JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

Abstract

تحفيز الاستجابة المناعية هو أداة شائعة في الدراسات اللافقارية لدراسة فعالية وآليات الحصانة. ويستند هذا التحفيز على حقن جزيئات غير المسببة للأمراض في الحشرات، كما سيتم الكشف عن الجسيمات من قبل النظام المناعي وسوف تحفز إنتاج المؤثرات المناعية. ونحن نركز هنا على تحفيز الاستجابة التصبغ في البعوض بعوض الملاريا. نتائج استجابة التصبغ في التغليف من الجسيمات الغريبة والطفيليات مع طبقة داكنة من الميلانين. لتحفيز هذا الرد، وتلقيح البعوض مع حبات في التجويف الصدري باستخدام أنابيب microcapillary الزجاج. ثم، بعد 24 ساعة، يتم تشريح البعوض لاسترداد الخرز. يتم قياس درجة التصبغ حبة باستخدام برمجيات تحليل الصور. حبات ليس لديها آثار المسببة للأمراض الطفيليات، أو قدرتها على التهرب أو يكبت الإستجابة المناعية. هذه الحقن هي وسيلة لقنينةإعادة فعالية جهاز المناعة وتأثير التحفيز المناعي على غيرها من الصفات تاريخ الحياة، مثل الخصوبة أو طول العمر. أنها ليست بالضبط نفس يدرس مباشرة التفاعلات المضيف الطفيليات، وإنما هو أداة مثيرة للاهتمام لدراسة الحصانة والكائنات الحية فيه التطورية.

Introduction

الحشرات تعتمد على الاستجابات المناعية لحماية أنفسهم ضد الطفيليات ومسببات الأمراض 1-3 أن اختراق بشرة أو المعي المتوسط ظهارة 4 بهم. في البعوض، وهذه الردود هي فعالة ضد البكتيريا 5، 6 الفيروسات والديدان الخيطية فيلارية 7، وطفيليات الملاريا 1،8،9. في البعوض، استجابة مناعية رئيسية هي التغليف من الجسيمات الغريبة مع الميلانين 10-12. قد يحدث هذا التغليف في المعى المتوسط أو في الدملمف تعميم نظام 10-12. هذا الرد التصبغ هي نتيجة المؤيدة للphenoloxidase تتالي 10-12، وأنها يمكن أن تؤدي إلى وفاة الطفيليات أو البلعمة بهم. في البعوض البالغ، حيث يقتصر عدد الخلايا hemocytes، التصبغ هو استجابة الخلطية، مثل ضد الطفيليات المتصورة أو الديدان الخيطية فيلارية 7.في بعض الحشرات الأخرى، فمن مباشر على خلايا hemocytes أن الالتفاف حول الطفيل إلى melanize منهم 7. الى جانب ذلك، الميلانين هو ضروري لعدة عملية الفسيولوجية الأخرى مثل إنتاج البيض والجروح بشرة الشفاء 7 أيضا.

يتم استخدام تحفيز الاستجابات المناعية كأداة لدراسة الحصانة الحشرات في عدة نظم نموذج الصحي الزراعي والعام 13-18. يتم استخدامه في الأنوفيليس البعوض الغامبية، الناقل الرئيسي لمرض الملاريا في أفريقيا، لدراسة التفاعلات مضيف الطفيل 14 - 16،19. وتعتمد هذه التقنيات على قدرة الحشرات للكشف عن الطفيليات مع مستقبلات التعرف على الأنماط الخاصة بهم (PRR) 2. قد البعوض أيضا الكشف عن جزيئات أخرى التدخل في تكوينها البيولوجي مثل أنماط الجزيئية المرتبطة الممرض (PAMPs)، أو كشف عن خلايا خاصة بهم تضررت بسبب الافراج عن الكولاجين والأحماض النووية. والخلايا المناعية البعوضوتستخدم الصورة مثل hemocytes للكشف عن 20-23. وأهم مسارات الإشارات المناعية IMD، تول، JAK / STAT 24، وتدخل الحمض النووي الريبي (رني) 25،26. كلا تول، ومسارات IMD تؤثر على استجابة التصبغ والتفاعل مع الموالية للphenoloxidase تتالي 10-12.

الأداة القياسية المستخدمة لتحفيز استجابة التصبغ هي تلقيح البعوض مع حبة صغيرة في الدملمف من التجويف الصدري. درجة التغليف الميلانين ومن ثم يمكن قياس 19 بعد استرداد حبة من خلال تشريح البعوض. في معظم الدراسات، تم حقن حبة واحدة فقط لكل البعوض 15،16،27، ولكن عن طريق الحقن المزيد من الخرز هو ممكن من أجل دراسة حدود استجابة التصبغ 19. يتم حقن هذه الخرز باستخدام محلول الحقن (المصل الفيزيولوجي) للحد من اضطراب في علم وظائف الأعضاء البعوض وجفاف البعوض 15،16،27. يضاف صبغ إلى هذا الحل لتخفيف اختيار حبة. انه هو نفسه من أجل حل تشريح استخدامه لاسترداد 15،16،27 حبة.

ميزة بتلقيح الحشرات مع المثيرات غير المسببة للأمراض هي القدرة على التركيز على التأثير المباشر على الاستجابة المناعية. ليس هناك أي آثار تعقيد بسبب الطفيليات المرضية 28، كبت المناعة 29-31، أو التهرب المناعة 31-34. الى جانب ذلك، من آثار التحفيز على غيرها من الصفات تاريخ الحياة، مثل طول العمر أو الخصوبة، ويمكن أيضا أن تدرس. وهكذا، والباحثين الذين يدرسون علم البيئة التطورية قد تتطلب هذه الأدوات 2،35،36. على سبيل المثال، النحل تحدى المناعية لها عمر تقصير تحت المجاعة. وقد لوحظت آثار سلبية مماثلة من التحفيز المناعي ونشر في نماذج اللافقارية المختلفة، وغالبا ما يؤدي في فترة قصيرةإيه عمر أو نجاح أقل الإنجاب 13،27،37. ويمكن إجراء مثل هذه الدراسات في بيئات مختلفة 2،4،38. تحفيز مناعة هي أيضا موضع اهتمام تلك التي تركز مباشرة على الباثولوجيا المناعية 39،40.

ويستند هذا البروتوكول على التلقيح من الخرز مع البعوض لتحفيز استجابة التصبغ ومباشرة قياس كمية الميلانين. وهذا يتيح دراسة كمية ونوعية الاستجابة التصبغ في إعدادات التجريبية المختلفة. ويمكن تمديد هذه أداة لتحفيز الاستجابة المناعية الأخرى، مثل استجابة مضادة للجراثيم البكتيريا 41 بالحرارة قتل. ويمكن أيضا أن تتم في كثير من الأوضاع البيئية.

Protocol

1. محلول ملحي للحقن وتشريح

  1. إعداد محلول ملحي وذلك بإضافة كلوريد الصوديوم، بوكل، وCaCl 2 إلى الماء المقطر للحصول على 1.3 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.5 ملي بوكل، و 0.2 ملي CaCl 2 في الرقم الهيدروجيني = 6.8.
  2. إضافة 1 مل من محلول الأخضر 0.1٪ الميثيل إلى 99 مل من محلول ملحي للون حبات شفافة. هذا هو 0.001٪ الأخضر الميثيل "حل حقن".
  3. ثم، إضافة 5 مل من محلول الأخضر 0.1٪ الميثيل إلى 45 مل من محلول ملحي. هذا 0.01٪ الأخضر الميثيل "الحل تشريح" هو 10 مرات أكثر تركيزا في الأخضر الميثيل لتسهيل تلوين من الخرز ومراقبتهم أثناء تشريح.
    ملاحظة: فلتر تعقيم العازلة إذا لزم الأمر.

2. إعداد شعري

  1. للحرارة سحب أنابيب microcapillary الزجاج للحصول على معلومات سرية ناعم جدا أكبر قليلا من أصغر حبات (φ = 40 ميكرون) 42.
  2. مفتوحة وdjust كل الشعرية عن طريق كسر غيض مع ملاقط أو عن طريق النشر في بلاغ.

3. البعوض تربية

  1. الخلفي الغامبية ألف في 26 ± 1 درجة مئوية والرطوبة النسبية 70 ± 5٪، وضوء 12:12 ساعة: دورة الظلام. إبقاء الإناث الكبار وتمكينهم من الوصول إلى محلول السكر 10٪.

4. مختارات الخرزة مع شعري

  1. صب 0.009 غرام من حبات سالبة الشحنة (40-120 ميكرون في القطر) في طبق بيتري 5 سم وإضافة 5 مل من محلول الحقن 30 دقيقة مقدما.
    ملاحظة: إن الهدف هو السماح للصبغ لون حبات لجعل اختيار حبة لحقن أسهل. الأوتوكلاف الخرز إذا أنها لا تأتي في وعاء معقم.
  2. باستخدام الشعرية التي تقام في لمبة الشعرية ماصة، بصريا تحديد أصغر حبة في 0.1 ميكرولتر من محلول ملحي تحت المجهر مجهر.
    ملاحظة: عندما بتلقيح عدة حبات في وقت واحد، حدد ثلاث حبات من إجمالي حجم 0.1 ميكرولتر.

5. التعامل مع البعوض والتلقيح

  1. استخدام الشافطة الحشرات، ووضع كل البعوض في أنبوب 50 مل.
  2. هدئ كل البعوض لفترة وجيزة عن طريق وضع أنبوب في الثلج المجروش (2-5 دقيقة).
  3. وضع البعوض على جانبها الأيمن تحت المجهر مجهر.
  4. تحت مجهر تشريحي، تطعيم البعوض مع الشعرية التي كتبها خارقة بقوة من خلال الجانب الأيسر للبشرة تجويف الصدر ثم حقن السائل وحبة.
    ملاحظة: احرص على عدم تلف عضلات الطيران من خلال عقد الشعرية كما عموديا على البعوض وقت ممكن.
  5. إزالة الشعيرات الدموية.
  6. باستخدام ملقط علم الحشرات وزن الريشة، تضع كل أنثى منفردة في كوب من البلاستيك 180 مل مغطاة الناموسيات. اعطائهم الصلاحية لمحلول السكر 10٪.
    الحذر مطلوب مع محلول السكر، حيث أن البعوض قد تتعثر على قطرات محلول السكر: ملاحظة.

6. البعوضتشريح والخرزة التصوير الفوتوغرافي

  1. تحقق مما إذا كان البعوض على قيد الحياة 24 ساعة بعد التطعيم. إذا كان الأمر كذلك، تحقق من حالتهم وتبقي فقط على البعوض التي هي قادرة على الطيران.
  2. تجميد هذه البعوض في -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: ويمكن أن تظل عدة أيام أو شهور قبل التشريح، وإذا لزم الأمر.
  3. إزالة أجنحة البعوض "باستخدام الملقط تحت المجهر مجهر في 32X التكبير. إصلاح الأجنحة على الشرائح الزجاجية مع الشريط الشفاف. كتابة التعليمات البرمجية المستخدمة لكل البعوض الفردية.
  4. وضع الشرائح الزجاجية في الماسح الضوئي والمسح الضوئي لها في 1200 نقطة في البوصة.
    ملاحظة: تأكد من أن متاحة للقراءة لكل البعوض الفردية.
  5. على شريحة المجهر والزجاج وفي حل تشريح، واستخدام الملقط لفصل الصدر من الرأس والبطن.
  6. فتح الصدر مع ملقط لاسترداد الخرز.
    ملاحظة: الخرز التي لا تتحرك في البطن، ليست على اتصال مع بعضها البعض، ومعظمهم تطفو بحرية في تيانه اللمف. يجب الحرص على عدم كسر حبة مع ملقط، وحبة غير melanized قد يكون من الصعب العثور عليها. انتظر 1-5 دقيقة حبات للحصول على اللون.
  7. نقل الخرز في قطرة من حل تشريح على الزجاج شريحة المجهر، قبل التقاط الصورة.
    ملاحظة: لا حاجة لغسل الخرز.
  8. باستخدام المجهر مزودة بكاميرا، التقاط صورة رقمية من كل حبة في الإعداد والإضاءة القياسية و400X التكبير.
    ملاحظة: لا تغيير الإضاءة بين الصور المختلفة لتمكين مقارنة بهم.

7. تحليل صورة: الخرزة التصبغ

  1. فتح برنامج تحليل الصور. انقر على "ملف" ثم على "فتح" للعثور على صورة حبة.
  2. انقر على "تحليل". انقر على "مجموعة القياسات." وضع علامة في مربع "يعني قيمة الرمادية" في إطار "تعيين القياسات".
  3. انقر على أيقونة دائرة أداة التحديد. حدد محيط حبة. البقاء فيالجانب حبة وتجنب هالة مضيئة من حوله.
  4. انقر على قائمة "تحليل". انقر على "تدبير". الحصول على قيمة الرمادي المتوسط ​​وحجم مساحة المقطع العرضي للحبة.
    1. للحصول على قيمة التصبغ كل حبة، تنفيذ العملية التالية باستخدام آلة حاسبة أو آلة حاسبة البرنامج: "256 - يعني قيمة الرمادي." هذا الاجراء التصبغ هو قيمة بين 0 و 256، مع 0 يمثل صورة بيضاء تماما.

النتائج

لم البعوض ليس كل melanize حبات في نفس الطريق، وبعض حبات كانت أقل مغطاة الميلانين من غيرها (الشكل 1). في الواقع، لا تزال بعض الخرز الأزرق بسبب نقص التصبغ، في حين أن البعض الآخر مظلم تماما (الشكل 1). كانت موحدة قيمة التصبغ التي كتبها الخط...

Discussion

هذه التقنية حقن مفيدة لتحفيز ودراسة استجابة التصبغ في البعوض. على سبيل المثال، وهنا قمنا بدراسة تأثير الحمل محفزات المناعة.

في خطوة حاسمة في هذا الإجراء هو لتطعيم صحيح البعوض. أي ضرر المفرط لعضلات الطيران أو البعوضة نفسها قد يمنع...

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

This research was possible through funding from the University of Neuchâtel. We would like to thank all the students that helped in improving this technique, namely our colleague Kevin Thievent. We would also like to thank the members of the Thomas Lab for making their laboratory available. We would like to thank Janet Teeple for her help with mosquito rearing. We would also like to thanks Loyal Hall in the laboratory of Pr. Tom Baker for his help in the preparation of the micro capillary glass tubes.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Microcapillary glass tubes GB120TF-10science-products.comGB120TF-10http://www.science-products.com/Products/CatalogG/Glass/Glass.html
Microcaps Capillary pipette bulbDrumond1-000-9000
negatively charged Sephadex CM C-25 beadsSigma-Aldrich, Steinheim, GermanyC25120 SIGMAneed few to start
Methyl greenSigma-Aldrich323829 ALDRICHneed few to start
Software ImageJopensourceVersion 1.47f7 or later

References

  1. Dong, Y., Aguilar, R., Xi, Z., Warr, E., Mongin, E., Dimopoulos, G. Anopheles gambiae immune responses to human and rodent Plasmodium parasite species. PLoS pathog. 2 (6), e52 (2006).
  2. Sadd, B. M., Schmid-Hempel, P. PERSPECTIVE: Principles of ecological immunology. Evolutionary Appl. 2 (1), 113-121 (2008).
  3. Crompton, P. D., Moebius, J., et al. Malaria Immunity in Man and Mosquito: Insights into Unsolved Mysteries of a Deadly Infectious Disease*. Annu Rev Immuno. 32 (1), 157-187 (2014).
  4. Schmid-Hempel, P. EVOLUTIONARY ECOLOGY OF INSECT IMMUNE DEFENSES. Annu Rev Entomol. 50 (1), 529-551 (2005).
  5. Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. Rapid phagocytosis and melanization of bacteria and Plasmodium sporozoites by hemocytes of the mosquito Aedes aegypti. J parasito. 89 (1), 62-69 (2003).
  6. Carissimo, G., Pondeville, E., et al. Antiviral immunity of Anopheles gambiae is highly compartmentalized, with distinct roles for RNA interference and gut microbiota. PNAS. 112 (2), E176-E185 (2015).
  7. Christensen, B. M., Li, J., Chen, C. -. C., Nappi, A. J. Melanization immune responses in mosquito vectors. Trends parasito. 21 (4), 192-199 (2005).
  8. Collins, F., Sakai, R., et al. Genetic selection of a Plasmodium-refractory strain of the malaria vector Anopheles gambiae. Science. 234 (4776), 607-610 (1986).
  9. Warr, E., Lambrechts, L., Koella, J. C., Bourgouin, C., Dimopoulos, G. Anopheles gambiae immune responses to Sephadex beads: Involvement of anti-Plasmodium factors in regulating melanization. Insect Biochem Molec. 36 (10), 769-778 (2006).
  10. Fuchs, S., Behrends, V., Bundy, J. G., Crisanti, A., Nolan, T. Phenylalanine metabolism regulates reproduction and parasite melanization in the malaria mosquito. PloS one. 9 (1), e84865 (2014).
  11. Cerenius, L., Söderhäll, K. The prophenoloxidase-activating system in invertebrates. Immuno Rev. 198, 116-126 (2004).
  12. Cerenius, L., Lee, B. L., Söderhäll, K. The proPO-system: pros and cons for its role in invertebrate immunity. Trend Immuno. 29 (6), 263-271 (2008).
  13. Moret, Y., Schmid-Hempel, P. . Survival for immunity: the price of immune system activation for bumblebee workers. , 1166-1168 (2000).
  14. Suwanchaichinda, C., Paskewitz, S. M. Effects of Larval Nutrition, Adult Body Size, and Adult Temperature on the Ability of Anopheles gambiae(Diptera: Culicidae) to Melanize Sephadex Beads. J Med Entomol. 35 (2), 157-161 (1998).
  15. Chun, J., Riehle, M., Paskewitz, S. M. Effect of Mosquito Age and Reproductive Status on Melanization of Sephadex Beads in Plasmodium-Refractory and -Susceptible Strains of Anopheles gambiae. J Invertebr Pathol. 66 (1), 11-17 (1995).
  16. Schwartz, A., Koella, J. C. Melanization of Plasmodium falciparum and C-25 Sephadex Beads by Field-Caught Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) from Southern Tanzania. J Med Entomol. 39 (1), 84-88 (2002).
  17. Zahedi, M., Denham, D. A., Ham, P. J. Encapsulation and melanization responses of Armigeres subalbatus against inoculated Sephadex beads. J Invertebr Pathol. 59 (3), 258-263 (1992).
  18. Laughton, A. M., Garcia, J. R., Altincicek, B., Strand, M. R., Gerardo, N. M. Characterisation of immune responses in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum. J insect physiol. 57 (6), 830-839 (2011).
  19. Barreaux, A. M. G., Barreaux, P., Koella, J. C. Overloading the immunity of the mosquito Anopheles gambiae with multiple immune challenges. Parasite Vector. 9 (1), 210 (2016).
  20. Lazzaro, B. P., Rolff, J. Danger, Microbes, and Homeostasis. Science. 332 (6025), 43-44 (2011).
  21. Arrighi, R. B. G., Faye, I. Plasmodium falciparum GPI toxin: a common foe for man and mosquito. Acta trop. 114 (3), 162-165 (2010).
  22. Michel, K., Kafatos, F. C. Mosquito immunity against Plasmodium. Insect Biochem Molec. 35 (7), 677-689 (2005).
  23. Osta, M. A., Christophides, G. K., Vlachou, D., Kafatos, F. C. Innate immunity in the malaria vector Anopheles gambiae: comparative and functional genomics. J Exp Biol. 207 (15), 2551-2563 (2004).
  24. Christophides, G. K., Vlachou, D., Kafatos, F. C. Comparative and functional genomics of the innate immune system in the malaria vector Anopheles gambiae. Immunol Rev. 198 (1), 127-148 (2004).
  25. Blair, C. D. Mosquito RNAi is the major innate immune pathway controlling arbovirus infection and transmission. Future microbiol. 6 (3), 265-277 (2011).
  26. Fragkoudis, R., Attarzadeh-Yazdi, G., Nash, A. A., Fazakerley, J. K., Kohl, A. Advances in dissecting mosquito innate immune responses to arbovirus infection. J Gen Virol. , (2009).
  27. Schwartz, A., Koella, J. C. The cost of immunity in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti depends on immune activation. J evol biol. 17 (4), 834-840 (2004).
  28. Lambrechts, L., Vulule, J. M., Koella, J. C. Genetic correlation between melanization and antibaterial immune responses in a natural population of the malaria vector Anopheles gambiae. Evolution. 58 (10), 2377 (2004).
  29. Boete, C., Paul, R. E. L., Koella, J. C. Direct and indirect immunosuppression by a malaria parasite in its mosquito vector. P Roy Soc B-Biol Sci. 271 (1548), 1611-1615 (2004).
  30. Sacks, D., Sher, A. Evasion of innate immunity by parasitic protozoa. Nat immunol. 3 (11), 1041-1047 (2002).
  31. Zambrano-Villa, S., Rosales-Borjas, D., Carrero, J. C., Ortiz-Ortiz, L. How protozoan parasites evade the immune response. Trend Parasito. 18 (6), 272-278 (2002).
  32. Damian, R. T. Parasite immune evasion and exploitation: reflections and projections. Parasitology. 115, S169-S175 (1997).
  33. Schmid-Hempel, P. Parasite immune evasion: a momentous molecular war. Trend ecol evol. 23 (6), 318-326 (2008).
  34. Schmid-Hempel, P. Immune defence, parasite evasion strategies and their relevance for "macroscopic phenomena" such as virulence. P Roy Soc B-Biol Sci. 364 (1513), 85-98 (2009).
  35. Stearns, S. C., Koella, J. C. The evolution of phenotypic plasticity in life history traits- predictions of reaction norms for age and size at maturity. Evolution. 40 (5), 893-913 (1986).
  36. Stearns, S. C. Life-history tactics: a review of the ideas. Q rev biol. 51 (1), 3-47 (1976).
  37. Valtonen, T. M., Kleino, A., Ramet, M., Rantala, M. J. Starvation Reveals Maintenance Cost of Humoral Immunity. Evol Biol. 37 (1), 49-57 (2010).
  38. Sheldon, B. C., Verhulst, S. Ecological immunology: costly parasite defences and trade-offs in evolutionary ecology. Trend Ecol Evo. 11 (8), 317-321 (1996).
  39. Graham, A. L., Allen, J. E., Read, A. F. Evolutionary causes and consequences of immunopathology. Annu Rev Ecol Evol S. 36, 373-397 (2005).
  40. Best, A., Long, G., White, A., Boots, M. The implications of immunopathology for parasite evolution. P Roy Soc B-Biol Sci. 279 (1741), 3234-3240 (2012).
  41. Cator, L. J., George, J., et al. 34;Manipulation" without the parasite: altered feeding behaviour of mosquitoes is not dependent on infection with malaria parasites. P Roy Soc B-Biol Sci. 280 (1763), 20130711 (2013).
  42. Voordouw, M. J., Lambrechts, L., Koella, J. No maternal effects after stimulation of the melanization response in the yellow fever mosquito Aedes aegypti. Oikos. 117 (8), 1269-1279 (2008).
  43. Paskewitz, S., Riehle, M. A. Response of Plasmodium refractory and susceptible strains of Anopheles gambiae to inoculated Sephadex beads. Dev comp immunol. 18 (5), 369-375 (1994).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

119

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved