Kernresonanzspektroskopie zur Identifizierung von Multiple Phosphorylierungen von intrinsisch ungeordneten Proteinen

Zusammenfassung

We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

Zusammenfassung

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau's heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.

Einleitung

Eine der wichtigsten Herausforderungen der Gesundheitsversorgung im ^21. Jahrhundert sind neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer - Krankheit (AD). Tau ist ein Mikrotubuli-assoziiertes Protein, das Mikrotubuli (MT) Bildung stimuliert. Tau gleichmäßig in mehreren neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt sind, sogenannte Tauopathien, von denen die bekannteste AD ist. In dieser Erkrankungen, Tau Selbst Aggregate in gepaarte helikale Filamente (PHFs) und fand bei vielen Reste durch posttranslationale Modifikationen (PTMs) wie Phosphorylierung ¹ modifiziert ist. Die Phosphorylierung des Tau-Proteins ist in beiden Regulation seiner physiologischen Funktion von MT Stabilisierung und pathologische Verlust der Funktion impliziert, dass AD-Neuronen charakterisiert.

Weiterhin Tau - Protein, wenn in PHFs in erkrankten Neuronen integriert wird ausnahmslos ² hyperphosphoryliert. Im Gegensatz zu normalen Tau, die 2-3 Phosphatgruppen enthält, enthält die hyperphosphorylated Tau in PHFs 5 bis 9 phosphate Gruppen ^3. Hyperphosphorylierung von Tau entspricht sowohl zu einer Erhöhung der Stöchiometrie an einigen Standorten und zur Phosphorylierung von zusätzlichen Stellen, die pathologische Websites der Phosphorylierung genannt werden. Allerdings Überlappung besteht zwischen AD und normalen erwachsenen Muster der Phosphorylierung trotz quantitative Unterschiede in der Ebene ^4. Wie spezifische Phosphorylierungsereignisse Einflussfunktion und Dysfunktion von Tau bleibt weitgehend unbekannt. Wir zielen darauf ab Tau Regulierung durch PTM auf molekularer Ebene zu entschlüsseln.

Um das Verständnis der molekularen Aspekte der Tau zu vertiefen, müssen wir technische Herausforderungen zu bewältigen. Erstens ist Tau ein intrinsisch ungeordneten Protein (IDP), wenn in der Lösung isoliert. Solche Proteine ​​fehlen wohldefinierte dreidimensionale Struktur unter physiologischen Bedingungen und insbesondere biophysikalischen Methoden benötigen, um ihre Funktion (en) und strukturellen Eigenschaften zu studieren. Tau ist ein Paradigma für die wachsende Klasse von IDPs, fand oft im Zusammenhang mitKrankheiten wie neurodegenerative Erkrankungen, die Erhöhung somit das Interesse der molekularen Parameter zugrunde liegenden ihre Funktionen zu verstehen. Zweitens Charakterisierung von Tau-Phosphorylierung ist ein analytisches Herausforderung mit 80 potentiellen Phosphorylierungsstellen entlang der Sequenz des längsten 441 Aminosäure-Tau-Isoform. Eine Anzahl von Antikörpern wurden gegen phosphorylierte Epitope von Tau entwickelt und werden für den Nachweis von pathologischen Tau in Neuronen oder Hirngewebe verwendet. Phosphorylierungsereignisse stattfinden kann auf mindestens 20 Seiten gezielt durch Prolin-gerichtete Kinasen, die meisten von ihnen in der Nähe in der Prolin-reiche Region. Die qualitative (welche Seiten?) Und quantitative (welche Stöchiometrie?) Charakterisierung ist schwierig , auch durch die jüngsten MS - Techniken ^5.

NMR-Spektroskopie kann verwendet werden, ungeordnete Proteine ​​zu untersuchen, sind hochdynamische Systeme von Ensembles von Konformeren gebildet. Hochauflösende NMR-Spektroskopie war Anwened sowohl Struktur als auch Funktion des Tau-Proteins zu untersuchen. Darüber hinaus führte die Komplexität der Tau - Phosphorylierung des Profils auf die Entwicklung von molekularen Werkzeugen und neue Analyseverfahren unter Verwendung von NMR zur Identifizierung von Phosphorylierungsstellen ^{6 - 8.} NMR als analytisches Verfahren ermöglicht die Identifizierung von Tau Phosphorylierungsstellen in einer globalen Weise Visualisierung aller Single-Site-Modifikationen in einem einzigen Experiment, und Quantifizierung des Ausmaßes der Phosphat-Inkorporation. Dieser Punkt ist wichtig, da, obwohl die Phosphorylierung Studien über Tau in der Literatur gibt es zuhauf, die meisten von ihnen wurden mit Antikörpern durchgeführt wurde, ein hohes Maß an Unsicherheit über die gesamte Profil der Phosphorylierung verlassen und damit die tatsächlichen Auswirkungen der einzelnen Phosphorylierungsereignisse. Rekombinante Kinasen einschließlich PKA, Glykogen-Synthase-Kinase-3β (GSK3 & bgr;), Cyclin-abhängige Kinase 2 / Cyclin A (CDK2 / CycA), Cyclin-abhängige Kinase 5 (CDK5) / p25 Aktivator Protein, extrazelluläre-signal-regulated kinase 2 (ERK2) und Mikrotubuli-Affinität regulierenden Kinase (MARK), die in Richtung Tau-Phosphorylierung Aktivität zeigen, können in aktiver Form hergestellt werden. Darüber hinaus Tau-Mutanten, die zur Erzeugung von spezifischen Tau-Protein-Isoformen mit gut charakterisierten Phosphorylierungsmuster ermöglichen, werden verwendet, um die Phosphorylierung Code von Tau zu entziffern. NMR - Spektroskopie wird dann Proben zu charakterisieren enzymatisch modifizierten Tau verwendet , ^{6 bis 8.} Obwohl in vitro Phosphorylierung von Tau schwieriger als Pseudo-Phosphorylierung wie durch Mutation von ausgewählten Ser / Thr in Glutaminsäure (Glu) Resten ist, hat dieser Ansatz seine Vorzüge. Tatsächlich sind weder die strukturellen Auswirkungen noch Wechselwirkungsparameter der Phosphorylierung kann immer durch Glutaminsäure nachgeahmt werden. Ein Beispiel ist das wiederum Motiv um Phosphoserin 202 (pSer202) beobachtet / Phosphothreonin 205 (pThr205), die mit Glu Mutationen ⁹ nicht wiedergegeben wird.

Hier wird die Herstellung von isotopenmarkierten Tau für NMR-Untersuchungen wird zuerst beschrieben. Tau-Protein durch ERK2 phosphoryliert wird auf zahlreichen Standorten als pathologisch Websites der Phosphorylierung beschrieben modifiziert und stellt somit ein interessantes Modell von hyperphosphorylated Tau. Ein detailliertes Protokoll von Tau in vitro - Phosphorylierung durch rekombinante ERK2 - Kinase vorgestellt. ^{12 -} ERK2 durch Phosphorylierung von MAP-Kinase-Weg / ERK - Kinase (MEK) ¹⁰ aktiviert. Zusätzlich zur Herstellung von modifizierten, isotopenmarkierte Tau-Protein, die Strategie zur Identifizierung des PTMs verwendet NMR beschrieben.

Protokoll

1. Herstellung von ¹⁵ N, ¹³ C-Tau (Figur 1)

1. Trans pET15b-Tau rekombinanten T7 Expressionsplasmid ^13,14 in BL21 (DE3) kompetente Escherichia coli Bakterienzellen ^15.
   HINWEIS: Die cDNA - Codierung für die längste (441 Aminosäurereste) Tau - Isoform zwischen NcoI und XhoI - Restriktionsstellen in den pET15b - Plasmid kloniert.
   1. Vorsichtig mischen 50 ul kompetente BL21 (DE3) -Zellen, Umformen 1-5 x 10 ⁷ Kolonien pro ug Plasmid DNA mit 100 ng Plasmid - DNA in einem 1,5 ml Kunststoffröhrchen.
      HINWEIS: codonspezifische Nutzung optimierte Bakterienstämme für die eukaryotische cDNA-Expression sind nicht erforderlich, um menschliche Tau zu erzeugen.
   2. Legen Sie das Zellgemisch auf Eis für 30 min und dann Hitzeschock für 10 Sekunden bei 42 ° C. Das Röhrchen wieder auf Eis für 5 min und 1 ml Raumtemperatur LB (Luria-Bertani) -Medium. Inkubieren der Bakteriensuspension bei 37 ° C für 30 min unter leichtemAgitation.
2. Verteilt auf einer Impföse 100 ul Zellsuspension gleichmäßig auf einer Agarplatte LB-Medium verwendet, das 100 ug / ml Ampicillin Antibiotikum.
3. Inkubieren Sie die Selektionsplatte für 15 Stunden bei 37 ° C.
4. Halten Sie die Selektionsplatte bei 4 ° C bis zur Kultur Schritt fortfahren, für ein Maximum von ca. 2 Wochen.
   HINWEIS: a Glycerolstammlösung Bakterienkultur (50% Glycerin) bei -80 ° C gelagert, kann hergestellt werden, um die Kultur zu einem späteren Zeitpunkt zu starten.
5. 1 ml 1 M MgSO _4, 1 ml 100 mM CaCl _2, 10 ml 100x MEM Vitamin Komplement, 1 ml 100 mg / ml Ampicillin bis 1 L autoklaviertem M9 - Salze (6 g Na ₂ HPO _4, 3 g KH ₂ PO ₄ 0,5 g NaCl).
   HINWEIS: Ein weißer Niederschlag bei Zugabe des CaCl ₂ Lösung für die M9 - Salze bilden, die sich schnell verflüchtigt.
6. Solubilisieren 300 mg ¹⁵ N, ¹³ C-Komplettmedium, 1 g ¹⁵NH ₄ Cl und 2 g ¹³ C ₆ -Glukose in 10 ml M9 - Medium. Filter-Sterilisieren der Isotopenlösung mit einer 0,2 um-Filter direkt in dem M9-Medium.
7. Suspend eine Impföse eine Kolonie von pET15b-Tau transformierten Bakterien von der Selektionsplatte in 20 ml LB Medium, ergänzt mit 100 & mgr; g / ml Ampicillin.
8. Inkubieren des beimpften Mediums bei 37 ° C für etwa 6 Stunden.
9. Die optische Dichte bei 600 nm (OD ₆₀₀₎ von 1 ml einer zehnfachen Verdünnung der Bakterienkultur in einer Plastik Spektrometers Küvette.
   HINWEIS: Die Trübung der Bakterienkultur entsprechend ₆₀₀ von 3,0-4,0 zu OD zeigt an, dass Sättigungswachstumsphase erreicht ist.
10. 20 ml der gesättigten LB-Kultur auf 1 l M9-Nährmedium, ergänzt mit Ampicillin (100 ug / ml Endkonzentration) in 2 l Erlenmeyer-Kunststoff verwirrt Kulturflasche.
11. Legen Sie die Kulturflasche in einem programmierbaren Inkubator auf 10 °C und 50 Umdrehungen pro Minute. Programmieren Sie den Inkubator auf 200 Umdrehungen pro Minute und 37 ° C am frühen Morgen des nächsten Tages zu wechseln.
12. Maßnahme OD ₆₀₀ von 1 ml der Bakterienkultur in einer Plastik Spektrometers Küvette. Werden 400 ul 1 M IPTG (Isopropyl - β-D-1-thiogalactopyranosid) Stammlösung (bei -20 ° C gehalten) , wenn OD ₆₀₀ einen Wert von etwa 1,0 erreicht die Expression von rekombinanten Tau - Proteins zu induzieren.
13. Weiterhin die Inkubation bei 37 ° C für weitere 3 Std. Sammeln der Bakterienzellen durch Zentrifugation bei 5.000 xg für 20 min.
14. Frieren Sie das Bakterienpellet bei -20 ° C. Halten eingefroren, bis der Reinigungsschritt für eine längere Zeit, wenn nötig.

