inoculando<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Os mosquitos com grânulos para induzir e medir a melanizacao Resposta Imunológica

Resumo

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

Resumo

A estimulação de respostas imunes é uma ferramenta comum em estudos de invertebrados para examinar a eficácia e os mecanismos de imunidade. Esta estimulação é baseado em a injecção de partículas não patogénicas em insectos, como as partículas vão ser detectado pelo sistema imunológico e induzem a produção de efectores imunitários. Nós nos concentramos aqui na estimulação da resposta melanizacao no mosquito Anopheles gambiae. Os resultados de resposta melanizacao no encapsulamento de partículas estranhas e parasitas com uma camada escura de melanina. Para estimular essa resposta, os mosquitos são inoculados com contas na cavidade torácica, utilizando tubos microcapilar de vidro. Então, depois de 24 horas, os mosquitos são dissecados para recuperar as contas. O grau de melanização do grânulo é medida utilizando software de análise de imagem. Grânulos não têm os efeitos patogénicos de parasitas, ou a sua capacidade de evitar ou suprimir a resposta imunitária. Estas injecções são uma forma de measure eficácia imunológico e o impacto da estimulação do sistema imunológico em outros traços da história de vida, tais como fecundidade e longevidade. Ele não é exactamente o mesmo que estudando directamente interacções hospedeiro-parasita, mas é uma ferramenta interessante para o estudo da imunidade e da sua ecologia evolutiva.

Introdução

Insetos dependem de respostas imunes para se proteger contra parasitas e patógenos ^{1 - 3} que violam através da sua cutícula ou a sua epitélio do intestino médio ^4. Em mosquitos, estas respostas são eficientes contra bactérias, vírus ^{5 6,} nematóides filarial ⁷ e parasitas da malária ^1,8,9. Em mosquitos, uma resposta imune chave é a encapsulação de partículas estranhas com melanina ^10-12. Este encapsulamento pode ocorrer no intestino ou na hemolinfa sistema de circulação ^{10 - 12.} Esta resposta melanização é o resultado de o pró-fenoloxidase cascata ^{10 - 12,} e que pode conduzir à morte dos parasitas ou a sua fagocitose. Em mosquitos adultos, onde o número de células hemócitos é limitado, melanização é uma resposta humoral, como contra parasitas de Plasmodium ou nemátodos filariais ^7.Em alguns outros insetos, é diretamente as células hemócitos que se reúnem em torno do parasita para melanize-los ^7. Além disso, a melanina também é essencial para vários outros processos fisiológicos como a produção de ovos e feridas cutícula cura ^7.

A estimulação de respostas imunes é usado como uma ferramenta para o estudo da imunidade de insectos em vários sistemas de modelo de saúde pública agrícola e ^{13 - 18.} É utilizado em Anopheles gambiae os mosquitos, o principal vetor de malária na África, para estudar as interações parasita-hospedeiro ^{14 - 16,19.} Estas técnicas baseiam-se na capacidade de insectos para detectar parasitas com os seus receptores de reconhecimento de padrões (PRR) ^2. Os mosquitos também pode detectar outras moléculas que interferem com a sua biologia, como padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), ou detectar suas próprias células danificadas devido à liberação de colágeno e ácidos nucleicos. A célula imune mosquitos tais como os hemócitos são utilizados para a detecção de ^20-23. As principais vias de sinalização imunes são IMD, Toll, JAK / STAT ^24, e interferência do ácido ribonucleico (RNAi) ^25,26. Ambos Toll e vias IMD influenciar a resposta melanizacao e interagir com o pró-fenoloxidase cascata ^10-12.

A ferramenta de padrão usado para estimular a resposta melanização é a inoculação de um mosquito com um pequeno rebordo na hemolinfa da cavidade torácica. O grau de encapsulamento melanina pode então ser medida ¹⁹ depois de recuperar o cordão através da dissecação do mosquito. Na maioria dos estudos, apenas uma esfera foi injectada por mosquito ^15,16,27, mas injectando mais grânulos é possível, a fim de estudar os limites da resposta melanização ^19. Estes grânulos são injectados utilizando uma solução para injecção (soro fisiológico), para limitar a perturbação do mosquito e fisiologiaa dessecação do mosquito ^15,16,27. Um corante é adicionado a esta solução para facilitar a selecção de grânulo. É o mesmo para a solução de dissecção usado para recuperar o grânulo ^15,16,27.

