Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear para a identificação de múltiplas fosfolarização de intrinsecamente desordenados Proteínas

Resumo

We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

Resumo

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau's heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.

Introdução

Um dos principais desafios da saúde no século ²¹ são as doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (DA). Tau é uma proteína associada a microtúbulos que estimula a formação de microtúbulos (MT). Tau está igualmente envolvido em várias doenças neurodegenerativas, os chamados tauopatias, dos quais o mais conhecido é AD. Nestes distúrbios, Tau auto-agregados em filamentos helicoidais emparelhados (PHFs) e é encontrado modificado em muitos resíduos por modificações pós-translacionais (PTMS), tais como fosforilação ^1. A fosforilação da proteína tau está implicado tanto na regulação da sua função fisiológica de estabilização de MT e da perda da função patológica que caracteriza neurónios AD.

Além disso, a proteína Tau, quando integrado no PHF em neurónios doentes, é invariavelmente hiperfosforilada ^2. Ao contrário Tau normal que contém 2-3 grupos fosfato, o Tau hiperfosforilada em PHF contém 5-9 phosphate os grupos ^3. Hiperfosforilação de Tau corresponde tanto a um aumento da estequiometria em alguns locais e a fosforilação de sítios adicionais que são chamados locais de fosforilação patológicas. No entanto, existe sobreposição entre AD e padrões adultos normais de fosforilação, apesar das diferenças quantitativas no nível ^4. Como eventos de fosforilação função de influência e disfunção de Tau específica permanece em grande parte desconhecido. Nosso objetivo é decifrar regulação Tau por PTMs no nível molecular.

Para aprofundar a compreensão dos aspectos moleculares de Tau, temos de enfrentar os desafios técnicos. Em primeiro lugar, uma proteína tau é intrinsecamente desordenados (PDI), quando isolados em solução. Estas proteínas não têm estrutura tridimensional bem definida em condições fisiológicas e requerem determinados métodos biofísicos para estudar a sua função (s) e as propriedades estruturais. Tau é um paradigma para a crescente classe dos deslocados internos, muitas vezes encontrados associadospatologias como doenças neurodegenerativas, aumentando assim o interesse para compreender os parâmetros moleculares subjacentes suas funções. Em segundo lugar, a caracterização de Tau fosforilação é um desafio analítico, com 80 potenciais locais de fosforilação ao longo da sequência da tau isoforma mais longa 441 amino-ácido. Um certo número de anticorpos têm sido desenvolvidos contra epítopos de tau fosforilados e são utilizados para a detecção de tau patológica em neurónios ou tecido cerebral. eventos de fosforilação pode ter lugar em, pelo menos 20 locais visados ​​pelas cinases dirigidas-prolina, a maioria deles em estreita proximidade no interior da região rica em prolina. O qualitativa (que sites?) E caracterização quantitativa (o que estequiometria?) É difícil, mesmo pelas mais recentes técnicas de MS ^5.

espectroscopia de RMN pode ser utilizada para investigar as proteínas desordenados que são altamente dinâmicos sistemas constituídos por conjuntos de confórmeros. espectroscopia de RMN de alta resolução foi apliEd para investigar a estrutura e função da proteína tau. Além disso, a complexidade do perfil a fosforilação da tau, levou ao desenvolvimento de ferramentas moleculares e novos métodos de análise utilizando RMN para a identificação de sítios de fosforilação ^{6 - 8.} RMN como um método analítico permite a identificação de locais de fosforilação da tau de um modo global, a visualização de todas as modificações de sítio único numa única experiência, e a quantificação da extensão da incorporação de fosfato. Este ponto é essencial, pois embora os estudos de fosforilação sobre Tau abundam na literatura, a maioria deles têm sido realizados com anticorpos, deixando um grande grau de incerteza sobre o perfil completo de fosforilação e, assim, o verdadeiro impacto de eventos de fosforilação individuais. cinases recombinantes incluindo PKA, 3β glicogênio sintase-quinase (Gsk3β), ciclina dependente de quinase 2 / ciclina A (CDK2 / CycA), quinase ciclina-dependentes 5 (CDK5) / p25 actproteína ivator,-extracelular sinal-quinase regulada 2 (ERK2) e microtúbulos-quinase regula-afinidade (MARK), que apresentam uma actividade no sentido de fosforilação da tau, pode ser preparada numa forma activa. Além disso, os mutantes Tau que permitem a geração de isoformas da proteína tau específicas com padrões de fosforilação bem caracterizados são usadas para decifrar o código de fosforilação de tau. Espectroscopia de RMN é então usado para caracterizar amostras Tau enzimaticamente modificados ^{6 - 8.} Embora a fosforilação in vitro de tau é mais difícil do que o pseudo-fosforilação tal como por mutação da seleccionados Ser / Thr em resíduos de ácido glutâmico (Glu), esta abordagem tem as suas vantagens. De facto, nem os parâmetros de impacto nem interacção estruturais de fosforilação pode sempre ser mimetizado por ácidos glutâmicos. Um exemplo é o motivo por sua vez observada em torno fosfoserina 202 (pSer202) / fosfotreonina 205 (pThr205), que não é reproduzida com Glu mutações ^9.