2. Reinigung von ¹⁵ N, ¹³ C-Tau (Figur 2)

1. Autoklav Kationenaustausch (CEX) Reinigungspuffer bei 121 ° C unter 15 psi für 20 min. Speicher-Puffer bei 4 ° C.
2. Tauen die bakterielle Zellpellet und resuspendieren gründlich in 45 mlEin Puffer Extraktions CEX (50 mM NaPi-Puffer, pH 6,5, 1 mM EDTA) frisch mit Protease-Inhibitor-Cocktail 1x (1 Tablette) und DNAseI (2.000 Einheiten) ergänzt.
3. Stören die Bakterienzellen bei 20.000 psi einen Hochdruck-Homogenisator verwendet wird. 3-4 Pässe sind erforderlich. Zentrifuge bei 20.000 xg für 40 Minuten von unlöslichem Material zu entfernen.
4. Erhitzen Sie das Bakterienzellextrakt für 15 min bei 75 ° C im Wasserbad verwendet wird.
   HINWEIS: ein weißer Niederschlag nach wenigen Minuten beobachtet wird.
5. Zentrifuge bei 15.000 × g für 20 Minuten und halten Sie den Überstand des hitzestabilen Tau-Protein enthält.
6. Lagerung bei -20 ° C bis zum nächsten Reinigungsschritt, wenn nötig.
7. Durchführen einer Kationenaustausch - Chromatographie auf einem starken CEX Harz gepackt als eine 5 ml Bettsäule eine schnelle Protein - Flüssigchromatographie (FPLC) -System (Figur 3 A).
   1. Durchflussrate einstellen auf 2,5 ml / min.
   2. Äquilibrieren der Säule in CEX Ein Puffer
   3. Laden Sie die 60-70 ml beheizbarAuszug mit einem Tau eine Probenpumpe, oder alternativ eine Pumpe auf dem System abhängig. Sammeln Sie die Flow-Through zur Analyse, um zu überprüfen, dass Tau-Protein effizient an das Harz bindet (siehe 2.8).
   4. Das Harz wird mit CEX Ein Puffer, bis die Absorption bei 280 nm zurück zum Ausgangswert ist.
   5. Elute Tau aus der Säule unter Verwendung eines dreistufigen NaCl-Gradienten durch allmähliche Erhöhung des CEX B Puffer erhalten (CEX A-Puffer mit 1 M NaCl). Programm die FPLC wie folgt: erster Schritt des Gradienten auf 25% CEX B-Puffer in 10 Säulenvolumina (CV) in 5 CV 250 mM NaCl, zweiten Stufe auf 50% CEX B Puffer zu erreichen, 500 mM NaCl zu erreichen, und der dritte Schritt zu 100% CEX B-Puffer NaCl zu erreichen in 2 CV 1 M. Sammeln 1,5-ml-Fraktionen in den Eluierungsschritte.
8. Analyse 10 & mgr; l der Fraktionen während der Elutionsschritt durch SDS-PAGE (12% SDS-Acrylamid - Gel) und Coomassie - Färbung (3 A) ¹⁶ gesammelt. Überprüfen Sie den Ladeschritt auf der Säule als auch von Analy10 ul der Durchfluss zing.
9. Wählen Sie die Fraktionen, die Tau und diese Fraktionen für den nächsten Schritt bündeln.
10. Führen Sie einen Pufferaustausch auf Tau-enthaltenden vereinigten Fraktionen (Abbildung 3 B).
    1. Äquilibrieren eine Entsalzungssäule von 53 ml G25 Harz gepackt Bett (26 x 10 cm) in 50 mM Ammoniumbicarbonat (flüchtige Puffer) mit einem FPLC-System.
    2. Set Durchflussrate von 5 ml / min. Injizieren Sie die Tau Probe auf der Säule über eine 5 ml Injektionsschleife. Sammle Fraktionen bei 280 nm auf die Absorptionsspitze entspricht.
    3. Wiederholen der Injektions 3-4 mal, abhängig von dem Volumen der anfänglichen CEX Pool.
11. Berechne die Menge an gereinigtem Tau-Proteins durch die Peakfläche des Chromatogramms bei 280 nm unter Verwendung von (1 mg von Tau entspricht 140 mAU * ml).
    HINWEIS: Der Extinktionskoeffizient des Tau - Proteins bei 280 nm ist 7550 M ^-1 cm ^-1. Tau enthält keine Trp-Resten.
12. Pool alle Tau Fraktionen.
13. aliquot die Probe in Röhrchen das Äquivalent von 1 bis 5 mg Tau enthält. Wählen, um diese Rohre so dass das Volumen der Lösung kleiner dem Volumen des Rohrs verglichen wird (beispielsweise 5 ml Lösung in einem 50 ml Röhrchen).
14. Stanzlöcher in den Rohrkappen mit einer Nadel. Gefriert Tau-Proben bei -80 ° C.
15. Lyophilisieren Tau-Proben. Lyophilisierte Tau-Protein kann bei -20 ° C für lange Zeiträume gehalten werden.

3. In - vitro - Phosphorylierung von ¹⁵ N-Tau

1. Man löst 5 mg lyophilisiertes Tau in 500 ul Phosphorylierung Puffer (50 mM Hepes · KOH, pH 8,0, 12,5 mM MgCl _2, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl).
2. In 2,5 mM ATP (25 & mgr; l 100 mM Stammlösung bei -20 ° C gehalten), 1 mM DTT (1 ul 1 M Stammlösung bei -20 ° C gehalten), 1 mM EGTA (2 ul einer 0,5 M Stamm Lösung), Cocktail-1x-Protease-Inhibitor (25 ul eines 40x Lager durch Auflösen von 1 Tablette in 1 ml Phosphorylierung Puffer erhalten) und 181; M aktiviert His-ERK2 (250 & mgr; l in Erhaltungspuffer 10 mM Hepes, pH 7,3, 1 mM DTT, 5 mM MgCl _2, 100 mM NaCl und 10% Glycerin bei -80 ° C gelagert) in einem Gesamtprobenvolumen von 1 ml.
   HINWEIS: Die aktivierte His-ERK2 kann in-house ^5,8 durch Phosphorylierung mit dem MEK - Kinase hergestellt werden.
3. Inkubieren 3 h bei 37 ° C.
4. Die Probe wird bei 75 ° C für 15 min ERK-Kinase zu inaktivieren.
5. Zentrifuge bei 20.000 xg für 15 min. Sammeln und den Überstand zu halten.
6. Entsalzen die Proteinprobe in 50 mM Ammoniumbicarbonat eine Säule von 3,45 ml G25-Harz gepackte Bett (1,3 x 2,6 cm) verwendet, die für eine 1 ml Probe geeignet ist.
7. Führen Sie einen 12% SDS-PAGE ¹⁶ mit 2,5 & mgr; l der Proteinprobe sowohl seine Integrität und effiziente Phosphorylierung (Abbildung 4) zu überprüfen.
8. Lyophilisieren das phosphorylierte Tau Probe. Lagern Sie das Pulver bei -20 ° C.

