Inoculador<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Los mosquitos con los granos para inducir y medir la respuesta inmune melanización

Resumen

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

Resumen

La estimulación de la respuesta inmune es una herramienta común en estudios de invertebrados para examinar la eficacia y los mecanismos de la inmunidad. Esta estimulación se basa en la inyección de partículas no patógenos en los insectos, como las partículas serán detectados por el sistema inmune y inducirán la producción de efectores inmunes. Nos centramos aquí en la estimulación de la respuesta melanización en el mosquito Anopheles gambiae. Los resultados melanization respuesta en la encapsulación de partículas extrañas y parásitos con una capa oscura de melanina. Para estimular esta respuesta, los mosquitos se inoculan con los granos en la cavidad torácica utilizando tubos de vidrio microcapilar. Entonces, después de 24 horas, los mosquitos se disecan para recuperar las perlas. El grado de melanización de la perla se mide usando software de análisis de imágenes. Perlas no tienen los efectos patógenos de los parásitos, o su capacidad para evadir o suprimen la respuesta inmune. Estas inyecciones son una manera de Measure eficacia inmunológica y el impacto de los estímulos inmunes en otros rasgos de historia de vida, tales como la fecundidad o la longevidad. No es exactamente lo mismo que estudiar directamente las interacciones huésped-parásito, pero es una interesante herramienta para estudiar la inmunidad y su ecología evolutiva.

Introducción

Los insectos se basan en las respuestas inmunitarias para protegerse contra los parásitos y patógenos ^{1 - 3} que violan a través de su cutícula o el epitelio del intestino medio ^4. En los mosquitos, estas respuestas son eficaces contra las bacterias, virus ^{5 6 7} filaria, nematodos, parásitos de la malaria y ^1,8,9. En los mosquitos, una respuesta inmune clave es la encapsulación de partículas extrañas con melanina ^{10 - 12.} Esta encapsulación puede ocurrir en el intestino medio o en la hemolinfa sistema de circulación de ^{10 a 12.} Este melanization respuesta es el resultado de la pro-fenoloxidasa cascada ^{10 - 12,} y puede conducir a la muerte de los parásitos o para su fagocitosis. En los mosquitos adultos, donde el número de células de hemocitos es limitado, melanización es una respuesta humoral, al igual que contra los parásitos Plasmodium o nematodos filarias ^7.En algunos otros insectos, que está directamente las células de hemocitos que se reúnen alrededor del parásito a melanize ellas ^7. Además, la melanina es también esencial para varios otros procesos fisiológicos como la producción de huevos y heridas de cicatrización de la cutícula ^7.

La estimulación de la respuesta inmune se utiliza como una herramienta para estudiar la inmunidad de insectos en varios sistemas modelo de salud pública agrícola y ^{13 - 18.} Se utiliza en los mosquitos Anopheles gambiae, el principal vector de la malaria en África, para estudiar las interacciones huésped-parásito ^{14 - 16,19.} Estas técnicas se basan en la capacidad de los insectos para detectar parásitos con sus receptores de reconocimiento de patrones (PRR) ^2. Los mosquitos también pueden detectar otras moléculas que interfieren con su biología, tales como patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), o detectar sus propias células dañadas debido a la liberación de colágeno y ácidos nucleicos. La célula inmune mosquitos tales como los hemocitos se utilizan para la detección de ^{20 - 23.} Las principales vías de señalización son inmunes IMD, peaje, JAK / STAT ^24, y la interferencia de ácido ribonucleico (RNAi) ^25,26. Tanto peaje y vías IMD influyen en la melanization respuesta e interactúan con el pro-fenoloxidasa en cascada ^{10 - 12.}

La herramienta estándar que se utiliza para estimular la respuesta melanización es la inoculación de un mosquito con una pequeña gota en la hemolinfa de la cavidad torácica. El grado de encapsulación de melanina a continuación, se puede medir ¹⁹ después de recuperar el cordón a través de la disección del mosquito. En la mayoría de estudios, sólo un talón se inyectó por mosquito ^15,16,27, pero la inyección de más cuentas es posible con el fin de estudiar los límites de la respuesta melanización ^19. Estas perlas se inyectan usando una solución de inyección (suero fisiológico) para limitar la perturbación de la fisiología y mosquitola desecación del mosquito ^15,16,27. Un colorante se añade a esta solución para facilitar la selección de perlas. Es lo mismo para la solución de disección se utiliza para recuperar el ^15,16,27 talón.

La ventaja de la inoculación de los insectos con los estímulos no patógena es la capacidad de concentrarse en el efecto directo sobre la respuesta inmune. No hay efectos que complican debido a la patogenicidad del parásito ^28, inmunosupresión ^{29 - 31,} o ^{el 31 de} evasión inmune ^{- de 34.} Además, las consecuencias de las estimulaciones en otros rasgos de historia de vida, tales como la longevidad o la fecundidad, pueden también ser estudiados. Por lo tanto, los investigadores que estudian la ecología evolutiva pueden requerir este tipo de herramientas ^2,35,36. Por ejemplo, los abejorros inmuno-desafió tienen una vida más corta en virtud de la inanición. efectos negativos similares de estímulos inmunes y las implementaciones se han observado en diferentes modelos de invertebrados, a menudo resulta en un cortoer vida útil o el éxito reproductivo menos ^13,27,37. Tales estudios pueden llevarse a cabo en diversos entornos ^2,4,38. Estimular la inmunidad es también de interés para los que se centran directamente en la inmunopatología ^39,40.

Este protocolo se basa en la inoculación de los granos con los mosquitos para estimular la respuesta melanización y directamente medir la cantidad de melanina. Esto permite el estudio cuantitativo y cualitativo de la melanization respuesta en diferentes parámetros experimentales. Tal herramienta se puede extender a la estimulación de otras respuestas inmunes, tales como la respuesta a las bacterias antibacteriano ⁴¹ muertos por calor. También puede llevarse a cabo en muchos entornos ecológicos.

Protocolo

1. Solución salina para inyección y disección

1. Preparar la solución salina mediante la adición de NaCl, KCl, CaCl ₂ y a agua destilada para obtener NaCl 1,3 mM, KCl 0,5 mM, y CaCl 0,2 mM ₂ a pH = 6,8.
2. Añadir 1 ml de solución de verde 0,1% de metilo a 99 mililitros de la solución salina para colorear las perlas transparentes. Esta es la "solución de inyección" de 0,001% verde de metilo.
3. A continuación, añadir 5 ml de solución de verde 0,1% de metilo a 45 ml de la solución salina. Esta "solución disección" 0,01% verde de metilo es de 10 veces más concentrado en verde de metilo para facilitar la coloración de las perlas y su observación durante la disección.
   NOTA: Filtro de esterilizar el tampón si es necesario.

2. Preparación Capilar

1. Tubos de vidrio capilar se Heat-pull para obtener una punta muy fina ligeramente más grandes que los granos más pequeños (φ = 40 micras) ^42.
2. Abierta y unaJUSTE cada capilar rompiendo la punta con unas pinzas o por aserrado la punta fuera.

3. Mosquito Crianza

1. Trasera A. gambiae a 26 ± 1 ° C, 70 ± 5% de humedad relativa, y una luz 12:12 h: oscuridad ciclo. Mantenga las hembras adultas y darles acceso a una solución de azúcar al 10%.

4. Selección del grano con el capilar

1. Verter 0.009 g de perlas cargadas negativamente (40 a 120 micras de diámetro) en un plato de Petri de 5 cm y añadir 5 ml de solución de inyección 30 min con antelación.
   NOTA: El objetivo es permitir que el tinte de color Las cuentas para hacer la selección del grano para la inyección más fácil. Autoclave las cuentas si no vienen en un frasco estéril.
2. El uso de un capilar montado en un bulbo de pipeta capilar, seleccionar visualmente el grano más pequeño en 0,1 l de la solución salina con un microscopio binocular.
   NOTA: Cuando la inoculación de varias cuentas al mismo tiempo, seleccione tres cuentas de un volumen total de 0,1 l.

5. Manejo del mosquito y la inoculación

1. El uso de un aspirador de insectos, coloque cada mosquito en un tubo de 50 ml.
2. Chill cada mosquito brevemente colocando el tubo en hielo triturado (2-5 min).
3. Coloque un mosquito en su lado derecho bajo el microscopio binocular.
4. Bajo un microscopio estereoscópico, inocular el mosquito con el capilar por firmemente perforación a través de la parte izquierda de la cutícula cavidad torácica y luego inyectar el líquido y el talón.
   NOTA: Tenga cuidado de no dañar los músculos de vuelo mediante la celebración de los capilares como perpendicularmente al mosquito como sea posible.
5. Retire el capilar.
6. El uso de pinzas entomología de peso pluma, colocar cada mujer individualmente en un vaso de plástico de 180 ml cubierto con un mosquitero; darles acceso a una solución de azúcar al 10%.
   NOTA: Se debe tener precaución con la solución de azúcar, como el mosquito puede quedar atrapado en gotas de la solución azucarada.

6. MosquitoLa disección y Fotografía del grano

1. Compruebe si los mosquitos están vivos 24 horas después de la inoculación. Si es así, comprobar su estado y mantener sólo los mosquitos que son capaces de volar.
2. Congelación de estos mosquitos a -20 ° C.
   NOTA: Se pueden conservar varios días a meses antes de la disección, si es necesario.
3. Retire las alas de los mosquitos utilizando pinzas bajo un microscopio binocular en la ampliación de 32X. Fijar las alas en portaobjetos de vidrio con cinta adhesiva transparente. Anote el código utilizado para cada individuo de mosquitos.
4. Ponga los portaobjetos de vidrio en un escáner y escanearlas a 1.200 dpi.
   NOTA: Compruebe que el código es legible para cada individuo de mosquitos.
5. En un portaobjetos de microscopio de vidrio y en la solución de la disección, el uso de fórceps para separar el tórax de la cabeza y el abdomen.
6. Abrir el tórax con una pinza para recuperar las perlas.
   NOTA: los granos que no se mueven en el abdomen, no están en contacto entre sí y la mayoría de ellos flotan libremente en tque hemolinfa. Tenga cuidado de no romper el cordón con las pinzas, como una perla no melanized puede ser difícil de encontrar. Espere 1 a 5 min para los granos para obtener color.
7. La transferencia de los granos en una gota de la solución de la disección en un portaobjetos de vidrio, antes de tomar la fotografía.
   NOTA: No es necesario lavar las perlas.
8. El uso de un microscopio equipado con una cámara, tomar una imagen digital de cada perla con un ajuste de la iluminación estándar y una ampliación de 400X.
   NOTA: No cambie la iluminación entre las diferentes imágenes para permitir su comparación.

7. Análisis de la foto: Bead melanización

1. Abra el software de análisis de imágenes. Haga clic en "archivo" y luego en "abrir" para encontrar una imagen de perlas.
2. Haga clic en "Analizar". Haga clic en "mediciones establecidas." Marque la casilla "valor medio gris" en la ventana de "medidas de ajuste".
3. Haga clic en el icono de la herramienta de selección círculo. Seleccione el perímetro del talón; permanecer enlado del talón y evitar el halo luminoso alrededor de ella.
4. Haga clic en el menú "Analizar". Haga clic en "medida". Obtener el valor de gris medio y el tamaño del área de sección transversal de la perla.
   1. Para obtener el valor melanización de cada cuenta, realice la siguiente operación usando una calculadora o calculadora de software: "256 - valor medio gris." La medida melanización es un valor entre 0 y 256, donde 0 representa una imagen totalmente blanco.

Resultados

Los mosquitos no todos hicieron melanize las perlas de la misma manera, ya que algunas cuentas fueron cubiertas con menos melanina que otros (Figura 1). De hecho, algunas perlas permanecieron azul debido a la falta de melanización, mientras que otros eran completamente oscuro (Figura 1). El valor melanización fue estandarizado por interpolación lineal a un valor entre 0 (lo que correspondía a una perla azul y unmelanized) y 100 (que corresponde...

Discusión

Esta técnica de inyección es útil para estimular y estudiar la melanization respuesta en los mosquitos. Por ejemplo, aquí se estudió el efecto de la carga de estímulos inmune.

El paso crítico en este procedimiento es para inocular apropiadamente el mosquito. Cualquier daño excesivo a los músculos de vuelo o al propio mosquito puede prevenir el mosquito de la alimentación o puede acabar con él antes de la disección. Un segundo paso clave es mantener a los mosquitos en el hielo el ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microcapillary glass tubes GB120TF-10	science-products.com	GB120TF-10	http://www.science-products.com/Products/CatalogG/Glass/Glass.html
Microcaps Capillary pipette bulb	Drumond	1-000-9000
negatively charged Sephadex CM C-25 beads	Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany	C25120 SIGMA	need few to start
Methyl green	Sigma-Aldrich	323829 ALDRICH	need few to start
Software ImageJ	opensource		Version 1.47f7 or later