Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Abstract

وتشمل المشاكل المشتركة في تجهيز العينات البيولوجية لالملاحظات مع المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) انهيار الخلية، ومعالجة عينات من microenvironments الرطب وتدمير الخلايا. باستخدام الأنسجة الشباب الأزهار، الخراجات طلائعيات بيضية، وجراثيم الفطريات (غاريقونيات) كأمثلة، بروتوكولات محددة لمعالجة عينات الحساسة موصوفة هنا أن التغلب على بعض التحديات الرئيسية في معالجة عينة لالتقاط الصور تحت SEM.

الخلايا الإنشائية نباتية ثابتة مع القوات المسلحة الأنغولية (-الفورمالين الخل من الكحول) ومعالجتها مع نقطة مجفف الحرجة (CPD) لم يظهر انهارت الجدران الخلوية أو أجهزة مشوهة. هذه النتائج هي حاسمة لإعادة إعمار تنمية الأزهار. إجراءات مماثلة على أساس وثيقة البرنامج القطري لعينات من microenvironments الرطبة، مثل الخراجات طلائعيات بيضية الثابتة غلوتارالدهيد، هو الأمثل لاختبار النمو المتفاوت للخصائص التشخيصية (على سبيل المثال، العمود الفقري الكيس) على أنواع مختلفة من سوbstrates. وتجنب تدمير خلايا ممرضة تعلق على جراثيم الفطريات بعد الإماهة، والجفاف، ومعاملة CPD، خطوة مهمة لمزيد من الدراسات الفنية لهذه الخلايا.

البروتوكولات بالتفصيل هنا تمثل منخفضة التكلفة وبدائل سريعة لاقتناء صور ذات نوعية جيدة لإعادة بناء عمليات النمو ودراسة الخصائص التشخيصية.

Introduction

في علم الأحياء، وقد تم تمديد استخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) للدراسات التطور الهيكلي، مورفولوجيا المقارن، تطوير الجهاز، وتوصيف السكان أو الأنواع 1. مع عرض ثنائي الأبعاد للهياكل مجهرية، مجالات مثل micromorphology والنظاميات استفادت من التقدم تقنية ووزارة شؤون المرأة منذ النصف الثاني من القرن التاسع 20. على سبيل المثال، فإن إدخال منهجية تفل طلاء في 1970s الملاحظات الممكنة من المواد الحساسة مثل قمم تبادل لاطلاق النار والزهور تعزيز التصوير من الأنسجة غير موصل 2 و 3. يستخدم SEM الالكترونات طرد من سطح العينة لإنتاج التضاريس في بيئة عالية فراغ 4.

وتركز الدراسات التي تنطوي على ووزارة شؤون المرأة في كل من الاستدلال من الشخصيات الهيكلية وإعادة بناء growtعمليات ح. وقد تم اكتشاف الشخصيات الهيكلية الجديدة ذات الصلة لتصنيف والنظاميات من مجموعة واسعة من الكائنات الحية من الملاحظات ووزارة شؤون المرأة. على سبيل المثال، والصفات النباتية المستخدمة لتشخيص أنواع أو تصنيفات supraspecific، مثل حفر vestured من الخشب 5 والتنوع وصمة عار 6، الرحيقية والأزهار التشكل 7 و 8 و تفاصيل شعري الشكل 9، وحبوب اللقاح 10، 11، لا يمكن تصور بشكل صحيح من دون ووزارة شؤون المرأة. وقد تحققت الملاحظات ناجحة مع SEM التقليدية أيضا لفترة طويلة الكائنات الثابتة الفورمالين 12 و معشبة النباتات. نماذج 13.

من ناحية أخرى، ودراسات إعادة بناء عمليات النمو باستخدام SEM تشمل مجموعة واسعة من المواضيع، مثل تطوير الجهاز 14، infections الناجم عن البكتيريا 15، مصنع الجذر علم وظائف الأعضاء 16 وآليات مرفق الطفيلي المضيف 17 و 18 و آثار المخدرات على الطفيليات 19، mycoparasitism وتضاد 20 و 21 و تشوه نمو 22، والتنمية المقارنة من الأفراد البرية ومتحولة 23، ودورة حياة كاملة 24. على الرغم من أن المجاهر المسح البيئي الإلكترون (ESEM) 25 قد يكون من المزايا الهامة لمراقبة العينات البيولوجية الرطب في عمليات النمو والمواد الحساسة ربما لا يزال خطر حتى في حالة انخفاض فراغ من ESEM)، وتحتاج إلى معالجتها على نحو كاف لتجنب فقدان الملاحظة المورفولوجية للقيمة.