4. Akquisition von NMR-Spektren (FiAbbildung 5)

1. Solubilisieren 4 mg lyophilisiertes ¹⁵ N, ¹³ C ERK-phosphorylierte Tau-in 400 & mgr; l NMR - Puffer (50 mM NaPi oder 50 mM deuteriertem Tris- d11 .Cl, pH 6,5, 30 mM NaCl, 2,5 mM EDTA und 1 mM DTT).
2. Werden 5% D ₂ O für Feld Verriegelung des NMR - Spektrometers und 1 mM TMSP (3- (Trimethylsilyl) propionsäure-2,2,3,3-d _{4-Natriumsalz))} als interne NMR Signal Referenz. In 10 ul einer 40x Stammlösung von kompletten Protease-Inhibitor-Cocktail.
3. Übertragung der Probe in ein 5 mm NMR-Röhrchen eine elektronische Spritze mit einer langen Nadel oder Pasteurpipette. Schließen Sie das NMR-Röhrchen den Kolben verwendet wird. Entfernen Sie alle Luftblasen gefangen zwischen Kolben und Flüssigkeit durch Kolbenbewegungen.
4. Legen Sie das NMR-Röhrchen in einer Schleuder. Einstellen seine vertikale Position in dem Spinner mit entsprechendem Maß für die NMR-Probenkopf verwendet, so dass die meisten der Probenlösung innerhalb der NMR-Spule sein.
5. Starten Sie den Luftstrom: Klicken Sie Lift in der Magnetsteuersystemfenster. Legen Sie das Spinner mit dem Schlauch in der Luftstrom an der Spitze der Magnetbohrung. Stoppen Sie den Luftstrom (klicken Lift) und lassen Sie das Rohr hinunter in Platz im Inneren des Sondenkopf im Magneten.
6. Temperatur auf 25 ° C (298 K).
7. Führen Sie halbautomatische Abstimmung und Anpassung der Sondenkopf über die Stromübertragung zu optimieren. Geben Sie ATMM auf der Kommandozeile.
8. Sperren Sie die Spektrometerfrequenz unter Verwendung des D ₂ O - Signal der Probe auf das Deuterium - Kanal aufgezeichnet. Klicken Sie Sperre in der Magnetsteuersystemfenster.
9. Starten Sie die Shim-Verfahren an der Position, die Homogenität des magnetischen Feldes der Probe zu optimieren. Geben Sie topshim gui auf der Kommandozeile das Shim - Fenster zu öffnen. Klicken Sie in der Shim - Fenster starten. Überprüfen Sie die Rest B0 Standardabweichungswert, um zu überprüfen, dass Unterlegscheiben optimal sind (weniger als 2 Hz ist gut).
10. Kalibrieren des p1-Parameter (Länge eines ProtonsHochfrequenzpuls in & mgr; sec), die eine Drehung um 90 ° von Protonenspins zu erhalten, notwendig ist. Ziel für den 360 ° -Impuls ein 1D - Spektrum Wasserprotonen (Abbildung 6) verwendet wird .
11. Einstellung der Frequenzversatz durch die o1 Parametereinstellung (in Hz) an die Protonenwasserfrequenz in der 1D - Spektrum (Abbildung 6).
12. Beginnen Erwerb eines 1D Protonenspektrum (Pulsfolge mit Watergate Sequenz zur Unterdrückung Wassersignal, beispielsweise zggpw5) zu verifizieren Signale von der Probe (7). Passen Sie die Anzahl der Scans auf die relative Proteinkonzentration. Geben Sie auf der Kommandozeile zg die Messung zu starten.
13. Richten Sie zusätzliche Parameter für den Erwerb eines 2D ^[1 H, ¹⁵ N] HSQC - Spektrum (hsqcetfpf3gpsi Impulsfolge, Figuren 8-9).
    1. Für eine ¹⁵ N, ¹³ C - markierten Probe, entkoppeln ¹³ C während der ¹⁵ N indirekte Evolution.
    2. Die Anzahl der Punkte und die spektrale Breite (ppm) im ¹ H (F2) und ¹⁵ N (F1) Dimensionen ein.
       HINWEIS: Passen Sie die Anzahl der Erwerb Datenpunkte in das Spektrometer Feld eine ähnliche Anzahl von Hz pro Punkt zu halten und mal Entkopplung zu begrenzen: 3.072 Punkte bei 900 MHz und 2.048 Punkte bei 600 MHz, im ¹ H - Dimension verwenden.
    3. Optimieren Sie zusätzliche Parameter in den Impulsfolgen, entsprechend verzögert, Pulslängen, Offset-Frequenzen, Leistungsstufen. Geben Sie auf der Kommandozeile asierend alle relevanten Parameter für das Experiment anzuzeigen.
14. Stellen Sie die Parameter für den Erwerb eines 3D ^[1 H, ¹⁵ N, ¹³ C] HNCACB Spektrum (Pulsfolge hncacbgpwg3d, 10A) bei 600 MHz.
15. Stellen Sie die Parameter für einen 3D - ^[1 H, ¹⁵ N, ¹⁵ N] HNCANNH Experiment (Impulsfolge hncannhgpwg3d) bei 600 MHz. Stellen Sie die Anzahl der Punkte auf 2048 im ¹ H und 64und 128 Punkte in den zwei ¹⁵ N Dimensionen. Definieren die spektralen Breiten 14, 25, 25 Teile pro Million (ppm) zentriert auf 4,7, 119, 119 ppm in dem ¹ H, ¹⁵ N und ¹⁵ N Dimensionen. Dauer des Erwerbs mit 16 Scans beträgt 1 Tag und 22 Stunden.

5. Identifizierung von Phosphorylierungsstellen

1. Verfahren Spektren Erfassung und Verarbeitung NMR Software.
   1. Durchführen einer Fourier - Transformation der Daten (Abbildung 7). Typ ft für ein 1D - Spektrum, xfb für ein 2D - Spektrum oder ft3d für ein 3D - Spektrum, auf der Kommandozeile.
   2. Phase und Referenz alle Spektren (Abbildung 7C) mit Hilfe der interaktiven Fenster.
2. Identifizieren Resonanzen von Interesse in der 2D - HSQC möglicherweise entsprechend phosphoryliert Ser und Thr - Resten (Abbildung 9, roter Kasten).
3. Extract Ebenen (dh 2D - ¹ H- ¹³ C - Spektren) vondie 3D - ¹ H- ¹⁵ N - ¹³ C - Spektrum der ¹⁵ N chemischen Verschiebungen von Resonanzen von Interesse in der 2D verwendet. Mit dem Cursor der Dimension 2 (w2) , um die ¹⁵ N Frequenz entsprechend der Ebene (w1-w3) zu wählen zu visualisierenden (10B).
4. Wählen Sie die Resonanzfrequenzen von "CA" und "CB" ¹³ C - Kerne des "i" und "i-1" Rückstände (schwächere Satz von Signalen im Vergleich zu denen des i - Rest) für jeden ^[1 H, ¹⁵ N] Resonanz Interesse an der HNCACB 3D-Spektrum auf die Resonanz durch Anklicken im Modus Menü Zeiger finden / add Spitze, die chemische Verschiebungswert in einer Peak-Liste-Datei hinzuzufügen.
   1. Identifizieren Sie den i - Rest - Typ, pSer oder pThr, durch die chemischen Verschiebungen Vergleich in der Peak - Liste mit bekannten Werten von CA und CB chemischen Verschiebungen von pSer und pThr ^17.
   2. Identifizieren Sie die Anwesenheit eines Pro-Rest an der i + 1-Position durch eine charakteristische zusätzliche 2 ppm Verschiebung of der CA chemische Verschiebungswert ^18.
   3. Vergleichen die chemischen Verschiebungswerte der CA und CB Resonanzen entsprechend dem i-1 - Rest zu einer Tabelle der chemischen Verschiebungen für Tau Aminosäurereste ¹⁹ vorhergesagt , die Natur des Rückstands zu identifizieren an der i-1 - Position.
5. Wählen Sie die Resonanzfrequenzen von ¹⁵ N - Kerne des "i" und "i-1 'Reste für jeden ^[1 H, ¹⁵ N] Resonanz von Interesse in der HNCANNH Spektrum.
6. Vergleichen Sie die ¹⁵ N Werte der chemischen Verschiebung der chemischen Verschiebung Zuordnung des Tau - Proteins ^20-23.
7. Vergleichen Sie die identifizierten Dipeptide mit der Tau-Sequenz die sequenzspezifische Zuordnung zu definieren.

Ergebnisse

3A zeigt eine Hauptabsorptionspeaks bei 280 nm während des Elutionsgradienten beobachtet. Dieser Peak entspricht gereinigtes Tau-Protein über dem Chromatogramm auf dem Acrylamidgel gesehen wie. Figur 3B zeigt eine gut getrennt Absorptionsmaximum bei 280 nm und die Spitzen der Leitfähigkeit, so dass das Entsalzen des Proteins effizient ist. Figur 4 zeigt Proteingel-shift beobachtet durch SDS-PAGE - Analyse ¹⁶ charakteristisch für multiple Proteinphosphorylierung (vergleiche Sp...

Diskussion

Wir haben NMR-Spektroskopie verwendet enzymatisch modifizierten Tau-Proben zu charakterisieren. Die rekombinante Expression und Reinigung der menschlichen Volllängen-Tau-Protein hier beschrieben sind, können in ähnlicher Weise zu erzeugen mutanten Tau oder Tau-Domänen verwendet werden. Isoto- Protein wird für die NMR-Spektroskopie benötigt, rekombinante Expression erforderlich macht. Identifizierung von Phosphorylierungsstellen erfordert Resonanzzuordnung und ¹⁵ N, ¹³ C doppelt markierte Prot...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
pET15B recombinant T7 expression plasmid	Novagen	69257	Keep at -20 °C
BL21(DE3) transformation competent E. coli bacteria	New England Biolabs	C2527I	Keep at -80 °C
Autoclaved LB Broth, Lennox	DIFCO	240210	Bacterial Growth Medium
MEM vitamin complements 100x	Sigma	58970C	Bacterial Growth Medium Supplement
15N, 13C-ISOGRO complete medium powder	Sigma	608297	Bacterial Growth Medium Supplement
15NH4Cl	Sigma	299251	Isotope
13C6-Glucose	Sigma	389374	Isotope
Protease inhibitor tablets	Roche	5056489001	Keep at 4 °C
1 tablet in 1 ml is 40x solution that can be kept at -20 °C
DNaseI	EUROMEDEX	1307	Keep at -20 °C
Homogenizer (EmulsiFlex-C3)	AVESTIN		Lysis is realized at 4 °C
Pierce™ Unstained Protein MW Marker	Pierce	266109
Active human MEK1 kinase, GST Tagged	Sigma	M8822	Keep at -80 °C
AKTÄ Pure chromatography system	GE Healthcare		FPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 ml column)	GE Healthcare	17-5156-01	Cation exchange chromatography columns
HiPrep 26/10 Desalting	GE Healthcare	17-5087-01	Protein Desalting column
PD MidiTrap G-25	GE Healthcare	28-9180-08	Protein Desalting column
Tris D11, 97% D	Cortecnet	CD4035P5	Deuterated NMR buffer
5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O (set of 5 inner & outerpipe)	Euriso-top	BMS-005B	NMR Shigemi Tubes
eVol kit-electronic syringe starter kit	Cortecnet	2910000	Pipetting
Bruker 900 MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead	Bruker		NMR spectrometer for data acquisition
Bruker 600 MHz Avance with a triple resonance cryogenic probehead	Bruker		NMR spectrometer for data acquisition
TopSpin 3.1	Bruker		Acquisition and Processing software for NMR experiments
Sparky 3.114	UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller)		NMR data Analysis software