Impfen<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Mosquitoes mit Perlen der Melanisierung Immunantwort zu induzieren und Messen

Zusammenfassung

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

Zusammenfassung

Die Stimulation der Immunantwort ist ein übliches Werkzeug in Invertebraten-Studien, die die Wirksamkeit und die Mechanismen der Immunität zu untersuchen. Diese Stimulation basiert auf der Injektion von nicht-pathogene Partikel in Insekten, da die Partikel durch das Immunsystem erkannt werden, und wird die Produktion von Immun Effektoren induzieren. Wir konzentrieren uns hier auf die Stimulation der Melanisierung Reaktion in der Mücke Anopheles gambiae. Die melanization Reaktion führt zur Verkapselung von Fremdpartikeln und Parasiten mit einer dunklen Schicht von Melanin. mit Mikrokapillare Glasröhren Um diese Reaktion zu stimulieren, Mücken sind mit Perlen in der Brusthöhle impft. Dann, nach 24 Stunden werden die Mücken seziert die Perlen zu holen. Der Grad der Melanisierung des Wulstes gemessen Bildanalyse-Software. Beads nicht die pathogene Wirkung von Parasiten haben oder ihre Fähigkeit, die Immunantwort zu entziehen oder zu unterdrücken. Diese Injektionen sind ein Weg, um Measure Immun Wirksamkeit und die Auswirkungen der Immunstimulationen auf andere Lebensgeschichte Züge, wie Fruchtbarkeit oder Langlebigkeit. Es ist nicht genau das gleiche wie direkt Wirt-Parasit-Wechselwirkungen zu studieren, aber es ist ein interessantes Tool, Immunität und seine evolutionäre Ökologie zu studieren.

Einleitung

Insekten verlassen sich auf Immunreaktionen , sich gegen Parasiten zu schützen und Krankheitserreger ^{von 1 bis 3} , die ⁴ durch ihre Kutikula oder ihre midgut Epithel verletzen. In Mücken, sind diese Reaktionen wirksam gegen Bakterien ^5, Viren ^6, Filariosen ⁷ und Malariaparasiten ^1,8,9. In Mücken, ein Schlüsselimmunantwort ist die Verkapselung von Fremdpartikeln mit Melanin ^{10. - 12..} Diese Einkapselung kann in der Mitteldarms oder in der Hämolymphe passieren System zirkulierenden ^{10 bis 12.} Diese melanization Antwort ist das Ergebnis der pro-Phenoloxidase ¹⁰ kaskadieren ^{- 12,} und es kann zum Tod der Parasiten oder deren Phagozytose führen. Bei erwachsenen Mücken, wo die Anzahl der Hämozyten Zellen beschränkt ist, ist Melanisierung eine humorale Antwort, wie gegen Plasmodium Parasiten oder Filariosen ^7.In einigen anderen Insekten ist es direkt die hemocytes Zellen, die sich um den Parasiten sammelt sie ⁷ bis melanize. Außerdem ist Melanin auch wichtig für mehrere andere physiologische Prozess , wie die Eierproduktion und Hautwunden ⁷ heilen.

Die Stimulation von Immunantworten wird als Werkzeug benutzt , um studieren Insekten Immunität in mehreren landwirtschaftlichen und öffentlichen Gesundheit Modellsysteme ^{13-18. 16,19 -} Es ist in Anopheles gambiae Mücken, die Hauptvektor von Malaria in Afrika, zu studieren Wirt-Parasit - Interaktionen ¹⁴ verwendet. Diese Techniken basieren auf der Fähigkeit der Insekten - Parasiten mit ihren Mustererkennungsrezeptoren (PRR) ² zu erkennen. Stechmücken können auch andere Moleküle mit ihren biology wie pathogen-associated molecular Muster (PAMPs) oder erkennen ihre eigenen geschädigter Zellen durch die Freisetzung von Kollagen und Nukleinsäuren stören detektieren. Die Mücke Immunzelle^{23 -} s wie die Hämocyten werden zur Detektion ²⁰ verwendet. Die wichtigsten Immunsignalwege sind Imd, Toll, JAK / STAT - ²⁴ und Ribonukleinsäure - Interferenz (RNAi) ^25,26. Sowohl Toll und Imd Wege beeinflussen die melanization Reaktion und Interaktion mit der pro-Phenoloxidase Kaskade ^{10 bis 12.}