في هذه الورقة، ومراجعة بروتوكولات محددة لمراقبة SEM من ثلاث فرقيتم تقديم أنواع erent العينات: الخلايا الإنشائية الأزهار، الفطريات البيضية (الرمية)، والمواد الفطرية. هذه البروتوكولات ترجمة تجربة دراساتنا السابقة استنادا SEM-26، 27، 28، 29، 30، 31، 32، 33، حيث تم العثور على صعوبات محددة والحلول البديلة. في حالة محطة التنموية المقارن والدراسات الهيكلية، بدأ استخدام SEM في 1970s 34 و 35، ومنذ ذلك الحين، اكتشف الباحثون أن بعض ميزات الزهور هي أكثر عطوب مما كان يعتقد سابقا 36. إعادة الإعمار للتنمية الأزهار ينطوي على الاستيلاء على جميع مراحل بين الخلايا الإنشائية الأزهار الشباب وanthesis. للوصول إلى هذا الهدف، فمن ESSEntial إلى أن تضاريس العينة وسلامة جدار الخلية وعدم المساس بعد تثبيت والجفاف لاحق. الخلايا الإنشائية الأزهار الشباب معرضة بشكل خاص لانهيار جدار الخلية (أرقام 1A، 1B). وبالمثل، الهياكل الحساسة مثل الرحيق، بتلات، الوصمات ومباغات تتطلب بروتوكولات فعالة وغير ضارة. يلخص هذا الاستعراض بروتوكول الأمثل للحفاظ على الأنسجة الشباب وحساسة سليمة للتصوير ووزارة شؤون المرأة.

في حالة الفطريات البيضية (Stramenopiles) وهي إحدى المجموعات الأكثر تنوعا وانتشارا من الطفيليات، مع المضيفين تتراوح بين الميكروبات والنباتات لاللافقاريات والفقاريات 37 - هناك جراثيم التي تنمو وتتطور في بيئة رطبة. وتمثل هذه الحالة تحديا للمراقبة ووزارة شؤون المرأة لأن الجراثيم تحتاج الركيزة المناسبة ليست مناسبة للبروتوكولات ووزارة شؤون المرأة القياسية. بين الفطريات البيضية، نوعا من الرمية ذات أهمية خاصة لأنها كاليفورنيان تسبب تخفيضات حادة في aquacultures ومصائد الأسماك، وأعداد البرمائيات 38. خصائص Micromorphological، مثل العمود الفقري مدمن مخدرات الخراجات، وقد وجد أن تكون مفيدة لتحديد الأنواع من الرمية، وهو أمر أساسي لوضع ضوابط العدوى والعلاجات المحتملة 39. هنا، هناك بروتوكول تجريبي لمقارنة أنماط نمو العمود الفقري من الخراجات على ركائز المختلفة والتعامل مع عينة لإعداد حاسم مجفف نقطة (CPD) والملاحظة ووزارة شؤون المرأة لاحقة.

وفي حالة ثالثة، وهناك نتائج مثيرة للاهتمام التي ظهرت بعد عملية تفتيش للأبواغ الفطريات Phellorinia herculanea و. و النجمية. نوفا (غاريقونيات) 31. جنبا إلى جنب مع الجراثيم، تم تحديد مجموعة من الخلايا الحضانة غير متوقعة تحت SEM. مع البروتوكولات التقليدية السابقة، والمواد غير المعالجة، وجاء الخلايا الممرضة أوور انهارت تماما (الشكل 1C). مزيد من استنتاجات حول معينة الأنسجة المرتبطة الجراثيم ويمكن إجراء مع تعديلات بسيطة ولكنها حاسمة لنهج قياسية الموصوفة هنا (1D الشكل).

في هذا الاستعراض، وهناك بروتوكولات وإجراءات تفصيلية SEM التي يمكن استخدامها للتعامل مع مختلف المشاكل المرتبطة الملاحظة ووزارة شؤون المرأة في كاسيات البذور، الفطريات البيضية، وغاريقونيات، مثل انهيار الخلايا وتقلص الأنسجة بارضي والنمو غير الأمثل في العمود الفقري الكيس، وتدمير الأنسجة سريعة الزوال، على التوالي.

figure-introduction-6215
الشكل 1: مقارنة بين عينات علاجها بدون (أ، ج) ومع (ب، د) البروتوكول FAA الإيثانول-CPD. (أ - ب) براعم الزهور من Anacyclus المقرعية، منتصف التنمية. برعم تعامل مع رباعي أكسيد الأوزميوم 46 </ sup> في (أ) و برعم تعامل مع بروتوكول FAA-CPD (ب). (ج - د) ممرضة الخلايا مع أبواغ Phellorinia herculanea و. النجمية. المجففة عينات من دون أي علاج (ج) ومع بروتوكول صفها هنا لغاريقونيات (د). الجراثيم في البرتقال. المقاييس: (أ ب) 100 ميكرون، (CD) 50 ميكرون. تم التقاط الصور بواسطة Y. رويز-ليون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Protocol

ملاحظة: يتضمن هذا البروتوكول ستة أقسام رئيسية، ثلاثة المكرسة للكائنات محددة (الأقسام 1-3)، وثلاث واصفا إجراءات مشتركة بين جميع (4-6). النجمة (*) تشير إلى الخطوات تعديلها من قبل المجربون.

1. دراسات الدول النامية وتشكلت بالكامل هياكل النبات

  1. جمع والتثبيت
    1. إذا تم جمع المواد النباتية في مكان اللواتي لا يحصلن على خزانة الدخان، وإدخال وتزج المواد في 70٪ من الإيثانول في أنابيب الطرد المركزي. من الناحية المثالية، تزج المواد بعد 48 ساعة في القوات المسلحة الأنغولية (الخطوات 1.1.1-1.1.3) لتجنب الجفاف المفرط في الإيثانول. إذا خزانة الدخان يمكن الوصول إلى المواد النباتية، تجاهل هذه الخطوة ومتابعة مع 1.1.1.
    2. إعداد تثبيتي-الفورمالين الخليك من الكحول (FAA) في خزانة الدخان مزودة مرشح ألدهيد. إضافة 85 أجزاء من الإيثانول التشويه والتحريف 70٪، و 10 أجزاء من 60٪ محلول الفورمالديهايد، و 5 أجزاء من حامض الخليك الجليدي. إعداد FAAقبل تحديد المواد، والتخزين على المدى الطويل وليس من المستحسن 40.
    3. تحت خزانة الدخان، صب الأسهم للقوات المسلحة الأنغولية في الفردي الفم واسعة والزجاجات البلاستيكية مانعة للتسرب. استخدام العديد من زجاجات كما أن هناك عينات متوفرة، وإنشاء بطاقات لتحديد العينة.
    4. حدد الخلايا الإنشائية الأزهار أو الخضري لإصلاح، والتأكد من أنها غير متضررة من الحشرات والفطريات، أو الظروف الجوية القاسية. قطع الفروع، وإزالة المواد غير المرغوب فيها، وإيداع عينة فورا في حل القوات المسلحة الأنغولية.
    5. بعد 72-96 ساعة، صب FAA في وعاء من البلاستيك للتخلص من المواد الكيميائية. على الفور، وغسل العينات ثلاث مرات مع الطازجة 70٪ من الإيثانول لإزالة أي FAA المتبقية. المواد الثابتة يمكن تخزينها لأجل غير مسمى في 70٪ من الإيثانول.
  2. تشريح والجفاف
    1. تشريح المواد الثابتة في 70٪ من الإيثانول تحت مجهر تشريحي باستخدام الملقط غرامة فائقة، شمال شرقedles، ملقط، وفرش، والمشارط الدقيقة (يجب أن يكون الحد الأقصى لحجم الأنسجة المحيطة 1 سم 3، أو 2 سم للمواد مسطحة). تشريح عينات في طبق بيتري مغطاة الإيثانول لمنع الأنسجة من التجفيف. استخدام طبق بتري مع قاعدة مغطاة السيليكون الأسود الجاف لرؤية أفضل الأنسجة البيضاء المتناقضة.
    2. وضع مادة تشريح في حاويات عينة للحرج مجفف نقطة (CPD، الشكل 2A). عند هذه النقطة، تزج حاويات في طبق بيتري مع 70٪ من الإيثانول، وتشمل بطاقات هوية العينة (مع ورقة وقلم رصاص). لتجفيف أكثر فعالية لمزيد من التلاعب، وتجنب خلط العينات شابة وناضجة في نفس الحاوية. *
    3. وضع أغطية على الحاويات وإيداعها في أنابيب الطرد المركزي البلاستيكية التي تحتوي على الكثير من الايثانول 70٪. تخزين الأنابيب بين عشية وضحاها إذا لم يتم معالجة المواد فورا.
    4. نقل المواد تشريح من خلال سلسلة الإيثانول التاليةالصورة في الجرار المحكم أو أنابيب الطرد المركزي: 70٪، 90٪، 100٪، و 100٪. ترك العينات في كل حل لمدة 1 ساعة على الأقل. الحفاظ على عينات بين عشية وضحاها في حل الإيثانول بنسبة 100٪.
    5. نقل الحاويات مع المواد وثيقة البرنامج القطري (القسم 4).
  3. تركيب وإعداد الأنسجة النباتية لمراقبة SEM
    1. كتابة رقم تعريف العينة تحت أصحاب عينة SEM (أي بذرة الألومنيوم). تغطية الجزء العلوي من بذرة مع الشريط على الوجهين. وضع بذرة إلى حامل العينة (الشكل 2B).
    2. تحت مجهر تشريحي، فتح بعناية الحاويات التي تحمل عينات من الشباب وحساسة المجففة بالفعل في وثيقة البرنامج القطري. نضع في اعتبارنا أن بعد العلاج وثيقة البرنامج القطري، وعينات تصبح أخف وزنا وحساسة إلى الكهرباء الساكنة. إغلاق الحاويات مرة واحدة وقد تم أخذ عينات من لتجنب الغبار أو الشوائب.
    3. وضع العينات على سطح لزجة من بذرة، التخطيط للمستقبل المنشودموقف (مرة واحدة العينات تلمس السطح، فمن الصعب جدا إزالتها). لا تحاول أن تحمل تشريح الرئيسي عند هذه النقطة. فقط إزالة الأنسجة غير المرغوب فيها التي هي سهلة لالتقاط. للدراسات palynological، تشريح anthers وفتحها للكشف عن حبوب اللقاح على بذرة.
    4. عينات طويلة وضع (على سبيل المثال، 2 سم) مثل النورات في وضع أفقي. عندما يكون ذلك ممكنا، عينات توجيه من نفس هيكل القطبي، والجانب، ووجهات النظر أسفل. ترك مساحة كافية بين العينات على كعب.
    5. إذا لا يمكن معالجة عينات على الفور، والحفاظ على المحمية بين عشية وضحاها في وعاء المحكم مع هلام السيليكا لتجنب الإماهة (الشكل 2C) *. معطف العينات باستخدام المغطي تفل ونقلها إلى وزارة شؤون المرأة (أقسام 5 و 6).

figure-protocol-5264
الشكل 2: أدوات manipulati عينةعلى والتجهيز قبل الملاحظة ووزارة شؤون المرأة. (أ) حاوية عينة من صنع الصلب مع الجدران محاصرين لتبادل الإيثانول / CO 2 في غرفة وثيقة البرنامج القطري. (ب) بذرة الصلب داخل حامل عينة من البلاستيك. حاوية (ج) الزجاجية المستخدمة للحفاظ على عينات حمايتها من الرطوبة والغبار. في الأساس، هناك حجرة للهلام السيليكا. (د) الحرجة نقطة الصحون. في الجبهة، وهناك (من اليسار إلى اليمين) مقياس ضغط الدم، ومفتاح الطاقة، ونظام التحكم في درجة الحرارة، وعرض درجة الحرارة. ضغط العمل المعتاد لCO 2 -ethanol تبادل 60 البارات (800 رطل). في الجزء العلوي، وهناك أربعة صمامات (الضوابط مدخل، واستنزاف، والتهوية، والعادم) المرافقة حجرة العينة المركزية. تم التقاط الصور بواسطة Y. رويز-ليون وMA بيلو. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

< ص الطبقة = "jove_title"> 2. دراسة سلوك الكيس من الرمية (الفطريات البيضية) على السطوح المختلفة

  1. النمو وتحديد الخراجات
    1. إعداد ببتون والجلوكوز (PG-ل) وسائل الإعلام 41 باستخدام D - (+) - الجلوكوز (6 ز) وببتون الفطريات (3 غرام) *. تضيف ما يصل الى 900 مل من ماء الصنبور وتعقيم 40 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية. صب 50 مل من تعقيمها قبل حل ألف (ناه 2 ص 4، 0.13 م) و 50 مل من محلول ب (نا 2 هبو 4، 0.13 م).
    2. من ثقافات الأسهم من سلالات طفيلي المنشأ الرمية الحفاظ على ببتون والجلوكوز وسائل الإعلام أجار (PGA، الذي يعد كما PG-لتر ولكن بإضافة 10 غراما من أجار البكتريولوجية الأوروبي إلى الجلوكوز وببتون قبل الأوتوكلاف)، وتنمو المستعمرات فطر في 0.5 مل قطرات PG-لتر لمدة 24-48 ساعة عند 20 درجة مئوية في أطباق بتري. حمل تبوغ بغسل فطر مع مياه الحنفية تعقيمها ثلاث مرات وتفرخ لهم لمدة 15 ساعة عند 20 ° C= "XREF"> 42، 43.
    3. جمع الأبواغ الحيوانية السابحة الثانوية الصادرة عن pipetting بلطف على الجزء العلوي من تعليق وتجميع لهم في 1 مل أجزاء. تستنهض الهمم بقوة الأبواغ الحيوانية السابحة لمدة 30 ثانية قبل vortexing لإنتاج الأكياس الثانوية 44.
    4. لاختبار النمو التفاضلي من العمود الفقري من الخراجات، على منفصلة أطباق بتري (P60)، وطرح 0.5 مل من تعليق الكيس الثانوي على السطوح المختلفة (على سبيل المثال، والكربون، وشبكات الذهب، والنحاس تيم، سمك السلمون والسمك النازلي المقاييس (سابقا ابيض)، وغطاء زجاجي زلات) *. احتضان الخراجات عند 20 درجة مئوية لمدة 70 دقيقة، والتي تفضل المرفق من الخراجات على السطح.
    5. إزالة السائل وإضافة 0.5 مل من 2٪ غلوتارالدهيد على كل سطح لتثبيت الخراجات. الحفاظ على العينات في درجة حرارة الغرفة تحت خزانة الدخان لمدة 1 ساعة.
    6. إزالة غلوتارالدهيد ويذوى العينة من خلال سلسلة الايثانول (30٪، 40٪، 50٪، 60٪، 70٪، 80٪ ، 90٪، 100٪، و 100٪)، مشيرا 5 مل من كل حل الإيثانول لمدة 15 دقيقة. مرة واحدة في الماضي حل الإيثانول بنسبة 100٪، وعينة يمكن تخزينها لمدة تصل الى شهر واحد في طبق بتري مختومة. في هذه المرحلة، وعينات جاهزة للالمجففة في وثيقة البرنامج القطري.
    7. نقل بعناية شبكات وجداول من طبق بيتري لحامل مناسبة لوثيقة البرنامج القطري (القسم 4). لهذه الخطوة، واستخدام حامل وثيقة البرنامج القطري الشبكة أو حامل العينة التراص، والتي تبقي عينات فصلها عن بعضها البعض. خذ الشبكات والمقاييس مع ملاقط، مع الأخذ في الاعتبار أن الخراجات يجب أن تواجه حتى على الشبكات في كل وقت. *
  2. تركيب وإعداد العينات كيس للمراقبة SEM
    1. تركيب شبكات وجداول على بذرة الألومنيوم التي تم تغطيتها في وقت سابق مع وجهين الشريط الكربون وصفت تحتها.
    2. نقل العينات إلى المغطي تفل (القسم 5).
    3. مراقبة العينات تحت SEM (المادة 6).

= "jove_title"> 3. دراسة المعشبة الفطرية الجراثيم من herculanea Phellorinia تحت SEM

  1. الإماهة والجفاف من الجراثيم
    1. التفاف كل عينة بعناية مع ورق الترشيح، وتشكيل المغلفات التي تحمل علامات قلم رصاص ~ 0.5-1 سم 2، مع الحرص على عدم التضييق عليهم. ختم ورقة الترشيح مع مشابك الورق. نقل العينات معبأة في طبق بتري وتزج بهم في 10 مل من الماء لترطيب الأنسجة المحيطة الجراثيم.
    2. فورا العينات في الميكروويف (600 واط لحوالي 20 ثانية). إزالة المواد بمجرد أن يبدأ الماء بالتبخر، واتركه حتى يبرد في درجة حرارة الغرفة.
    3. تمرير عينات من خلال سلسلة الإيثانول التالية: 30٪، 50٪، 70٪، 80٪، 90٪، 95٪، 100٪، و 100٪. اعتمادا على كمية من العينات، استخدام كوب أو الطرد المركزي أنابيب لهذه الخطوة. ترك العينات لمدة 15 دقيقة في كل حل.
    4. وضع العينات في وثيقة البرنامج القطري (القسم 4).
  2. التركيب و عيصلح الجراثيم للمراقبة SEM
    1. فتح المظاريف. صب جراثيم على كعب معدة مسبقا مع الشريط على الوجهين. بدلا من ذلك، جمع الجراثيم مع سطح لزجة من بذرة، مع الحرص على عدم التضييق عليهم *.
    2. إذا كانت العينات تحتوي على عدد قليل من الجراثيم، بالإضافة إلى الخطوة السابقة، وقطع قطعة صغيرة من المغلف (~ 1 مم 2) ووضعه على كعب * جديد.
    3. وضع الأنسجة في المغطي تفل (القسم 5).
    4. مراقبة تحت SEM (المادة 6).

4. تجفيف المواد عن طريق نقطة مجفف الحرجة (CPD، الشكل 2D)

  1. استخدام وثيقة البرنامج القطري في منطقة جيدة التهوية وتحقق من أن يتم إغلاق كافة الصمامات من الجهاز. معرفة ما اذا كان غرفة عينة فارغة ونظيفة.
  2. التبديل على الجهاز والتحقق من أن اختبار نظام التحكم في درجة الحرارة يحدث تلقائيا. إذا كان لدى CPD نظام التبريد حمام خارجي، والتحقق من مستويات المياه قبل ان ينتقل طر على.
  3. اتبع إرشادات الشركة المصنعة للCPD محددة تستخدم للإيثانول وثاني أكسيد الكربون 2 التبادل. للسلامة، وحمل على هذه الخطوة تحت إشراف شخص تدرب على استخدام الجهاز. تذكر أنه يتعرض لتغيرات الضغط السريع، يمكن ان تهب بعنف.
  4. إخراج العينات وتابع الخطوة 1.3 إذا كان يعمل مع الأنسجة النباتية، خطوة 2.2 إذا كان يعمل مع الفطريات البيضية الخراجات، والخطوات 3.2 إذا كان يعمل مع جراثيم الفطريات.

5. طلاء العينات مع الذهب باستخدام تفل المغطي (الشكل 3A)

  1. تحقق من المغطي تفل. تحقق من أن الهدف الذهب الكاثود هو في حالة جيدة. استخدم قطعة قماش خالية من الوبر منقوع مع 90٪ من الإيثانول لتنظيف الجدران من فراغ الغرفة وغطاء غرفة إذا لزم الأمر.
  2. بمناسبة حامل تفل مع الأرقام بجانب كل ثقب كعب لمزيد من التعرف على العينات تحت المجهر. بعناية، وضع بذرة محملة sampl الدراسيوفاق وتأمينها. استخدام مرحلة عينة الكواكب الدوارة لضمان طلاء موحد على عينات مع الأسطح غير المنتظمة.
  3. اتبع إرشادات الشركة المصنعة لضبط إعدادات مثل المسافة العمل، عملية ضغط الغاز (على سبيل المثال، 5 × 10 -1 - 7 × 10 -1 م بار) (على سبيل المثال، 30 مم)، وهي المرة الاخرق (على سبيل المثال، 50 ق)، سمك طبقة الذهب (على سبيل المثال، 12 نانومتر) الحالي (على سبيل المثال، 15 أمبير) وامدادات التيار الكهربائي (على سبيل المثال، 600 V) 45.
  4. إزالة بذرة ونقلهم الى وزارة شؤون المرأة (المادة 6). بدلا من ذلك، وضع بذرة في حاوية مغلقة مع هلام السيليكا (الشكل 2C).

figure-protocol-14002
الشكل (3): تفل المغطي (أ) والمجهر الإلكتروني الماسح (ب). (أ) جبهة نظرا للفراغ الغرفة (يسار)، valv الغازه، وتوقيت، فراغ، والضوابط الحالية. (ب) الجانب الشخصي من المكونات الرئيسية SEM (من اليسار إلى اليمين): العمود فراغ مع حجرة العينة، شاشة الكمبيوتر مع الضوابط، ورصد للغرفة. تم التقاط الصور بواسطة Y. رويز-ليون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

6. مراقبة تحت مجهر المسح الإلكتروني (SEM، الشكل 3B)

  1. SEM بدء
    1. اتبع إرشادات الشركة المصنعة لبدء وتعيين ووزارة شؤون المرأة، وتعديل ارتفاع عينة قطر فتحة موضوعي (على سبيل المثال، لمحطات 2 ميكرون والفطريات والفطريات البيضية 4 ميكرون)، والجهد التشغيل (على سبيل المثال، 15 كيلو فولت).
    2. التحقق من المحاذاة الصحيحة للنظام شعاع الإلكترون وتعيين محاذاة المحورية وstigmators وفقا لمصنعي المؤشرات. ضبط طنبعد انه يعمل من أجل الحصول على عمق كاف من الحقل.
  2. التقاط الصور
    1. الحصول على صورة مركزة من العينة واستخدامها كنقطة انطلاق. زيادة ختام التكبير إلى مستوى الحد الأقصى وتركيز الصورة مرة أخرى. اختيار المناطق مع عدم انتظام السطح مثل الثقوب. الاستجماتيزم الصحيح وضبط التباين والسطوع الأمثل.
    2. التقاط صورة SEM مع ذات الدقة العالية. استخدام جهاز كشف مرض جنون البقر إذا أظهرت الصورة التي يتم شحن العينات. وإلا، تعيين كاشف SE. تغيير كاشفات باتباع إرشادات الشركة المصنعة.

النتائج

الأزهار التنمية وتثبيت للوضع وتشكلت بالكامل هياكل النبات

باستخدام بروتوكول FAA-CPD الموصوفة هنا، الأنسجة النباتية شابة وناضجة وثابتة على النحو الأمثل والمجففة للتصوير ووزارة شؤون المرأة. عمليات...

Discussion

وفيما يتعلق البروتوكولات ووزارة شؤون المرأة القياسية، والإجراءات المعروضة هنا تشمل سريعة نسبيا، وسهلة لمتابعة، ومنهجيات منخفضة التكلفة. اعتمادا على كمية من العينات وعلى سهولة المعالجة، فإنه يأخذ 4-5 أيام للحصول على صور ذات جودة جيدة. بما في ذلك احتياطات السلامة الك?...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد لقي هذا المشروع بتمويل من البحث والابتكار برنامج الاتحاد الأوروبي أفق 2020 بموجب اتفاقية منحة رقم 634429. ويعكس هذا المنشور وجهات النظر فقط للمؤلف، والمفوضية الأوروبية لا يمكن أن يكون مسؤولا عن أي استخدام التي يمكن أن تكون مصنوعة من المعلومات الواردة فيه. ونحن نعترف أيضا المساهمة المالية التي قدمها ريال حديقة النباتية، CSIC. ريال عن امتنانه للاتحاد الأوروبي [إيتن-SAPRO-238550] لدعم أبحاثها في الرمية. نحن نريد أيضا أن أشكر فرانسيسكو كالونج لليرجى تقديم الصور herculanea Phellorinia وباء. بيويو لتجهيز العينات (الشكل 5). وقد تم نقل كل الصور من قبل الخدمة ووزارة شؤون المرأة في ريال حديقة النباتية، CSIC في مدريد.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidNo specific supplierSkin irritation, eye irritation
aluminium stubsTed Pella, Inc.16221www.tedpella.com
Centrifuge tubesNo specific supplier
Critical Point DryerPolaron Quatum TechnologiesCPD7501
D (+) GlucoseMerck1,083,421,000
Double sided sellotapeNo specific supplier
Ethanol absoluteNo specific supplier.Flammable
European bacteriological agarConda1800.00www.condalab.com
Filter paperNo specific supplier
ForcepsNo specific supplier
Formalin 4%No specific supplier.Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable
Glass cover slipsNo specific supplier
Glass hermetic container No specific supplier
Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611  (L)Dismadel S.L.3336www.dismadel.com
Mycological peptoneConda1922.00www.condalab.com
needlesNo specific supplier
Petri dishesNo specific supplier
Plastic containersNo specific supplier
Sample holder with lid  for the critical point dryer Ted Pella, Inc.4591www.tedpella.com
scalpelsNo specific supplier
Scanning Electron MicroscopeHitachiS3000N
Software for SEM
Solution A: NaH2PO4
Solution B: Na2HPO4
Specimen holdersNo specific supplier
Sputter coaterBalzersSCD 004
StereomicroscopeNo specific supplier
Transmission Electron Microscope (TEM) gridsElectron Microscopy SciencesG200 (Square Mesh)www.emsdiassum.com
TweezersNo specific supplier

References

  1. Endress, P. K., Baas, P., Gregory, M. Systematic plant morphology and anatomy: 50 years of progress. Taxon. 49 (3), 401-434 (2000).
  2. Falk, R. H., Gifford, E. M., Cutter, E. G. Scanning electron microscopy of developing plant organs. Science. 168 (3938), 1471-1474 (1970).
  3. Damblon, F. Sputtering, a new method of coating pollen grains in scanning electron microscopy. Grana. 15 (3), 137-144 (1975).
  4. Everhart, T. E., Thornley, R. F. M. Wide-band detector for micro-microampere low-energy electron currents. J. Sci. Instrum. 37 (7), 37246-37248 (1960).
  5. Collins, S. P., et al. Advantages of environmental scanning electron microscopy in studies of microorganisms. Microsc. Res. Techniq. 25 (5-6), 398-405 (1993).
  6. Fannes, W., Vanhove, M. P. M., Huyse, T., Paladini, G. A scanning electron microscope technique for studying the sclerites of Cichlidogyrus. Parasitol. Res. 114 (5), 2031-2034 (2015).
  7. Erbar, C., Leins, P. Portioned pollen release and the syndromes of secondary pollen presentation in the Campanulales-Asterales complex. Flora. 190 (4), 323-338 (1995).
  8. Jansen, S., Smets, E., Baas, P. Vestures in woody plants: a review. IAWA Journal. 19 (4), 347-382 (1998).
  9. Bortolin Costa, M. F., et al. Stigma diversity in tropical legumes with considerations on stigma classification. Bot. Rev. 80 (1), 1-29 (2014).
  10. Almeida, O. J. G., Cota-Sánchez, J. H., Paoli, A. A. S. The systematic significance of floral morphology, nectaries, and nectar concentration in epiphytic cacti of tribes Hylocereeae and Rhipsalideae (Cactaceae). Perspect. Plant Ecol. 15 (5), 255-268 (2013).
  11. Konarska, A. Comparison of the structure of floral nectaries in two Euonymus L. species (Celastraceae). Protoplasma. 252 (3), 901-910 (2015).
  12. Giuliani, C., Maleci Bini, L. Insight into the structure and chemistry of glandular trichomes of Labiatae, with emphasis on subfamily Lamioideae. Plant Syst. Evol. 276 (3-4), 199-208 (2008).
  13. Li, K., Zheng, B., Wang, Y., Zhou, L. L.Breeding system and pollination biology of Paeonia delavayi (Paeoniaceae), an endangered plant in the Southwest of China. Pak. J. Bot. 46 (5), 1631-1642 (2014).
  14. García, L., Rivero, M., Droppelmann, F. Descripción morfológica y viabilidad del polen de Nothofagus nervosa (Nothofagaceae). Bosque. 36 (3), 487-496 (2015).
  15. Prenner, G., Klitgaard, B. B. Towards unlocking the deep nodes of Leguminosae: floral development and morphology of the enigmatic Duparquetia orchidacea (Leguminosae, Caesalpinioideae). Am. J. Bot. 95 (11), 1349-1365 (2008).
  16. Ratnayake, K., Joyce, D. C., Webb, R. I. A convenient sample preparation protocol for scanning electron microscope examination of xylem-occluding bacterial biofilm on cut flowers and foliage. Sci. Hortic-Amsterdam. 140 (1), 12-18 (2012).
  17. Çolak, G., Celalettin Baykul, M., Gürler, R., Çatak, E., Caner, N. Investigation of the effects of aluminium stress on some macro and micro-nutrient contents of the seedlings of Lycopersicon esculentum Mill. by using scanning electron microscope. Pak. J. Bot. 46 (1), 147-160 (2014).
  18. Arafa, S. Z. Scanning electron microscope observations on the monogenean parasite Paraquadriacanthus nasalis from the nasal cavities of the freshwater fish Clarias gariepinus in Egypt with a note on some surface features of its microhabitat. Parasitol. Res. 110 (5), 1687-1693 (2012).
  19. Uppalapatia, S. R., Kerwinb, J. L., Fujitac, Y. Epifluorescence and scanning electron microscopy of host-pathogen interactions between Pythium porphyrae (Peronosporales, Oomycota)and Porphyra yezoensis (Bangiales, Rhodophyta). Bot. Mar. 44 (2), 139-145 (2001).
  20. Meaney, M., Haughey, S., Brennan, G. P., Fairweather, I. A scanning electron microscope study on the route of entry of clorsulon into the liver fluke, Fasciola hepatica. Parasitol. Res. 95 (2), 117-128 (2005).
  21. Sundarasekar, J., Sahgal, G., Subramaniam, S. Anti-candida activity by Hymenocallis littoralis extracts for opportunistic oral and genital infection Candida albicans. Bangladesh J. Pharmacol. 7 (3), 211-216 (2012).
  22. Benhamou, N., Rey, P., Picard, K., Tirilly, Y. Ultrastructural and cytochemical aspects of the interaction between the mycoparasite Pythium oligandrum and soilborne plant pathogens. Phytopathology. 89 (6), 506-517 (1999).
  23. Singh, A., et al. First evidence of putrescine involvement in mitigating the floral malformation in mangoes: A scanning electron microscope study. Protoplasma. 251 (5), 1255-1261 (2014).
  24. Xiang, C., et al. Fine mapping of a palea defective 1 (pd1), a locus associated with palea and stamen development in rice. Plant Cell Rep. 34 (12), 2151-2159 (2015).
  25. Mendoza, L., Hernandez, F., Ajello, L. Life cycle of the human and animal oomycete pathogen Pythium insidiosum. J. Clin. Microbiol. 31 (11), 2967-2973 (1993).
  26. Bello, M. A., Rudall, P. J., González, F., Fernández, J. L. Floral morphology and development in Aragoa (Plantaginaceae) andrelated members of the order Lamiales. Int. J. Plant Sci. 165 (5), 723-738 (2004).
  27. Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral morphology and development in Quillajaceae and Surianaceae (Fabales), the species-poor relatives of Leguminosae and Polygalaceae. Ann. Bot. 100 (4), 1491-1505 (2007).
  28. Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral ontogeny in Polygalaceae and its bearing on the homologies of keeled flowers in Fabales. Int. J. Plant Sci. 171 (5), 482-498 (2010).
  29. Bello, M. A., Alvarez, I., Torices, R., Fuertes-Aguilar, J. Floral development and evolution of capitulum structure in Anacyclus (Anthemideae, Asteraceae). Ann. Bot. 112 (8), 1597-1612 (2013).
  30. Bello, M. A., Martínez-Asperilla, A., Fuertes-Aguilar, J. Floral development of Lavatera trimestris and Malva hispanica reveals the nature of the epicalyx in the Malva generic alliance. Bot. J. Linn. Soc. 181 (1), 84-98 (2016).
  31. Calonge, F. D., Martínez, A. J., Falcó, I., Samper, L. E. Phellorinia herculanea f. stellata f. nova encontrada en España. Bol. Soc. Micol.Madrid. 35 (1), 65-70 (2011).
  32. Liu, Y., et al. Deciphering microbial landscapes of fish eggs to mitigate emerging diseases. ISME J. 8 (10), 2002-2014 (2014).
  33. Sandoval-Sierra, J. V., Diéguez-Uribeondo, J. A comprehensive protocol for improving the description of Saprolegniales (Oomycota): two practical examples (Saprolegnia aenigmatica sp. nov. and Saprolegnia racemosa sp. nov.). PLOS one. , (2015).
  34. Endress, P. K. Zur vergleichenden Entwicklungsmorphologie, Embryologie und Systematik bei Laurales. Bot. Jahrb. Syst. 92 (2), 331-428 (1972).
  35. Tucker, S. Floral development in Saururus cernuus (Saururaceae):1. Floral initiation and stamen development. Am. J. Bot. 62 (3), 993-1005 (1975).
  36. Endress, P. K., Matthews, M. L. Progress and problems in the assessment of flower morphology in higher-level systematics. Plant Syst. Evol. 298 (2), 257-276 (2012).
  37. Beakes, G. W., Glockling, S. L., Sekimoto, S. The evolutionary phylogeny of the oomycete "fungi". Protoplasma. 249 (1), 3-19 (2012).
  38. Romansic, J. M., et al. Effects of the pathogenic water mold Saprolegnia ferax on survival of amphibian larvae. Dis. Aquat. Organ. 83 (3), 187-193 (2009).
  39. van West, P. Saprolegnia parasitica, an oomycete pathogen with a fishy appetite: new challengues for an old problem. Mycologist. 20 (3), 99-104 (2006).
  40. Johansen, D. A. . Plant microtechnique. , (1940).
  41. Unestam, T. Studies on the crayfish plague fungus Aphanomyces astaci. Some factors affecting growth in vitro. Physiol. Plantarum. 18 (2), 483-505 (1965).
  42. Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence from isolated spore cysts of Aphanomyces astaci. Exp. Mycol. 8 (4), 370-377 (1984).
  43. Diéguez-Uribeondo, J., Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence in Saprolegnia parasitica. Mycol. Res. 98 (7), 810-815 (1994).
  44. Söderhäll, K., Svensson, E., Unestam, T. Chitinase and protease activities in germinating zoospore cysts of a parasitic fungus, Aphanomyces astaci, Oomycetes. Mycopathologia. 64 (1), 9-11 (1978).
  45. Echlin, P. . Handbook of sample preparation for scanning electron microscopy and X-Ray Microanalysis. , (2009).
  46. Osumi, M., et al. Preparation for observation of fine structure of biological specimens by high-resolution SEM. Microscopy. 32 (4), 321-330 (1983).
  47. Rezinciuc, S. . The Saprolegniales morpho-molecular puzzle: an insight into markers identifying specific and subspecific levels in main parasites. , (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

120 Phellorinia

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved