核磁共振光谱法本质无序蛋白的磷酸化多元的鉴定

摘要

We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

摘要

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau's heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.

引言

其中一个在21 ^世纪医疗保健的主要挑战是神经退行性疾病如阿尔茨海默病（AD）。头是一个微管相关蛋白，刺激微管（MT）的形成。头被均等地参与了一些神经变性疾病，所谓τ病变，其中最有名的是广告。在这些疾病中成对螺旋丝（的PHF）头自聚集，并发现修改由翻译后后修饰，如磷酸^1个多残留。 Tau蛋白的磷酸化在MT稳定和功能丧失的病理表征AD神经元及其生理功能的调节都牵连。

此外，Tau蛋白，在神经元病中集成的PHF时，则不约而同地过度磷酸^2。不同于含有2-3个磷酸基团正常头，在对的PHF tau蛋白含有5至9 phosphatË组^3。 tau蛋白对应既能在一些网站和被称为磷酸化位点病理其他站点的磷酸化增加了化学计量。然而，重叠的AD和磷酸化的正常成人图案之间存在，尽管在⁴级量化的差别。具体怎么磷酸化事件的影响作用和Tau功能障碍仍是未知。我们的目标是通过翻译后修饰在分子水平上破译头监管。

深化头的分子方面的理解，我们必须解决的技术难题。首先，头在溶液中分离出来时，一个内在的无序蛋白（IDP）。这样的蛋白质缺乏在生理条件下明确定义的三维结构并需要特定的生物物理方法来研究它们的功能（S）和结构特性。头是为不断增长的国内流离失所者类的一个范例，经常发现关联疾病，如神经退行性疾病，从而增加利息，了解他们的基本功能分子参数。其次，tau蛋白磷酸表征是一个分析的挑战，随着时间最长的441氨基酸头亚型的序列80的潜在磷酸化位点。一些抗体已经开发针对头的磷酸化表位，并用于在神经元或脑组织检测病理头的。磷酸化事件可以采取由脯氨酸的激酶靶向至少有20处地点，其中大多数是在富含脯氨酸的区域内近在咫尺。定性（哪些网站？）和定量（化学计量学什么？）特性是很难甚至最新的MS技术^5。

核磁共振光谱可用于研究是高度构成构象合奏的动态系统紊乱的蛋白质。高分辨率核磁共振光谱是APPLI编调查Tau蛋白的两个结构和功能。另外，该头的磷酸化信息的复杂性导致了使用NMR对磷酸化位点⁶的识别分子的工具和新的分析方法的发展^{- 8。}核磁共振作为分析方法允许在全局方式识别的头磷酸化位点，在一个单一实验中的所有的单点修饰的可视化和量化磷酸并入的程度。因为虽然tau蛋白磷酸的研究在文献中比比皆是，他们大多已与抗体进行，留下了磷酸化的完整个人资料大程度的不确定性，因此个别磷酸化事件的真正影响这一点是至关重要的。重组激酶，包括PKA，糖原合酶激酶3β（GSK3β），细胞周期蛋白依赖性激酶2 /细胞周期蛋白A（CDK2 / CycA），细胞周期蛋白依赖性激酶5（CDK5）/ P25行为ivator蛋白质，细胞外信号调节的激酶2（ERK2）和微管亲合性 - 调节激酶（MARK），其显示向头磷酸化活性，可以以活性形式来制备。另外，头突变体，其允许产生与充分表征的磷酸化模式特定Tau蛋白同种型用于破译头的磷酸化的代码。然后NMR谱来表征酶改性头样品^{6 - 8。}虽然在体外头的磷酸化是比伪磷酸更具挑战性，例如通过选定的丝氨酸/苏氨酸的突变成谷氨酸（谷氨酸）残基，该方法有其优点。实际上，无论是磷酸化的结构影响也没有相互作用参数总是可以通过谷氨酸模拟。一个例子是围绕磷酸丝氨酸202（pSer202）观察到的转基序/磷酸苏205（pThr205），这是不符合谷氨酸突变⁹再现。

在这里，同位素标记的牛头核磁共振调查准备将首先描述。通过ERK2磷酸化tau蛋白被修改的描述为磷酸化位点病理遗迹众多，因此代表tau蛋白的一个有趣的模式。薮中通过重组ERK2激酶磷酸化体外了详细的方案提出。 ERK2是通过磷酸化而活化有丝分裂原活化蛋白激酶/ ERK激酶^{（MEK）10 - 12。}另外修改，同位素标记的Tau蛋白的制备中，用于翻译后修饰的识别核磁共振策略进行说明。

研究方案

1.生产的^{15 N，13} C-头（图1）

1. 变换的pET15b-头重组T7表达质粒^13,14到BL21（DE3）感受态大肠杆菌细菌细胞^15。
   注:该cDNA编码最长的（441个氨基酸残基）头同种型中的的pET15b质粒NcoI和XhoI限制性位点之间克隆。
   1. 轻轻混匀50微升感受态BL21（DE3）细胞，形成每质粒DNA微克1-5×10 ⁷个菌落，用100ng质粒DNA在1.5ml塑料管中。
      注:密码子用法优化的真核cDNA表达的细菌菌株不必需产生人头。
   2. 放置在冰上的细胞混合物30分钟，然后热休克10秒，在42℃。放置管回冰上5分钟，加入1ml室温的LB（Luria液体-BERTANI）培养基。孵育在37℃下的细菌悬浮液用于下温和30分钟搅动。
2. 传播用接种环将100μl细胞悬浮液均匀的到含有100微克/ ml氨苄青霉素的抗生素的LB培养基的琼脂平板上。
3. 在37℃下孵育15小时的选择板。
4. 保持在4℃的选择板，直到继续到培养步骤，对于一个最大2周大约的。
   注:细菌培养物（50％甘油）中的甘油，保存于-80℃下，可以制备在稍后阶段开始培养。
5. 加入1ml的1M _硫酸镁 ，1毫升的100mM的CaCl _2，将10毫升100×MEM维生素补充，1毫升100毫克/毫升氨苄青霉素至1L高压灭菌的M9盐（6克Na ₂ HPO _4，3克KH ₂ PO ₄ ，0.5克NaCl）。
   注:白色的沉淀物会形成在加入_氯化钙解决这一迅速消散的M9盐。
6. 溶解300毫克^{15 N，13} C-完全培养基1克¹⁵_氯化铵和2g的¹³ C ₆ -葡萄糖在10ml M9培养基中。过滤-消毒使用0.2微米的过滤器，直接进入M9培养基同位素溶液。
7. 暂停使用的pET15b-头的一个接种环将一个菌落在20毫升LB培养基中补充有100微克/毫升氨苄青霉素的转化的细菌从选择板。
8. 孵育在37℃的接种培养基中约6小时。
9. 测量在600nm（OD _600）上1毫升细菌培养物的十倍稀释在塑料分光计比色皿的光密度。
   注:对应于OD 3.0-4.0 ₆₀₀的细菌培养物浊度指示存在正在达到饱和的生长阶段。
10. 将20毫升的饱和的LB培养物添加到1升补充有氨苄青霉素（100μg/ ml的终浓度）的M9培养基中，在2升的Erlenmeyer塑料挡板培养瓶中。
11. 放置培养瓶在可编程培养箱设定为10°℃和50转。编程培养箱提前切换到200rpm下和37℃，在第二天早晨。
12. 在一个塑料试管分光计1毫升细菌培养的措施OD _600。加入400微升的1M的IPTG（异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷）原液（保持在-20℃）时的OD ₆₀₀达到约1.0的值以诱导重组Tau蛋白的表达。
13. 继续在37℃下温育另外3小时。收集经离心细菌细胞以5,000 xg离心20分钟。
14. 冻结在-20℃将细菌沉淀。如果需要保持冷冻，直到纯化步骤，对于延长的时间。

2.净化^{15 N，13} C-头（图2）

1. 在121℃下为15psi进行20分钟的高压釜阳离子交换（CEX）纯化缓冲器。存储缓冲区在4℃。
2. 解冻细菌细胞沉淀，并在45ml充分悬浮提取CEX的缓冲（50毫米那匹缓冲液pH 6.5，1毫米EDTA）新鲜补充蛋白酶抑制剂1×（1片）和DNA酶I（2000台）。
3. 使用高压均化器以20,000 psi的破坏细菌细胞。 3-4通行证是必要的。离心机以20,000×g离心40分钟以除去不溶性物质。
4. 使用水浴加热15分钟，细菌细胞提取物在75℃。
   注意:一白色沉淀几分钟后观察到的。
5. 离心在15,000rpm×g离心20分钟，并保持上清液含有热稳定Tau蛋白。
6. 在-20℃储存，直到下面的纯化步骤，如果需要的话。
7. 在填充作为使用快速蛋白质液相色谱（FPLC）系统（ 图3A）5ml的床柱强烈CEX树脂进行阳离子交换色谱。
   1. 设定流速2.5毫升/分钟。
   2. 在CEX平衡柱子的缓冲区
   3. 装入60-70毫升heated-提取使用样品泵头含有，或者A泵，这取决于系统。收集用于分析，以验证Tau蛋白被有效地结合到树脂（见2.8）流过。
   4. 与CEX洗涤树脂缓冲，直到在280吸光度是回到基准值。
   5. 洗脱头使用由CEX B缓冲液的逐渐增加而获得的三步骤NaCl梯度的柱（CEX用1M NaCl的缓冲液）。程序的FPLC如下:梯度至25％的CEX B缓冲液中10个柱体积（CV），以达到250 mM氯化钠，第二步70％的CEX B缓冲液中5 CV达到500 mM氯化钠的第一步骤，和第三步骤2 CV 100％CEX B缓冲液，以达到1 M氯化钠。在洗脱步骤收集1.5毫升分数。
8. 分析10微升在洗脱步骤通过SDS-PAGE（12％SDS-丙烯酰胺凝胶）和考马斯染色（ 图^{3A）16 中}收集的级分。检查在柱上装载步骤，以及通过ANALY查懋10微升流通的。
9. 选择含头的级分，并汇集这些级分的下一个步骤。
10. 在执行牛头含合并的级分（ 图3 B）的缓冲交换。
    1. 平衡在50mM碳酸氢铵（易失性缓冲区），使用FPLC系统53毫升G25树脂的填充床（26×10厘米）的脱盐柱。
    2. 设定流量至5毫升/分。通过5ml的注射环注入在列的头样品。收集对应于吸收峰在280nm处的级分。
    3. 重复注射3-4次，这取决于初始CEX池的体积。
11. 通过使用色谱的峰面积在280纳米（1毫克头的对应于140 MAU *毫升）计算纯化的Tau蛋白的量。
    注:Tau蛋白的在280nm的消光系数是7,550 M ^{-1 -1。}头不包含任何色氨酸残基。
12. 池中的所有头部分。
13. Aliquot是样品放入含有1至5mg头相当于管。使溶液的体积相比是很小的管（例如，5毫升溶液在50ml管）的容积选择这些管。
14. 冲用针在管帽的孔。在-80℃冷冻头的样品。
15. 牛头冷冻干燥样品。冻干Tau蛋白可以保持在-20℃的很长一段时间。

3. ¹⁵ N-头的体外磷酸化

1. 溶解于500μl磷酸缓冲液（50毫摩尔的Hepes·KOH，pH值8.0，12.5毫_氯化镁 ，1毫摩尔EDTA，50毫摩尔NaCl）5毫克冻干头的。
2. 添加2.5mM的ATP（25微升的100mM储备溶液保持在-20℃），1毫摩尔DTT（1微升的1M储备溶液保持在-20℃），1毫EGTA（2微升0.5M的股票的溶液），1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒（25微升溶解1片而获得的40倍的库存在1ml磷酸缓冲液）和181，M活化的His-ERK2（250微升在保护缓冲器的10mM Hepes，pH值7.3，1毫摩尔DTT，5mM的MgCl ₂的，100毫摩尔NaCl和10％甘油，保存于-80℃）中的总样品体积1毫升
   注:激活了他，ERK2可以在内部^5,8通过与MEK激酶磷酸化做好准备。
3. 孵育在37℃下3小时。
4. 加热在75℃下的样品15分钟以灭活ERK激酶。
5. 离心以20,000 xg离心15分钟。收集和保存上清。
6. 脱盐使用3.45毫升G25树脂的填充床（1.3×2.6厘米），其适用于1毫升样品的列中的蛋白质样品放入50mM碳酸氢铵。
7. 运行在12％的SDS-PAGE ¹⁶ 2.5微升蛋白质样品的同时检查它的完整性和有效的磷酸化（ 图4）。
8. 冻干磷酸化Tau蛋白样品。储存在-20℃的粉末。

4. NMR光谱采集（网络连接古尔5）

1. 溶解4毫克的冻干^{15 N，13} C的ERK磷酸化，头于400μlNMR缓冲液（50mM NAPI或50mM的氘化的三- D11 .CL，pH值6.5，30 mM氯化钠，2.5毫摩尔EDTA和1mM DTT）。
2. 加入5％D ₂ O的核磁共振波谱仪的领域锁定和1毫米第三次会议（3-（三甲基硅基）丙酸-2,2,3,3-D ₄磺酸钠））内部的核磁共振信号的参考。添加10微升完全蛋白酶抑制剂混合物的40倍原液的。
3. 使用电子注射器长针或巴斯德吸管采用5 mm NMR管转移的样品。用柱塞关闭NMR管。删除由活塞运动被困柱塞和液体之间的任何气泡。
4. 将核磁共振管在旋转。调整其垂直位置与用于所使用的NMR探头适当规喷丝，使得大多数样品溶液将是核磁共振线圈的内侧。
5. 启动空气流量:点击我抬n个磁铁控制系统窗口。小心地与在气流管内的离心器在磁体孔的顶部。停止空气流量（点击电梯 ），并让管下降到磁体中的探头内的地方。
6. 设定温度至25℃（298K）。
7. 执行半自动调谐和探针头的匹配来优化电力传输。 ATMM键入命令行上。
8. 锁用记录在氘信道的样本的D ₂ O中的信号的光谱仪的频率。在磁铁控制系统窗口中单击锁定 。
9. 启动垫补过程在样品的位置，以优化的磁场的均匀性。键入topshim贵在命令行打开垫片窗口。点击开始垫片窗口。检查剩余B0标准变化值，以确认垫片是最优的（小于2 Hz的频率是好的）。
10. 校准质子的P1参数（长在微秒射频脉冲），这是必要的，以获得一个90°旋转质子自旋。瞄准使用水的质子的一维谱（ 图6）的360°脉冲。
11. 调整频率通过设置O1参数（单位为Hz），以在一维光谱质子水频率（ 图6）的偏移。
12. 开始采集一维质子谱（与水的信号抑制水门序列脉冲序列，例如zggpw5）来验证从样品（ 图7）的信号。适应扫描次数的相对蛋白质浓度。 ZG型在命令行上开始采集。
13. 设置附加参数收购二维^{[1 H，15} N] HSQC谱（脉冲序列hsqcetfpf3gpsi， 图8-9）。
    1. 对于一个^{15 N，13} C标记的样本中^，15 N间接的进化过程中分离^13℃。
    2. 设置点中的¹ H（F2），和¹⁵ N（F1），尺寸谱宽（PPM）的数量和。
       注:适应的采集数据点到光谱仪场的数目，以保持每点的类似赫兹的数，并限制去耦次:在900兆赫和600兆赫2048点使用3,072点，在通过¹ H维。
    3. 优化在脉冲序列的其他参数，对应于延迟，脉冲长度，偏移频率，功率电平。 ASED在命令行中键入显示相关实验的所有参数。
14. 收购了3D的设定参数^{[1 H，15 N，13} C]在600兆赫频谱HNCACB（脉冲序列hncacbgpwg3d， 图10A）。
15. 设定参数为一个三维^{[1 H，15 N，15} N] HNCANNH实验（脉冲序列hncannhgpwg3d）在600兆赫。设置点的数量为2048的¹ H和64和128分的两个¹⁵ N维。定义光谱宽度为14，25，百万分之一（ppm）25份集中在4.7，119，119 ppm的在¹小时^，15 N和¹⁵ N尺寸。收购与16扫描持续时间是1天22小时。

5.磷酸化位点鉴定

1. 使用采集和处理NMR软件过程谱。
   1. 执行数据（ 图7）的傅里叶变换。类型英尺为一维谱，XFB用于2D谱或ft3d用于3D谱，在命令行上。
   2. 相位和参考的所有光谱（ 图7C）使用交互式窗口。
2. 识别在2D HSQC潜在对应于磷酸化丝氨酸和苏氨酸残基（ 图9，红色框）兴趣共振。
3. 提取平面（ 即二维¹ H- ¹³ C谱）从使用的在2D兴趣谐振的¹⁵ N的化学位移的三维¹ H ¹⁵ N- ¹³ C谱。使用尺寸2（W2）的光标来选择相应于平面（W1-W3）而被可视化的^15个 N分频（ 图10B）。
4. 接"CA"的谐振频率和的"i"的^"CB"13 C-核和的"i-1"的残基（更弱的信号组相比，这些第i残基的）为每个^{[1 H，15} N]共振通过点击共振，处于指针模式菜单中的HNCACB三维频谱的兴趣查找/添加高峰，在一个峰值列表文件中添加化学位移值。
   1. 识别我渣型，pSER的或PTHR，由峰值列表化学位移比较CA的已知值和pSER的和PTHR ¹⁷ CB化学位移。
   2. 一个特征性+2 ppm的转变o确定在i + 1的位置上的Pro残基的存在F中的CA化学位移值^18。
   3. 比较对应于第i-1残基，以预测头氨基酸残¹⁹在第i-1位，以确定残余物的性质，化学位移的一个表的CA和CB共振的化学位移值。
5. 匹克的'我^'15 N核共振频率和"I-1"残基在HNCANNH频谱每个感兴趣^{[1 H，15} N]共鸣。
6. 比较¹⁵ N的化学位移值的Tau蛋白²⁰的化学位移分配^{- 23。}
7. 比较确定的二肽与头序列来定义序列特异性分配。

结果

图3A示出了在洗脱梯度过程中观察到280纳米的大吸收峰。这个峰对应于纯化的Tau蛋白的丙烯酰胺凝胶色谱以上所见。 图3B示出在280nm和电导率的峰的很好地分离的吸收峰，从而确保该蛋白质的脱盐是有效的。 图4示出了通过SDS-PAGE分析观察到多种蛋白磷酸化的¹⁶特性蛋白凝胶迁移（比较泳道2和3）。 图6示出了具有增加的脉冲长度（以微秒）的一系列质子

讨论

我们已经使用NMR光谱法表征酶改性头样品。重组表达和这里描述的全长人Tau蛋白纯化可以类似地用于产生突变体头或头域。同位素是需要核磁共振光谱富集蛋白质，因此有必要重组表达。磷酸化位点的识别，需要共振分配和^{15 N，13} C双重标记的蛋白质。定同位素的成本，良好的产率，需要在该重组表达的步骤。葡萄糖是在M9培养基中细菌的生长，因此¹³ C ₆ -葡萄糖?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
pET15B recombinant T7 expression plasmid	Novagen	69257	Keep at -20 °C
BL21(DE3) transformation competent E. coli bacteria	New England Biolabs	C2527I	Keep at -80 °C
Autoclaved LB Broth, Lennox	DIFCO	240210	Bacterial Growth Medium
MEM vitamin complements 100x	Sigma	58970C	Bacterial Growth Medium Supplement
15N, 13C-ISOGRO complete medium powder	Sigma	608297	Bacterial Growth Medium Supplement
15NH4Cl	Sigma	299251	Isotope
13C6-Glucose	Sigma	389374	Isotope
Protease inhibitor tablets	Roche	5056489001	Keep at 4 °C
1 tablet in 1 ml is 40x solution that can be kept at -20 °C
DNaseI	EUROMEDEX	1307	Keep at -20 °C
Homogenizer (EmulsiFlex-C3)	AVESTIN		Lysis is realized at 4 °C
Pierce™ Unstained Protein MW Marker	Pierce	266109
Active human MEK1 kinase, GST Tagged	Sigma	M8822	Keep at -80 °C
AKTÄ Pure chromatography system	GE Healthcare		FPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 ml column)	GE Healthcare	17-5156-01	Cation exchange chromatography columns
HiPrep 26/10 Desalting	GE Healthcare	17-5087-01	Protein Desalting column
PD MidiTrap G-25	GE Healthcare	28-9180-08	Protein Desalting column
Tris D11, 97% D	Cortecnet	CD4035P5	Deuterated NMR buffer
5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O (set of 5 inner & outerpipe)	Euriso-top	BMS-005B	NMR Shigemi Tubes
eVol kit-electronic syringe starter kit	Cortecnet	2910000	Pipetting
Bruker 900 MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead	Bruker		NMR spectrometer for data acquisition
Bruker 600 MHz Avance with a triple resonance cryogenic probehead	Bruker		NMR spectrometer for data acquisition
TopSpin 3.1	Bruker		Acquisition and Processing software for NMR experiments
Sparky 3.114	UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller)		NMR data Analysis software