Das Standardwerkzeug verwendet, um die melanization Antwort stimulieren ist die Impfung einer Mücke mit einer kleinen Perle in die Hämolymphe der Brusthöhle. Der Grad der Melanin - Verkapselung kann dann ¹⁹ gemessen werden , nachdem der Wulst durch die Dissektion der Mücke abruft. In den meisten Studien wurde nur eine Perle pro Mücke injiziert ^15,16,27, aber mehr Perlen Injektion möglich ist, um ¹⁹ die Grenzen der melanization Antwort zu studieren. Diese Kügelchen injiziert unter Verwendung einer Injektionslösung (physiologische Serum) Störung der Moskito Physiologie zu begrenzen unddie Austrocknung der Mücke ^15,16,27. Ein Farbstoff wird zu dieser Lösung gegeben bead Auswahl zu erleichtern. Es ist das gleiche für die Dissektion Lösung verwendet , um den Wulst ^15,16,27 abzurufen.

Der Vorteil von Insekten mit nicht pathogenen Stimuli Inokulieren ist die Fähigkeit, auf die direkte Wirkung auf die Immunantwort zu konzentrieren. Es gibt keine komplizieren Effekte aufgrund von Parasiten Pathogenität ^28, Immunsuppression ^29-31 oder Immunevasion ^31-34. Außerdem werden die Folgen der Stimulationen auf andere Lebensgeschichte Züge, wie Langlebigkeit oder Fruchtbarkeit, ebenfalls untersucht. So Forscher evolutionäre Ökologie studieren können solche Werkzeuge ^2,35,36 erfordern. Zum Beispiel Immunherausgefordert Hummeln haben eine verkürzte Lebensdauer unter Hunger. Ähnliche negative Auswirkungen von Immun Stimulationen und Einsätze haben in verschiedenen Invertebraten Modellen beobachtet, die häufig in einer kurzen ergeber Lebensdauer oder weniger Fortpflanzungserfolg ^13,27,37. Solche Studien können in unterschiedlichen Umgebungen ^2,4,38 durchgeführt werden. Immunität Anregende ist auch für diejenigen von Interesse direkt auf Immunopathologie ^39,40 konzentriert.

Dieses Protokoll basiert auf der Inokulation von Kügelchen mit Moskitos die Melanisierung Antwort zu stimulieren und direkt die Menge an Melanin zu messen. Dies ermöglicht eine quantitative und qualitative Untersuchung der melanization Reaktion in verschiedenen experimentellen Bedingungen. Solch ein Werkzeug zur Stimulation anderer Immunreaktionen, wie die antibakterielle Reaktion Bakterien verlängert werden ⁴¹ Hitze abgetöteten. Es kann auch in vielen ökologischen Einstellungen durchgeführt werden.

Protokoll

1. Kochsalzlösung für die Injektion und Dissection

1. Bereiten Sie die Salzlösung durch Zugabe von NaCl, KCl und CaCl ₂ zu destilliertem Wasser 1,3 mM NaCl zu erhalten, 0,5 mM KCl und 0,2 mM CaCl ₂ bei pH = 6,8.
2. 1 ml 0,1% Methylgrün Lösung auf 99 ml der Kochsalzlösung die transparenten Kügelchen zu färben. Dies ist die 0,001% Methylgrün "Injektionslösung".
3. Dann werden 5 ml 0,1% Methylgrün Lösung zu 45 ml der Salzlösung. Diese 0,01% Methylgrün "dissection Lösung" ist 10mal konzentrierter in Methylgrün die Färbung der Kügelchen und deren Beobachtung während der Dissektion zu erleichtern.
   HINWEIS: Filter sterilisieren den Puffer, falls erforderlich.

2. Kapillar-Vorbereitung

1. Wärme-Pull - Rohre Mikrokapillare Glas mit einer sehr feinen Spitze etwas größer als die kleinste Kügelchen (φ = 40 & mgr; m) ⁴² zu erhalten.
2. Offene und eindjust jede Kapillare, indem die Spitze mit einer Pinzette zu brechen oder durch die Spitze Absägen.

3. Mosquito aufrichten

1. Hinten A. gambiae bei 26 ± 1 ° C, 70 ± 5% relative Luftfeuchtigkeit und eine 0.12 Stunden Licht: Dunkel - Zyklus. Halten erwachsenen Weibchen und geben ihnen den Zugang zu einer 10% igen Zuckerlösung.

4. Bead Auswahl mit dem Kapillar

1. Gießen 0,009 g negativ geladenen Kügelchen (40-120 & mgr; m im Durchmesser) in einer 5 cm Petrischale und 5 ml Injektionslösung 30 Minuten im Voraus.
   HINWEIS: Das Ziel ist der Farbstoff zu lassen, um die Perlen Farbe Perlen Auswahl für die Injektion zu erleichtern. Autoclave die Perlen, wenn sie eine sterile Glas nicht kommen.
2. Verwendung einer Kapillare in einer Glühbirne Kapillarpipette montiert, visuell wählen die kleinste bead in 0,1 & mgr; l der Salzlösung unter einem binokularen Mikroskop.
   HINWEIS: Wenn Sie gleichzeitig mehrere Perlen Impfen, wählen drei Perlen aus einem Gesamtvolumen von 0,1 ul.

5. Mosquito Handhabung und Inokulation

1. Unter Verwendung eines Insekten Absauger, platzieren Sie jede Mücke in einem 50-ml-Tube.
2. Kühlen Sie jede Mücke kurz durch das Rohr in zerstoßenem Eis legen (2-5 min).
3. Legen Sie eine Mücke auf der rechten Seite unter dem Binokular.
4. Unter einem Stereomikroskop, impfen die Mücke mit der Kapillare fest durch die linke Seite der Brusthöhle Kutikula Piercing und dann die Flüssigkeit und den Wulst zu injizieren.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht wie möglich an die Mücke, indem die Kapillare als senkrecht die Flugmuskeln zu beschädigen.
5. Entfernen Sie die Kapillare.
6. Mit Feder Entomologie Pinzette, legen jedes Weibchen einzeln in einem 180 ml Kunststoffbecher mit Moskitonetz bedeckt; geben ihnen den Zugang zu einer 10% igen Zuckerlösung.
   HINWEIS: Vorsicht ist mit der Zuckerlösung erforderlich, da die Mücke auf Zuckerlösung Tropfen stecken bleiben.

6. MosquitoDissection und Bead Fotografie

1. Überprüfen Sie, ob die Mücken am Leben 24 Stunden nach der Impfung sind. Wenn ja, überprüfen Sie ihren Zustand und halten nur die Mücken, die fähig sind zu fliegen.
2. Frieren Sie diese Mücken bei -20 ° C.
   HINWEIS: Sie können mehrere Tage bis Monate vor Dissektion gehalten werden, wenn nötig.
3. Entfernen Sie die Moskitos Flügel Pinzette unter dem Binokular auf das 32-fache Vergrößerung verwendet wird. Befestigen Sie die Flügel auf Glasobjektträger mit durchsichtigem Klebeband. Schreiben Sie den Code unten für jede einzelne Mücke verwendet.
4. Setzen Sie die Glasobjektträger in einem Scanner und scannen sie bei 1.200 dpi.
   HINWEIS: Überprüfen Sie, dass der Code für jede einzelne Mücke lesbar ist.
5. Auf einem Glasobjektträger und in Sezieren Lösung, verwenden Pinzette den Thorax aus dem Kopf und Bauch zu trennen.
6. Öffnen Sie den Thorax mit einer Pinzette die Perlen zu holen.
   HINWEIS: Perlen, die auf den Bauch nicht bewegen, sind nicht in Kontakt miteinander und die meisten von ihnen schweben frei in ter Hämolymphe. Achten Sie darauf, nicht den Wulst mit der Zange zu brechen, als ein nicht-melanisierten Wulst hart sein kann zu finden. Warten Sie 1 bis 5 min für Perlen Farbe zu erhalten.
7. Übertragen Sie die Perlen in einem Tropfen Dissektion Lösung auf einem Glasobjektträger, bevor Sie das Bild.
   HINWEIS: Keine Notwendigkeit, die Perlen zu waschen.
8. Mit einem Mikroskop mit einer Kamera ausgestattet, nehmen Sie ein digitales Bild von jedem Wulst an einer Standardbeleuchtung Einstellung und 400-facher Vergrößerung.
   HINWEIS: Die Beleuchtung zwischen den verschiedenen Bilder nicht ändern ihren Vergleich zu ermöglichen.

7. Bildanalyse: Bead Melanisierung

1. Öffnen Sie die Bildanalyse-Software. Klicken Sie auf "Datei" und dann auf "Öffnen" eine Perle Bild zu finden.
2. Klicken Sie auf "zu analysieren." Klicken Sie auf "Set-Messungen." Markieren Sie das "bedeuten Grauwert" in der Gruppe "Set-Messungen" Fenster.
3. Klicken Sie auf das Kreis-Auswahl-Werkzeug-Symbol. Wählen Sie den Wulst Umfang; bleiben inSeite der Wulst und vermeiden Sie den leuchtenden Halo umgeben.
4. Klicken Sie auf das "analysieren" -Menü. Klicken Sie auf "Messen". Erhalten des mittleren Grauwert und die Größe der Querschnittsfläche der Sicke.
   1. Um den melanization Wert jeder Perle zu erhalten, führen Sie die folgende Operation einen Rechner oder Rechner-Software: "256 - Grauwert bedeuten." Die melanization Maßnahme ist ein Wert zwischen 0 und 256, wobei 0 ein völlig weißes Bild darstellt.

Ergebnisse

Stechmücken nicht alle melanize die Perlen in der gleichen Weise, wie einige Perlen weniger mit Melanin bedeckt waren als andere (Abbildung 1). Tatsächlich blieben einige Perlen wegen eines Mangels an melanization blau, während andere völlig dunkel waren (Abbildung 1). Der Melanisierung Wert wurde durch lineare Interpolation auf einen Wert zwischen 0 standardisiert (was zu einem blauen und unmelanized bead entsprach) und 100 (entsprechend einer...

Diskussion

Diese Injektionstechnik ist nützlich, um die melanization Reaktion in Mücken zu stimulieren und zu studieren. Zum Beispiel, hier untersuchten wir die Wirkung der Immunstimuli Last.

Der entscheidende Schritt in diesem Verfahren ist, um richtig die Mücke impfen. Jede übermäßige Schäden an den Flugmuskeln oder die Mücke selbst kann die Mücke von der Fütterung zu verhindern oder sie kann vor der Dissektion töten. Ein zweiter wichtiger Schritt ist, um die Mücken auf Eis lange genug zu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microcapillary glass tubes GB120TF-10	science-products.com	GB120TF-10	http://www.science-products.com/Products/CatalogG/Glass/Glass.html
Microcaps Capillary pipette bulb	Drumond	1-000-9000
negatively charged Sephadex CM C-25 beads	Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany	C25120 SIGMA	need few to start
Methyl green	Sigma-Aldrich	323829 ALDRICH	need few to start
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