A vantagem de inoculação de insectos com estímulos não patogénico é a capacidade de focar sobre o efeito directo sobre a resposta imune. Não há efeitos que complicam devido ao parasita patogenicidade ^28, imunossupressão ^29-31, ou a evasão imune ^31-34. Além disso, as consequências das estimulações de outras características da história de vida, tais como a longevidade ou fecundidade, pode também ser estudado. Assim, os pesquisadores que estudam ecologia evolutiva pode exigir tais ferramentas ^2,35,36. Por exemplo, zangões desafiou-imuno têm uma vida útil encurtada sob fome. efeitos negativos semelhantes de estímulos imunitários e implantações foram observadas em diferentes modelos de invertebrados, resultando muitas vezes num curtoer a vida útil ou o sucesso reprodutivo menos ^13,27,37. Tais estudos podem ser realizados em ambientes variados ^2,4,38. Estimular a imunidade também é de interesse para aqueles focando diretamente imunopatologia ^39,40.

Este protocolo baseia-se na inoculação de grânulos com mosquitos para estimular a resposta melanização e directamente medem a quantidade de melanina. Isso permite estudo quantitativo e qualitativo da resposta melanizacao em diferentes configurações experimentais. Uma tal ferramenta pode ser estendido para a estimulação de outras respostas imunes, tais como a resposta antibacteriana a bactérias ⁴¹ aquecer-morto. Ele também pode ser realizado em muitos contextos ecológicos.

Protocolo

1. solução salina por injeção e Dissection

1. Preparar a solução salina através da adição de NaCl, KCl, e CaCl ₂ de água destilada para obter NaCl 1,3 mM, KCl 0,5 mM, e CaCl ₂ 0,2 mM, a pH = 6,8.
2. Adicionar 1 ml de solução verde 0,1% de metilo a 99 ml da solução de soro fisiológico para colorir as contas transparente. Esta é a "solução injectável" verde metil 0,001%.
3. Em seguida, adicionam-se 5 ml de solução a 0,1% verde de metilo a 45 ml de solução salina. Esta "solução de dissecação" verde metil 0,01% é 10 vezes mais concentrada em verde metil para facilitar a coloração das pérolas e sua observação durante a dissecção.
   NOTA: Filtro de esterilizar o tampão, se necessário.

2. Preparação Capilar

1. Calor-pull tubos microcapilar de vidro para obter uma ponta muito fina ligeiramente maior do que as mais pequenas esferas (φ = 40 mm) ^42.
2. Aberta e umdjust cada capilar, quebrando a ponta com uma pinça ou serrando a ponta fora.

3. Mosquito Empinar

1. Traseira A. gambiae a 26 ± 1 ° C, 70 ± 5% de umidade relativa, e uma luz 12:12 hr: ciclo escuro. Mantenha as fêmeas adultas e dar-lhes acesso a uma solução de açúcar de 10%.

4. Seleções do grânulo com a Capilar

1. Pour 0,009 g de grânulos carregados negativamente (40-120 um de diâmetro) numa placa de Petri 5 centímetros e adicionam-se 5 ml de solução de injecção de 30 minutos de antecedência.
   NOTA: O objetivo é permitir que o corante de cor as contas para fazer a seleção talão para a injeção mais fácil. Autoclave as contas, se eles não vêm em um frasco estéril.
2. Usando um tubo capilar montado em um bolbo de pipeta capilar, seleccionar visualmente o menor grânulo em 0,1 mL da solução salina sob um microscópio binocular.
   NOTA: Quando inocular várias esferas simultaneamente, selecione três contas a partir de um volume total de 0,1 mL.

5. Manuseamento Mosquito e inoculação

1. Usando um aspirador de insectos, colocar cada mosquito em um tubo de 50 ml.
2. Relaxar cada mosquito brevemente, colocando o tubo em gelo triturado (2-5 min).
3. Coloque um mosquito em seu lado direito sob o microscópio binocular.
4. Sob um microscópio estereoscópico, inocular o mosquito com o capilar por perfuração firmemente através do lado esquerdo da cutícula cavidade torácica e depois injectar o líquido e o talão.
   NOTA: Tome cuidado para não danificar os músculos de vôo, segurando o capilar como perpendicularmente ao mosquito possível.
5. Remover o capilar.
6. Utilizando uma pinça entomologia pluma, coloque cada fêmea individualmente em um copo de plástico de 180 ml coberto com um mosquiteiro; dar-lhes acesso a uma solução de açúcar de 10%.
   NOTA: É necessário ter cuidado com a solução de açúcar, como o mosquito pode ficar preso em gotas da solução açucarada.

6. MosquitoDissecção e Fotografia Bead

1. Verifique se os mosquitos estão vivos 24 horas após a inoculação. Se assim for, verificar a sua condição e manter apenas os mosquitos que são capazes de voar.
2. Congelar esses mosquitos a -20 ° C.
   NOTA: Eles podem ser mantidos vários dias a meses antes da dissecação, se necessário.
3. Remover asas dos mosquitos, usando uma pinça sob um microscópio binocular em 32X de ampliação. Fixar as asas em lâminas de vidro com fita adesiva transparente. Anote o código usado para cada mosquito individual.
4. Coloque as lâminas de vidro em um scanner e digitalizá-los a 1.200 dpi.
   NOTA: Verifique se o código é legível para cada mosquito individual.
5. Em uma lâmina de microscópio de vidro e na solução de dissecção, utilizar uma pinça para separar o tórax da cabeça e do abdómen.
6. Abra o tórax com uma pinça para recuperar as contas.
   NOTA: Beads que não se movem para o abdômen, não estão em contacto uns com os outros ea maioria deles flutuar livremente em tele hemolinfa. Tenha cuidado para não quebrar o cordão com a pinça, como um cordão não melanizadas pode ser difícil de encontrar. Espere por 1 a 5 min para grânulos para obter uma cor.
7. Transferir as contas em uma gota de solução de dissecção em uma lâmina de vidro, antes de tirar a foto.
   NOTA: Não há necessidade de lavar as contas.
8. Usando um microscópio equipado com uma câmera, dê uma imagem digital de cada conta com uma definição de iluminação padrão e aumento de 400X.
   NOTA: Não altere a iluminação entre as diferentes imagens para permitir a sua comparação.

7. Análise de Imagem: Bead melanizacao

1. Abra o software de análise de imagem. Clique em "Arquivo" e depois em "abrir" para encontrar uma imagem de talão.
2. Clique em "analisar". Clique em "medições previstas." Marque a caixa "significa valor de cinza" na janela "Definir medidas".
3. Clique no ícone do círculo ferramenta de seleção. Selecione o perímetro talão; permanecem emlado do talão e evitar o halo luminoso em torno dele.
4. Clique no menu "analisar". Clique em "medida". Obter o valor médio de cinzentos e o tamanho da área da secção transversal do cordão.
   1. Para obter o valor melanizacao de cada grânulo, realize a seguinte operação usando uma calculadora ou calculadora software: "256 - valor médio de cinza." A medida melanização é um valor entre 0 e 256, com 0 representando uma imagem totalmente branco.

Resultados

Os mosquitos que nem todos melanize os grânulos do mesmo modo, como algumas esferas foram cobertas com menos melanina do que outras (Figura 1). Na verdade, alguns grânulos permaneceu azul devido a uma falta de melanização, ao passo que outros foram completamente escuro (Figura 1). O valor melanização foi padronizado por interpolação linear para um valor entre 0 (o que corresponde a um cordão azul e unmelanized) e 100 (correspondendo a uma ...

Discussão

Esta técnica de injeção é útil para estimular e estudar a resposta melanizacao em mosquitos. Por exemplo, aqui nós estudamos o efeito da carga de estímulos imunológico.

O passo crítico neste procedimento é adequada para inocular o mosquito. Qualquer dano excessivo aos músculos de vôo ou para o próprio mosquito pode impedir que o mosquito da alimentação ou podem matá-lo antes da dissecção. Um segundo passo fundamental é manter os mosquitos no gelo tempo suficiente para derr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microcapillary glass tubes GB120TF-10	science-products.com	GB120TF-10	http://www.science-products.com/Products/CatalogG/Glass/Glass.html
Microcaps Capillary pipette bulb	Drumond	1-000-9000
negatively charged Sephadex CM C-25 beads	Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany	C25120 SIGMA	need few to start
Methyl green	Sigma-Aldrich	323829 ALDRICH	need few to start
Software ImageJ	opensource		Version 1.47f7 or later