Aqui, a preparação de Tau marcado isotopicamente para investigações de RMN serão descritos em primeiro lugar. proteína tau fosforilada por ERK2 é modificado em vários sites descritos como locais patológicos de fosforilação, e, portanto, representa um interessante modelo de Tau hiperfosforilada. Um protocolo detalhado de Tau na fosforilação in vitro pela quinase ERK-2 recombinante é apresentada. ERK2 é activada por fosforilação de proteína quinase activada mitogénio / ERK-cinase (MEK) ^10-12. Além disso para a preparação de proteína Tau modificado, marcado isotopicamente, a estratégia de RMN utilizado para a identificação do PTMs é descrito.

Protocolo

1. Produção de ¹⁵ N, ¹³ C-tau (Figura 1)

1. Transformar pET15b-tau recombinante de T7 expressão plasmídeo ^13,14 em BL21 (DE3) competente de Escherichia coli, células bacterianas ^15.
   NOTA: o ADNc que codifica para o mais longo (441 resíduos de aminoácidos) isoforma da tau é clonado entre os locais de restrição Ncol e Xhol no plasmídeo pET15b.
   1. Misturar suavemente 50 ul de células (DE3), formando 1-5 x 10 ⁷ colónias por ug de DNA de plasmídeo, com 100 ng de DNA de plasmídeo em um tubo de plástico de 1,5 ml BL21 competente.
      NOTA: Codon-uso otimizado estirpes bacterianas para a expressão de cDNA eucariótica não são essenciais para a produção de Tau humana.
   2. Coloque a mistura de células em gelo durante 30 min e em seguida choque térmico durante 10 segundos a 42 ° C. Colocar o tubo de volta em gelo durante 5 min e adicionar 1 ml de meio LB à temperatura ambiente (Luria Bertani). Incubar a suspensão bacteriana a 37 ° C durante 30 min sob suaveagitação.
2. Espalhe usando uma ansa de inoculação de 100 uL de suspensão de células uniformemente sobre uma placa de agar de meio LB contendo 100 ug / ml do antibiótico ampicilina.
3. Incubar a placa de selecção durante 15 horas a 37 ° C.
4. Manter a placa de selecção, a 4 ° C até se proceder à etapa de cultura, para um máximo de cerca de 2 semanas.
   NOTA: um stock de glicerol de cultura bacteriana (50% de glicerol), armazenada a -80 ° C, pode ser preparado para iniciar a cultura, numa fase posterior.
5. Adicionar 1 ml de 1 M de _MgSO4, 1 ml de CaCl 100 mM de _2, 10 ml de 100x MEM vitamina complemento, 1 ml de 100 mg / ml de ampicilina para 1 L de sais M9 autoclavados (6 g de Na ₂ HPO _4, 3 g _de KH ₂ PO ₄ , 0,5 g de NaCl).
   NOTA: se um precipitado branco irá formar após a adição da solução de _CaCI2 para os sais M9 que se dissipa rapidamente.
6. Solubilizar 300 mg de N ^15, média ¹³ C-completo, 1 g de ¹⁵_De NH ₄ Cl e 2 g de ¹³ C ₆ -glucose em 10 ml de meio M9. Filtro-esterilizar a solução isótopo utilizando um filtro de 0,2 um, directamente para o meio M9.
7. Suspender usando um laço de inoculação uma colónia de pET15b-Tau bactérias transformadas a partir da placa de selecção em 20 ml de meio LB suplementado com 100 ug / ml de ampicilina.
8. Incubar o meio inoculado a 37 ° C durante cerca de 6 h.
9. Medir a densidade óptica a 600 nm (OD ₆₀₀₎ em 1 ml de uma diluição de dez vezes da cultura bacteriana numa cuvete de plástico espectrómetro.
   NOTA: turbidez da cultura bacteriana correspondente a _DO600 de 3,0-4,0 indica que a fase de crescimento de saturação é atingida.
10. Adicionar 20 ml da cultura LB saturado a 1 L de meio de crescimento M9 suplementado com ampicilina (100 ug / ml de concentração final), em 2 L de Erlenmeyer frasco de cultura de plástico confundido.
11. Colocar o frasco de cultura numa incubadora programável definido para 10 °C e 50 rpm. Programar a incubadora para mudar para 200 rpm e 37 ° C no início da manhã do dia seguinte.
12. Medida _OD600 em 1 ml de cultura bacteriana numa cuvete de plástico espectrómetro. Adicionar 400 ul de 1 M de IPTG (β-D-1-tiogalactopiranosido de isopropilo) solução de estoque (mantido a -20 ° C) quando _DO600 atinge um valor de cerca de 1,0 a induzir a expressão da proteína tau recombinante.
13. Continuar a incubação a 37 ° C durante mais 3 h. Recolher as células bacterianas por centrifugação a 5000 xg durante 20 min.
14. Congelar o sedimento bacteriano a -20 ° C. Manter congelado até que o passo de purificação, por um período prolongado, se necessário.

2. A purificação de ¹⁵ N, ¹³ C-tau (Figura 2)

1. permuta catiónica autoclave (CEX) tampões de purificação a 121 ° C sob 15 psi durante 20 min. buffers armazenar a 4 ° C.
2. Descongelar o sedimento de células bacterianas e ressuspender completamente em 45 mlextracção de CEX num tampão (50 mM de tampão NaPi, pH 6,5, EDTA 1 mM) suplementado fresco com 1x cocktail inibidor de protease (1 comprimido) e DNAseI (2000 unidades).
3. Dissociação das células bacterianas, utilizando um homogeneizador de alta pressão a 20000 psi. 3-4 passagens são necessárias. Centrifuga-se a 20000 xg durante 40 min para remover o material insolúvel.
4. Aquecer o extracto de células bacterianas durante 15 min a 75 ° C usando um banho de água.
   NOTA: um precipitado branco é observada depois de alguns minutos.
5. Centrifugar a 15000 xg durante 20 min e manter o sobrenadante contendo a proteína tau estável ao calor.
6. Armazenar a -20 ° C até que o seguinte passo de purificação, se necessário.
7. Executar uma cromatografia de permuta catiónica numa resina de CEX fortes embalado como uma coluna de 5 mL utilizando um leito de proteína rápida sistema de cromatografia líquida (FPLC) (Figura 3 A).
   1. Ajustar a taxa de fluxo de 2,5 ml / min.
   2. Equilibrar a coluna em tampão A CEX
   3. Carregar a 60-70 ml heated-extracto contendo tau utilizando uma bomba de amostra, ou alternativamente bomba A, dependendo do sistema. Recolhe-se o fluxo através de análise para verificar que a proteína de tau é eficiente ligação à resina (ver 2.8).
   4. Lava-se a resina de CEX com um tampão até que a absorvância a 280 nm é de volta ao valor da linha de base.
   5. Eluir tau a partir da coluna usando um gradiente de NaCl em três fases obtidas por aumento progressivo de tampão B CEX (CEX Um tampão com 1 M de NaCl). Programa do FPLC como se segue: primeiro passo do gradiente de 25% de tampão de CEX B em 10 volumes de coluna (CV) para chegar a 250 mM de NaCl, segundo passo de 50% de tampão de CEX B em 5 VC de alcançar NaCl 500 mM, e o terceiro passo a 100% de tampão B, em CEX 2 CV para chegar a 1 M de NaCl. Recolha fracções de 1,5 ml durante os passos de eluição.
8. Analisar 10 ul das fracções recolhidas durante o passo de eluição por SDS-PAGE (12% de gel de SDS-acrilamida) e coloração com Coomassie (Figura 3 A) ^16. Verificar o passo de carregamento sobre a coluna, assim por Analyzing 10 ul de fluxo de passagem.
9. Escolha as fracções contendo tau e agrupar as fracções para o passo seguinte.
10. Executar uma troca de tampão em frações Tau contendo agregados (Figura 3 B).
    1. Equilibrar a coluna de dessalinização de 53 ml de G25 resina de leito fixo (26 x 10 cm) em bicarbonato de amónio 50 mM (tampão volátil) utilizando um sistema de FPLC.
    2. Ajustar a taxa de fluxo de 5 ml / min. Injectar a amostra Tau em coluna através de uma ansa de injecção de 5 ml. Recolha fracções correspondentes ao pico de absorção a 280 nm.
    3. Repetir a injecção 3-4 vezes, dependendo do volume da piscina CEX inicial.
11. Calcula-se a quantidade de proteína tau purificada usando a área do pico do cromatograma de 280 nm (1 mg de Tau corresponde a 140 mAU * mL).
    NOTA: O coeficiente de extinção da proteína tau a 280 nm é 7550 M ^-1 cm ^-1. O Tau não contém quaisquer resíduos de Trp.
12. Piscina todas as fracções Tau.
13. aliquot a amostra para tubos contendo o equivalente a 1 a 5 mg de Tau. Escolha estes tubos de modo que o volume da solução é pequeno comparado com o volume do tubo (por exemplo, 5 ml de solução em um tubo de 50 ml).
14. Faça furos nas tampas de tubos usando uma agulha. Congele as amostras Tau-se a -80 ° C.
15. amostras Liofilizar Tau. proteína Tau liofilizado pode ser conservado a -20 ° C durante longos períodos de tempo.

3. A fosforilação in vitro de ¹⁵ N-Tau

1. Dissolve-se 5 mg de liofilizado da tau em 500 ul de tampão de fosforilação (Hepes 50 mM-KOH, pH 8,0, MgCl ₂ 12,5, EDTA 1 mM, NaCl 50 mM).
2. Adicionar ATP 2,5 mM (25 ul de uma solução de estoque 100 mM mantida a -20 ° C), 1 mM de DTT (1 ul de uma solução de estoque 1 M mantido a -20 ° C), 1 mM de EGTA (2 ul de um estoque 0,5 M solução), 1x cocktail inibidor de protease (25 ul de uma estoque 40x obtida por dissolução de um comprimido em tampão de fosforilação 1 ml) e 181; H activado His-ERK2 (250 ul em tampão de conservação 10 mM de Hepes, pH 7,3, DTT 1 mM, _MgCl2 5 mM, NaCl 100 mM e glicerol a 10%, armazenado a -80 ° C) num volume total de amostra de 1 ml.
   NOTA: O activada His-ERK2 pode ser preparada in-house ^5,8 por fosforilação com a quinase MEK.
3. Incubar 3 horas a 37 ° C.
4. Aquece-se a amostra a 75 ° C durante 15 minutos para inactivar a quinase ERK.
5. Centrifugar a 20000 xg durante 15 min. Recolher e guardar o sobrenadante.
6. Dessalinizar a amostra de proteína em bicarbonato de amónio 50 mM, utilizando uma coluna de 3,45 ml de G25 resina de leito empacotado (1,3 x 2,6 cm), que é apropriado para uma amostra de 1 ml.
7. Executar um 12% de SDS-PAGE a ¹⁶ com 2,5 mL da amostra de proteína, para verificar a sua integridade e a fosforilação eficiente (Figura 4).
8. Liofilizar a amostra tau fosforilada. Armazenar o pó a -20 ° C.

4. A aquisição de espectros (Figura 5)

1. Solubiliza-se 4 mg de liofilizado ^{de 15} N, ¹³ C-ERK fosforilada-tau em 400 ul de tampão RMN (NaPi 50 mM ou 50 mM de Tris-deuterados .cl D11, pH 6,5, NaCl 30 mM, EDTA 2,5 mM e DTT 1 mM).
2. Adicionam-se 5% de D ₂ O para o bloqueio de campo do espectrómetro de RMN e TMSP 1 mM (3- (trimetilsilil) ₄ sal de sódio de ácido propiónico-2,2,3,3-d)) como sinal de referência RMN interna. Adicionam-se 10 ul de uma solução de estoque de 40x cocktail completo de inibidor de protease.
3. Transfira a amostra num tubo de RMN de 5 milímetros usando uma seringa com uma agulha electrónico longo ou pipeta de Pasteur. Fechar o tubo de RMN utilizando o êmbolo. Remover qualquer bolha de ar presa entre êmbolo e líquidos por movimentos de êmbolo.
4. Coloque o tubo de RMN em um spinner. Ajustar a sua posição vertical no elemento rotativo com o calibre adequado para a cabeça da sonda de RMN utilizado, de tal modo que a maior parte da solução da amostra estará dentro da bobina de RMN.
5. Inicie o fluxo de ar: clique elevador in janela do sistema de controle imã. Cuidadosamente colocar o spinner com o tubo no fluxo de ar na parte superior do magneto. Parar o fluxo de ar (clique elevador) e deixar o tubo descer no lugar dentro da cabeça sonda no ímã.
6. Ajuste da temperatura a 25 ° C (298 K).
7. Executar o ajuste semi-automático e correspondência da cabeça da sonda para otimizar a transmissão de energia. Digite ATMM na linha de comando.
8. Bloquear a frequência espectrómetro usando o sinal D ₂ O, a amostra gravada no canal de deutério. Clique cadeado na janela do sistema de controle imã.
9. Iniciar o procedimento de calços para optimizar a homogeneidade do campo magnético na posição da amostra. Digite topshim gui na linha de comando para abrir a janela calço. Clique em Iniciar na janela de calço. Verifique o valor da variação padrão B0 residual para verificar se os calços são ideais (menos de 2 Hz é bom).
10. Calibrar o parâmetro P1 (comprimento de um protãoimpulso de radiofrequência em ms), o que é necessário para se obter uma rotação de 90 ° de protão rotações. Alvo para o pulso de 360 ° usando um espectro 1D dos protões da água (Figura 6).
11. Ajustar o deslocamento definindo o parâmetro o1 (em Hz) para a freqüência de água de prótons no espectro de 1D (Figura 6) frequência.
12. Comece a aquisição de um espectro de protão 1D (sequência de impulsos com a sequência comporta para a supressão do sinal da água, por exemplo zggpw5) para verificar os sinais a partir da amostra (Figura 7). Adaptar o número de varreduras com a concentração relativa de proteína. Digite zg na linha de comando para iniciar a aquisição.
13. Configurar parâmetros adicionais para a aquisição de um 2D ^[1 H, ¹⁵ N] HSQC espectro (pulso sequência hsqcetfpf3gpsi, as Figuras 8-9).
    1. Para a ¹⁵ N, ¹³ C rotulado de exemplo, dissociar ¹³ C durante a evolução indireta ¹⁵ N.
    2. Definir o número de pontos ea largura espectral (ppm) na ¹ H (F2) e ¹⁵ N dimensões (F1).
       NOTA: Adaptar o número de pontos de dados de aquisição para o campo espectrômetro para manter um número semelhante de Hz por ponto e para limitar tempos de dissociação: use 3.072 pontos em 900 MHz e 2.048 pontos em 600 MHz, na dimensão ^1H.
    3. Otimizar os parâmetros adicionais nas sequências de pulso, correspondente a atrasos, comprimentos de onda, a compensação frequências, níveis de potência. Tipo ased na linha de comando para exibir todos os parâmetros relevantes para o experimento.
14. Definir parâmetros para a aquisição de um 3D ^[1 H, ¹⁵ N, ¹³ C] espectro HNCACB (hncacbgpwg3d sequência de impulsos, Figura 10A) a 600 MHz.
15. Definir parâmetros para um 3D ^[1 H, ^{15N, 15N]} experimento HNCANNH (pulso sequência hncannhgpwg3d) a 600 MHz. Defina o número de pontos de 2048 no ¹ H e, 64e 128 pontos nas duas dimensões ^{de 15} N. Definir as larguras espectrais como 14, 25, 25 partes por milhão (ppm) centrado no 4.7, 119, 119 ppm no ¹ H, ¹⁵ N e ¹⁵ N dimensões. Duração da aquisição, com 16 exames é de 1 dia e 22 horas.

5. Identificação de sítios de fosforilação

1. Os espectros de processo utilizando software de aquisição e processamento de RMN.
   1. Executar uma transformação de Fourier dos dados (Figura 7). Tipo ft para um espectro de 1D, XFB para um espectro 2D ou ft3d para um espectro 3D, na linha de comando.
   2. Fase e todos os espectros de referência (Figura 7C) utilizando as janelas interactivas.
2. Identificar ressonâncias de interesse na HSQC 2D potencialmente correspondente aos resíduos fosforilados Ser e Thr (Figura 9, caixa vermelha).
3. Planos de extracção (isto é, 2D ¹ H- ¹³ C espectros) deo espectro de C 3D ¹ H- ¹⁵ N- ¹³ usando os desvios químicos ^{de 15N} de ressonâncias de interesse no 2D. Usar o cursor de dimensão dois (W2) para escolher a frequência ^{de 15} N correspondente ao plano (W1-W3) para ser visualizado (Figura 10B).
4. Escolha as frequências de ressonância de 'CA' e 'CB' ¹³ C núcleos do 'i' e resíduos 'i-1' (set mais fraca de sinais em comparação com aqueles do resíduo i) para cada ^[1 H, ¹⁵ N] ressonância de interesse no espectro HNCACB 3D clicando na ressonância, no menu do modo de ponteiro encontrar / adicionar pico, para adicionar o valor de desvio químico em um arquivo de lista de pico.
   1. Identificar o tipo i resíduo, pSer ou Pthr, comparando-se os deslocamentos químicos na lista de pico para valores conhecidos de CA e mudanças CB químicos de pSer e Pthr ^17.
   2. Identificar a presença de um resíduo Pro na posição i + 1 por uma característica adicional 2 ppm O deslocamentof o valor da deslocação CA química ^18.
   3. Comparar os valores dos desvios químicos das ressonâncias Ca e Cb correspondentes ao resíduo i-1 a uma tabela de desvios químicos previstos para os resíduos de aminoácidos da tau ¹⁹ para identificar a natureza do resíduo na posição i-1.
5. Escolha as frequências de ressonância de ¹⁵ N núcleos do 'i' e 'i-1' resíduos para cada ressonância ^[1 H, ¹⁵ N] de interesse no espectro HNCANNH.
6. Comparar os valores dos desvios químicos ^{de 15N} para a atribuição de desvio químico da proteína Tau ^20-23.
7. Compare as dip�tidos identificados com a sequência de Tau para definir a atribuição específica de sequência.

Resultados

A Figura 3A mostra um pico principal de absorção a 280 nm observados durante o gradiente de eluio. Este pico corresponde à proteína Tau purificada como visto no gel de acrilamida sobre o cromatograma. A Figura 3B mostra um pico de absorção bem separadas a 280 nm e o pico de condutividade, assegurando que a dessalinização da proteína é eficiente. A Figura 4 mostra a proteína de desvio em gel observada por análise de SDS-PAGE a ¹⁶ característica de fosforilação de pr...

Discussão

Temos usado espectroscopia de RMN para caracterizar amostras Tau enzimaticamente modificados. A expressão recombinante e purificação descritos aqui para a proteína tau humana de comprimento completo podem ser igualmente utilizados para produzir domínios tau ou mutantes Tau. Isotopicamente enriquecido proteína é necessária para a espectroscopia de RMN, necessitando de expressão recombinante. Identificação dos locais de fosforilação exige atribuição de ressonância e uma proteína duplamente marcada ^de...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
pET15B recombinant T7 expression plasmid	Novagen	69257	Keep at -20 °C
BL21(DE3) transformation competent E. coli bacteria	New England Biolabs	C2527I	Keep at -80 °C
Autoclaved LB Broth, Lennox	DIFCO	240210	Bacterial Growth Medium
MEM vitamin complements 100x	Sigma	58970C	Bacterial Growth Medium Supplement
15N, 13C-ISOGRO complete medium powder	Sigma	608297	Bacterial Growth Medium Supplement
15NH4Cl	Sigma	299251	Isotope
13C6-Glucose	Sigma	389374	Isotope
Protease inhibitor tablets	Roche	5056489001	Keep at 4 °C
1 tablet in 1 ml is 40x solution that can be kept at -20 °C
DNaseI	EUROMEDEX	1307	Keep at -20 °C
Homogenizer (EmulsiFlex-C3)	AVESTIN		Lysis is realized at 4 °C
Pierce™ Unstained Protein MW Marker	Pierce	266109
Active human MEK1 kinase, GST Tagged	Sigma	M8822	Keep at -80 °C
AKTÄ Pure chromatography system	GE Healthcare		FPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 ml column)	GE Healthcare	17-5156-01	Cation exchange chromatography columns
HiPrep 26/10 Desalting	GE Healthcare	17-5087-01	Protein Desalting column
PD MidiTrap G-25	GE Healthcare	28-9180-08	Protein Desalting column
Tris D11, 97% D	Cortecnet	CD4035P5	Deuterated NMR buffer
5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O (set of 5 inner & outerpipe)	Euriso-top	BMS-005B	NMR Shigemi Tubes
eVol kit-electronic syringe starter kit	Cortecnet	2910000	Pipetting
Bruker 900 MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead	Bruker		NMR spectrometer for data acquisition
Bruker 600 MHz Avance with a triple resonance cryogenic probehead	Bruker		NMR spectrometer for data acquisition
TopSpin 3.1	Bruker		Acquisition and Processing software for NMR experiments
Sparky 3.114	UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller)		NMR data Analysis software