TaggedSigmaM8822Keep at -80 °C
AKTÄ Pure chromatography systemGE HealthcareFPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 ml column)GE Healthcare17-5156-01Cation exchange chromatography columns
HiPrep 26/10 DesaltingGE Healthcare17-5087-01Protein Desalting column
PD MidiTrap G-25GE Healthcare28-9180-08Protein Desalting column
Tris D11, 97% DCortecnetCD4035P5Deuterated NMR buffer
5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O (set of 5 inner & outerpipe) Euriso-topBMS-005BNMR Shigemi Tubes
eVol kit-electronic syringe starter kitCortecnet2910000Pipetting
Bruker 900 MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probeheadBrukerNMR spectrometer for data acquisition
Bruker 600 MHz Avance with a triple resonance cryogenic probeheadBrukerNMR spectrometer for data acquisition
TopSpin 3.1BrukerAcquisition and Processing software for NMR experiments
Sparky 3.114UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller)NMR data Analysis software

References

  1. Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K., Tung, Y. C., Quinlan, M., Wisniewski, H. M., Binder, L. I. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83 (13), 4913-4917 (1986).
  2. Hasegawa, M., Morishima-Kawashima, M., Takio, K., Suzuki, M., Titani, K., Ihara, Y. Protein sequence and mass spectrometric analyses of tau in the Alzheimer's disease brain. J. Biol. Chem. 267 (24), 17047-17054 (1992).
  3. Kopke, E., Tung, Y. C., Shaikh, S., Alonso, A. C., Iqbal, K., Grundke-Iqbal, I. Microtubule-associated protein tau. Abnormal phosphorylation of a non-paired helical filament pool in Alzheimer disease. J. Biol. Chem. 268 (32), 24374-24384 (1993).
  4. Wischik, C. M., Edwards, P. C., et al. Quantitative analysis of tau protein in paired helical filament preparations: implications for the role of tau protein phosphorylation in PHF assembly in Alzheimer's disease. Neurobiol. Aging. 16 (3), 409-417 (1995).
  5. Prabakaran, S., Everley, R. A., et al. Comparative analysis of Erk phosphorylation suggests a mixed strategy for measuring phospho-form distributions. Mol. Syst. Biol. 7, 482 (2011).
  6. Landrieu, I., Lacosse, L., et al. NMR analysis of a Tau phosphorylation pattern. J. Am. Chem. Soc. 128 (11), 3575-3583 (2006).
  7. Amniai, L., Barbier, P., et al. Alzheimer disease specific phosphoepitopes of Tau interfere with assembly of tubulin but not binding to microtubules. FASEB J. 23 (4), 1146-1152 (2009).
  8. Qi, H., Prabakaran, S., et al. Characterization of Neuronal Tau Protein as a Target of Extracellular Signal-regulated Kinase. J. Biol. Chem. 291 (14), 7742-7753 (2016).
  9. Bibow, S., Ozenne, V., Biernat, J., Blackledge, M., Mandelkow, E., Zweckstetter, M. Structural impact of proline-directed pseudophosphorylation at AT8, AT100, and PHF1 epitopes on 441-residue tau. J. Am. Chem. 133 (40), 15842-15845 (2011).
  10. Boulton, T. G., Yancopoulos, G. D., et al. An insulin-stimulated protein kinase similar to yeast kinases involved in cell cycle control. Science. 249 (4964), 64-67 (1990).
  11. Anderson, N. G., Maller, J. L., Tonks, N. K., Sturgill, T. W. Requirement for integration of signals from two distinct phosphorylation pathways for activation of MAP kinase. Nature. 343 (6259), 651-653 (1990).
  12. Seger, R., Ahn, N. G., et al. Microtubule-associated protein 2 kinases, ERK1 and ERK2, undergo autophosphorylation on both tyrosine and threonine residues: implications for their mechanism of activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88 (14), 6142-6146 (1991).
  13. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
  14. Rosenberg, A. H., Lade, B. N., Chui, D. S., Lin, S. W., Dunn, J. J., Studier, F. W. Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene. 56 (1), 125-135 (1987).
  15. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166 (4), 557-580 (1983).
  16. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  17. Bienkiewicz, E. A., Lumb, K. J. Random-coil chemical shifts of phosphorylated amino acids. J. Biomol. NMR. 15 (3), 203-206 (1999).
  18. Wishart, D. S., Bigam, C. G., Holm, A., Hodges, R. S., Sykes, B. D. 1H, 13C and 15N random coil NMR chemical shifts of the common amino acids. I. Investigations of nearest-neighbor effects. J Biomol NMR. 5 (1), 67-81 (1995).
  19. Tamiola, K., Acar, B., Mulder, F. A. A. Sequence-specific random coil chemical shifts of intrinsically disordered proteins. J. Am. Chem. Soc. 132 (51), 18000-18003 (2010).
  20. Lippens, G., Wieruszeski, J. M., et al. Proline-directed random-coil chemical shift values as a tool for the NMR assignment of the tau phosphorylation sites. Chembiochem. 5 (1), 73-78 (2004).
  21. Smet, C., Leroy, A., Sillen, A., Wieruszeski, J. M., Landrieu, I., Lippens, G. Accepting its random coil nature allows a partial NMR assignment of the neuronal Tau protein. Chembiochem. 5 (12), 1639-1646 (2004).
  22. Mukrasch, M. D., Bibow, S., et al. Structural polymorphism of 441-residue tau at single residue resolution. PLoS Biol. 7 (2), e34 (2009).
  23. Harbison, N. W., Bhattacharya, S., Eliezer, D. Assigning backbone NMR resonances for full length tau isoforms: efficient compromise between manual assignments and reduced dimensionality. PloS One. 7 (4), e34679 (2012).
  24. Morris, M., Knudsen, G. M., et al. Tau post-translational modifications in wild-type and human amyloid precursor protein transgenic mice. Nat. Neurosci. 18 (8), 1183-1189 (2015).
  25. Mair, W., Muntel, J., et al. FLEXITau: Quantifying Post-translational Modifications of Tau Protein in Vitro and in Human Disease. Analytical Chemistry. 88 (7), 3704-3714 (2016).
  26. Leroy, A., Landrieu, I., et al. Spectroscopic studies of GSK3{beta} phosphorylation of the neuronal tau protein and its interaction with the N-terminal domain of apolipoprotein E. J. Biol. Chem. 285 (43), 33435-33444 (2010).
  27. Theillet, F. -. X., Smet-Nocca, C., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
  28. Qi, H., Cantrelle, F. -. X., et al. Nuclear magnetic resonance spectroscopy characterization of interaction of Tau with DNA and its regulation by phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
  29. Cordier, F., Chaffotte, A., Wolff, N. Quantitative and dynamic analysis of PTEN phosphorylation by NMR. Methods. 77-78, 82-91 (2015).
  30. Thongwichian, R., Kosten, J., et al. A Multiplexed NMR-Reporter Approach to Measure Cellular Kinase and Phosphatase Activities in Real-Time. J. Am. Chem. Soc. 137 (20), 6468-6471 (2015).
  31. Smith, M. J., Marshall, C. B., Theillet, F. -. X., Binolfi, A., Selenko, P., Ikura, M. Real-time NMR monitoring of biological activities in complex physiological environments. Curr. Opin. Struct. Biol. 32, 39-47 (2015).
  32. Theillet, F. X., Rose, H. M., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
  33. Bodart, J. -. F., Wieruszeski, J. -. M., et al. NMR observation of Tau in Xenopus oocytes. J. Magn. Reson. 192 (2), 252-257 (2008).
  34. Lippens, G., Landrieu, I., Hanoulle, X. Studying posttranslational modifications by in-cell NMR. Chem. Biol. 15, 311-312 (2008).
  35. Landrieu, I., Smet-Nocca, C., et al. Molecular implication of PP2A and Pin1 in the Alzheimer's disease specific hyperphosphorylation of Tau. PLoS One. 6, e21521 (2011).
  36. Sibille, N., Huvent, I., et al. Structural characterization by nuclear magnetic resonance of the impact of phosphorylation in the proline-rich region of the disordered Tau protein. Proteins. 80 (2), 454-462 (2012).
  37. Schwalbe, M., Kadavath, H., et al. Structural Impact of Tau Phosphorylation at Threonine 231. Structure. 23 (8), 1448-1458 (2015).
  38. Amniai, L., Lippens, G., Landrieu, I. Characterization of the AT180 epitope of phosphorylated Tau protein by a combined nuclear magnetic resonance and fluorescence spectroscopy approach. Biochem. Biophys. Res. Commun. 412 (4), 743-746 (2011).
  39. Sottejeau, Y., Bretteville, A., et al. Tau phosphorylation regulates the interaction between BIN1's SH3 domain and Tau's proline-rich domain. Acta Neuropathol. Commun. 3 (1), (2015).
  40. Joo, Y., Schumacher, B., et al. Involvement of 14-3-3 in tubulin instability and impaired axon development is mediated by Tau. FASEB J. 29 (10), 4133-4144 (2015).
  41. Smet, C., Duckert, J. F., et al. Control of protein-protein interactions: structure-based discovery of low molecular weight inhibitors of the interactions between Pin1 WW domain and phosphopeptides. J. Med. Chem. 48 (15), 4815-4823 (2005).
  42. Milroy, L. -. G., Bartel, M., et al. Stabilizer-Guided Inhibition of Protein-Protein Interactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 54 (52), 15720-15724 (2015).
  43. Smet, C., Sambo, A. V., et al. The peptidyl prolyl cis/trans-isomerase Pin1 recognizes the phospho-Thr212-Pro213 site on Tau. Biochemistry. 43 (7), 2032-2040 (2004).
  44. Landrieu, I., Smet, C., et al. Exploring the molecular function of PIN1 by nuclear magnetic resonance. Curr Protein Pept Sci. 7 (3), 179-194 (2006).
  45. Lippens, G., Landrieu, I., Smet, C. Molecular mechanisms of the phospho-dependent prolyl cis/trans isomerase Pin1. FEBS J. 274 (20), 5211-5222 (2007).
  46. Smet-Nocca, C., Launay, H., Wieruszeski, J. M., Lippens, G., Landrieu, I. Unraveling a phosphorylation event in a folded protein by NMR spectroscopy: phosphorylation of the Pin1 WW domain by PKA. J. Biomol. NMR. 55, 323-337 (2013).
  47. Smet-Nocca, C., Wieruszeski, J. M., Melnyk, O., Benecke, A. NMR-based detection of acetylation sites in peptides. J. Pept. Sci. 16 (8), 414-423 (2010).
  48. Kamah, A., Huvent, I., et al. Nuclear magnetic resonance analysis of the acetylation pattern of the neuronal Tau protein. Biochemistry. 53 (18), 3020-3032 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

118

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved