Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Protocolos para a Problemática da planta, oomiceto e amostras fúngicas

Resumo

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Resumo

Os problemas mais comuns no processamento de amostras biológicas para observações ao microscópio eletrônico de varredura (MEV) incluem colapso das células, o tratamento de amostras de microambientes molhadas e destruição celular. Utilizando tecidos jovens florais, cistos oomicetos e esporos de fungos (Agaricales) como exemplos, protocolos específicos para processar amostras delicadas são descritos aqui que superar alguns dos principais desafios no tratamento da amostra para a captura de imagem sob o SEM.

meristemas florais fixos com FAA (formalina-acético-Álcool) e processados ​​com o Ponto Crítico Secador (CPD) não apresentaram colapso paredes celulares ou órgãos distorcidas. Estes resultados são cruciais para a reconstrução do desenvolvimento floral. Um tratamento à base de CPD semelhante de amostras de micro-ambientes molhados, tais como os cistos oomicetos fixadas com glutaraldeído, é ideal para testar o crescimento diferencial de características de diagnóstico (por exemplo, os espinhos de quisto) em diferentes tipos de substrates. A destruição das células ligadas a enfermeira esporos de fungos foi evitada após re-hidratação, desidratação, e o tratamento de CPD, um passo importante para mais estudos funcionais destas células.

Os protocolos detalhados aqui representam de baixo custo e alternativas rápidas para a aquisição de imagens de boa qualidade para reconstruir os processos de crescimento e estudar características de diagnóstico.

Introdução

Na biologia, o uso de microscopia eletrônica de varredura (SEM) foi estendido para estudos de evolução estrutural, a morfologia comparativa, o desenvolvimento de órgãos, e caracterização de populações ou espécies ^1. Com a sua visão bidimensional de estruturas microscópicas, áreas como a micromorfologia e sistemática lucrado com SEM técnica avanços desde a segunda metade do século ^20. Por exemplo, a introdução da metodologia de revestimento por pulverização na década de 1970 fez eventuais observações de materiais delicados, como ápices vegetativos e flores que reforcem a imagem de tecidos não condutores ^{2, 3.} SEM utiliza electrões ejectados a partir da superfície do espécime de reproduzir a topografia num ambiente de alto vácuo ^4.

Estudos envolvendo SEM estão focados tanto a inferência de caracteres estruturais ea reconstrução da growth processos. Novos personagens estruturais relevantes para a taxonomia e sistemática de uma vasta gama de organismos foram descobertos a partir de observações SEM. Por exemplo, características de plantas utilizado para o diagnóstico espécie ou classificações supraspecific, como os poços guarnecidas de madeira _{^5, o} estigma diversidade ^6, nectary e floral morfologia ^{7, 8,} detalhes de tricomas ^9, e grãos de pólen ^{10, 11,} pode não ser corretamente visualizadas sem SEM. Observações de sucesso com SEM convencional também foram atingidos por longa data organismos fixados em formol ¹² e herbário espécimes de plantas ^13.

Por outro lado, os estudos de reconstrução dos processos de crescimento utilizando SEM envolve uma ampla gama de tópicos, tais como o desenvolvimento de órgãos ^14, INFECÇÕES induzidas por bactérias ^15, planta raiz fisiologia ^16, os mecanismos de fixação parasita-hospedeiro ^{17, 18,} efeitos de drogas sobre parasitas ^19, micoparasitismo e antibiose ^{20, 21,} o crescimento malformação ^22, de desenvolvimento comparativa de indivíduos selvagens e mutantes ^23, e ciclos de vida inteiras ^24. Embora microscópios electrónicos de varrimento ambiental (ESEM) ²⁵ pode ter vantagens importantes para a observação de amostras biológicas molhado em processos de crescimento, material delicado ainda pode ser comprometida mesmo na condição de baixo vácuo do ESEM), e têm de ser processados de forma adequada para evitar a perda observação morfológica de valioso.

Neste artigo, uma revisão de protocolos específicos para a observação SEM de três different tipos de amostras é apresentada: meristemas florais, oomicetos (Saprolegnia), e material fúngico. Estes protocolos compilar a experiência de nossos estudos anteriores baseados em SEM ^{26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,} onde as dificuldades específicas e soluções alternativas foram encontrados. No caso de uma instalação de desenvolvimento comparativa e estudos estruturais, a utilização de SEM começou na década de 1970 ^{34, 35,} e desde então, os pesquisadores descobriram que certas características florais são mais instáveis do que se pensava ^36. Reconstrução do desenvolvimento floral envolve a captura de todas as fases entre jovens meristemas florais e antese. Para alcançar este objectivo, é ESSEntial que a topografia da amostra e da integridade da parede celular não sejam comprometidas após a fixação e a desidratação subsequente. Meristemas florais jovens são particularmente vulneráveis ao colapso da parede celular (Figuras 1a, 1b). Da mesma forma, as estruturas delicadas como nectáreos, pétalas, estigmas e sporangia exigem protocolos eficazes e undamaging. Esta revisão resume um protocolo ideal para manter os tecidos jovens e delicadas intactas para geração de imagens SEM.

No caso dos oomicetos (Stramenopiles) -um dos grupos mais diversos e generalizadas de parasitas, com hospedeiros que variam de micróbios e plantas para os invertebrados e vertebrados ³⁷ - há esporos que crescem e se desenvolvem em um ambiente úmido. Esta condição representa um desafio para a observação SEM, porque os esporos precisam de um substrato adequado não é adequado para protocolos SEM padrão. Entre os oomicetos, espécies de Saprolegnia são de particular interesse porque eles can causar reduções graves no aquacultura, pesca e populações de anfíbios ^38. Características micromorfológicas, como os espinhos em forma de gancho de cistos, foram encontrados para ser útil para identificar espécies de Saprolegnia, que é fundamental para estabelecer controles de infecção e tratamentos potenciais ^39. Aqui, existe um protocolo experimental para comparar os padrões do crescimento da coluna de cistos em substratos diferentes e para manipular a amostra para a preparação crítica secador de ponto (CPD) e subsequente observação SEM.

Em um terceiro caso, há descobertas interessantes que surgiram depois de uma inspecção dos esporos dos fungos Phellorinia herculanea f. f stellata. nova (Agaricales) ^31. Juntamente com os esporos, um grupo de células berçário inesperados foi identificado sob o SEM. Com protocolos tradicionais anteriores e de matérias não tratadas, as células enfermeira veio UOt desmoronou completamente (Figura 1c). Mais inferências sobre tecidos específicos associados aos esporos podem ser feitas com as modificações simples, mas cruciais para as abordagens padrão descritos aqui (Figura 1D).

Nesta revisão, há protocolos detalhados SEM que podem ser usados ​​para lidar com diferentes problemas associados com a observação SEM em angiospermas, oomycetes e Agaricales, tais como o colapso celular e encolhimento tecido meristemático, o crescimento não-ideal de espinhos cisto, e destruição de tecidos efêmeras, respectivamente.

Figura 1: Comparação das amostras tratadas sem (A, C) e com (b, d) o protocolo FAA-etanol-CPD. (A - b) Os botões florais do Anacyclus Clavatus, mid-desenvolvimento. Bud tratada com tetróxido de ósmio ^{46 <}/ sup> (a) e Bud tratados com o protocolo FAA-CPD (b). (C - d) células enfermeira com esporos de Phellorinia herculanea f. stellata. As amostras secas, sem qualquer tratamento (C) e com o protocolo aqui descrito para Agaricales (d). Esporos em laranja. Escalas: (AB) 100 uM, (CD) de 50 um. Fotos foram tiradas por Y. Ruiz-León. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

NOTA: Este protocolo inclui seis seções principais, três dedicados a organismos específicos (secções 1-3), e três que descrevem os procedimentos comuns a todos (4-6). Asteriscos (*) indicam passos modificados pelos pesquisadores.

1. Estudos de Desenvolvimento e Estruturas Vegetais completamente formado

1. Recolha e fixação
   1. Se o material vegetal é coletado em um local sem acesso a uma câmara de exaustão, introduzir e imergir o material em 70% de etanol em tubos de centrífuga. Idealmente, imergir o material depois de 48 h em FAA (passos itens 1.1.1-1.1.3) para evitar a desidratação excessiva no etanol. Se uma câmara de exaustão é acessível ao material vegetal, ignore este passo e continuar com 1.1.1.
   2. Prepare o fixador de formalina-acético-álcool (FAA) em um exaustor equipado com um filtro de aldeído. Adicionam-se 85 partes de 70% de etanol desnaturado, 10 partes de solução de formaldeído a 60%, e 5 partes de ácido acético glacial. Prepare o FAApouco antes de fixar o material, como seu armazenamento a longo prazo não é recomendado ^40.
   3. Sob a câmara de exaustão, despeje o estoque de FAA em indivíduo de boca larga e garrafas de plástico à prova de vazamento. Use como muitas garrafas como existem amostras disponíveis, e criar etiquetas para identificação da amostra.
   4. Selecione os meristemas florais ou vegetativas para corrigir, garantindo que eles não são danificados por insetos, fungos ou condições meteorológicas extremas. Cortar os ramos, a remoção de material não desejado, e depositar a amostra imediatamente na solução FAA.
   5. Depois de 72-96 h, despeje a FAA em um recipiente de plástico para eliminação de resíduos químicos. Imediatamente, lavar as amostras três vezes com etanol fresco a 70% para remover qualquer FAA residual. material fixado pode ser armazenado indefinidamente em 70% de etanol.
2. Dissecção e desidratação
   1. Dissecar o material fixado em 70% de etanol, ao microscópio estereoscópico, usando uma pinça ultrafinas, needles, fórceps, escovas, e bisturis micro-(o tamanho máximo do tecido deve ser de cerca de 1 cm ^3, ou 2 cm para material plano). Dissecar as amostras para uma placa de Petri cobertas com etanol para impedir que os tecidos de secagem. Use uma placa de Petri com a base coberta com silício negro seco para ver melhor os tecidos brancos contrastantes.
   2. Coloque o material dissecado em recipientes das amostras para o secador de ponto crítico (CPD, Figura 2a). Neste ponto, imergir os recipientes no prato de Petri com 70% de etanol, e incluem as etiquetas de identificação da amostra (feito com papel e lápis). Para a secagem mais eficaz para posterior manipulação, evitar misturar as amostras de jovens e adultos no mesmo recipiente. *
   3. Coloque as tampas nos recipientes e depositá-los em tubos de centrífuga de plástico com uma abundância de 70% de etanol. Armazenar os tubos durante a noite, se o material não é processada imediatamente.
   4. Transferir o material dissecados através do seguinte serie de etanols em potes herméticos ou tubos de centrifugação: 70%, 90%, 100% e 100%. Deixar as amostras em cada solução durante 1 h a menos. Manter as amostras durante a noite numa solução de etanol a 100%.
   5. Transfira os recipientes com o material para o CPD (secção 4).
3. Montagem e preparação de tecidos de plantas para a observação SEM
   1. Escreva o número de identificação da amostra por baixo dos suportes de amostras de SEM (ou seja, topos de alumínio). Cubra o topo da topos com fita dupla face. Coloque os tocos em um suporte de amostra (Figura 2b).
   2. Sob um microscópio estereoscópico, abra cuidadosamente os contentores que transportam as amostras jovens e delicadas já secas no CPD. Tenha em mente que, após o tratamento CPD, as amostras se tornam mais leves e sensíveis a eletrostática. Feche os recipientes uma vez que as amostras foram tomadas para evitar a poeira ou impurezas.
   3. Coloque as amostras na superfície pegajosa dos topos, planejar com antecedência o desejadoposição (uma vez que as amostras de toque na superfície, é muito difícil removê-los). Não tente transportar uma grande dissecção neste ponto; simplesmente remover o tecido indesejado que é fácil de pegar. Para os estudos palinológicos, dissecar as anteras e abri-los para expor o pólen sobre os tocos.
   4. Amostras longas Put (por exemplo, 2 cm de comprimento), tais como inflorescências na posição horizontal. Quando possível, as amostras oriente da mesma estrutura para polar, lateral e vista de fundo. Deixe espaço suficiente entre as amostras no topo.
   5. Se as amostras não pode ser imediatamente processado, mantê-los protegidos durante a noite num recipiente hermético com gel de sílica para evitar a re-hidratação (Figura 2c) *. Revista as amostras usando o revestidor por crepitação e transferi-los para o SEM (seções 5 e 6).

Figura 2: Ferramentas para manipulati amostraon e processamento antes da observação SEM. (A) recipiente para espécimes feitos de aço com paredes perfuradas para a transferência de etanol / CO ₂ na câmara de CPD. (B) topos de aço dentro de um suporte de amostra de plástico. Recipiente (C) de vidro usado para manter as amostras protegidas da humidade e do pó. Na base, existe um compartimento de gel de sílica. (D) Pontos Críticos de secador. Na frente, há (a partir da esquerda para a direita) o manômetro, o interruptor de energia, o sistema de controle de temperatura, eo indicador de temperatura. Pressão de trabalho habitual para CO ₂ intercâmbio etanol é de 60 bar (800 psi). No topo, há quatro válvulas (controles de entrada, drenagem, ventilação e exaustão) que ladeiam a câmara de amostra central. Fotos foram tiradas por Y. Ruiz-León e MA Bello. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

< p class = "jove_title"> 2. Estudo do Comportamento Cisto de Saprolegnia (Oomycetes) sobre diferentes superfícies

1. Crescendo e fixa os cistos
   1. Prepare peptona e glucose (PG-l) meios de comunicação ^41, utilizando ácido D - (+) - glucose (6 g), e peptona micológica (3 g) *. Adicione até 900 mL de água da torneira e autoclave 40 min a 121 ° C. Pour 50 ml da solução previamente autoclavada A (NaH ₂ PO _4, 0,13 M) e 50 ml de solução B (Na ₂ HPO _4, 0,13 M).
   2. A partir de culturas de estirpes de parasitica Saprolegnia mantidos em peptona, glucose, meios de agar (PGA, que é preparado como PG-l, mas a adição de 10 g de ágar bacteriológico Europeia para a glicose e a peptona antes da autoclave), crescer colónias micélios em 0,5 ml de PG-l gotículas durante 24-48 h a 20 ° C em placas de Petri. Induzir a esporulação por lavagem do micélio com água da torneira autoclavada três vezes e incubando-as durante 15 h a 20 ° C= "xref"> ^{42, 43.}
   3. Recolher os zoósporos secundários divulgados pipetando suavemente a parte superior da suspensão e reunir-los em porções de 1 mL. Agite vigorosamente os zoósporos de 30 s em vortex para produzir cistos secundários ^44.
   4. Para testar o crescimento diferencial dos espinhos de cistos, em separado Petri (p60), coloque 0,5 mL da suspensão cisto secundária em superfícies diferentes (ou seja, de carbono, grades de ouro e cobre TEM; salmão e peixe pescada escalas (anteriormente branqueados) e tampa de vidro deslizamentos) *. Incubar os cistos, a 20 ° C durante 70 min, o que favorece a fixação dos quistos para a superfície.
   5. Remover o líquido e adicionar 0,5 ml de glutaraldeído a 2% para cada uma das superfícies para a fixação dos cistos. Manter as amostras à temperatura ambiente sob uma hotte durante 1 h.
   6. Remover o glutaraldeído e desidratar a amostra através de uma série de etanol (30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% e 100%), a adição de 5 mL de cada solução de etanol durante 15 min. Uma vez que na última solução de etanol a 100%, a amostra pode ser armazenada durante até um mês em uma placa de Petri selado. Nesta fase, as amostras estão prontas a ser seco na DPC.
   7. transferir cuidadosamente as grades e as escalas a partir da placa de Petri com um suporte adequado para o CPD (Seção 4). Para esta etapa, usar um suporte de grelha de CPD ou um suporte de amostra de empilhamento, que manter as amostras separadas umas das outras. Tome as grades e escalas com uma pinça, tendo em mente que os cistos deve estar voltado para cima nas grades o tempo todo. *
2. Amostras de cistos de montagem e preparação para observação SEM
   1. Montar as grades e as escalas nos topos de alumínio que foram previamente cobertas com fita dupla face de carbono e rotulados por baixo.
   2. Transferir as amostras para o revestidor por crepitação (seção 5).
   3. Observe as amostras no âmbito do SEM (secção 6).

3. Estudo do Herbário fúngicas Esporos de Phellorinia herculanea sob SEM

1. Reidratação e desidratação de esporos
   1. Enrole cada amostra cuidadosamente com papel de filtro, formando envelopes marcados com lápis ~ 0,5-1 cm ^2, tomando cuidado para não esmagá-los. Selar o papel de filtro com clipes de papel. Transferir as amostras embaladas para uma placa de Petri e mergulhe-os em 10 ml de água para hidratar os tecidos em torno dos esporos.
   2. imediatamente colocar as amostras em um forno de microondas (600 W durante aproximadamente 20 s). Retire o material uma vez que a água começa a evaporar, e deixe-a esfriar à temperatura ambiente.
   3. Passar as amostras através da seguinte série de etanol: 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% e 100%. Dependendo da quantidade de amostras, utilizar uma proveta ou de centrifugação de tubos para este passo. Deixar as amostras durante 15 minutos em cada solução.
   4. Coloque as amostras para o CPD (secção 4).
2. Montagem e preparing esporos para observação SEM
   1. Abrir os envelopes. Despeje os esporos em um topo previamente preparado com fita dupla face. Alternativamente, recolher os esporos com a superfície adesiva do topos, tomando cuidado para não esmagá-los *.
   2. Se as amostras contêm poucos esporos, para além da etapa anterior, corte um pequeno pedaço do envelope (~ ² 1 mM) e colocá-lo numa nova ponta *.
   3. Coloque os tecidos para o revestimento por pulverização catódica (seção 5).
   4. Observar sob a SEM (secção 6).

4. Secagem de material que utiliza um Ponto Crítico de Secador (CPD, Figura 2d)

1. Use o CPD em uma área ventilada e verificar se todas as válvulas da máquina estão fechados. Verifique se a câmara de amostra está vazio e limpo.
2. Ligue a máquina e verifique se o teste do sistema de controle de temperatura ocorre automaticamente. Se o CPD tem um sistema de banho de refrigeração externo, verifique os níveis de água antes de mudar itonelada.
3. Siga as instruções do fabricante do CPD específico utilizado para o etanol e intercâmbio de CO _2. Por razões de segurança, continue este passo sob a supervisão de alguém treinado para a utilização da máquina. Lembre-se que ele é exposto a mudanças de pressão rápidas, poderia explodir violentamente.
4. Retire as amostras e continuar com o passo 1.3 Se trabalhar com tecidos vegetais, passo 2.2 se trabalhar com Oomycetes cistos, e as etapas 3.2 se trabalhar com esporos de fungos.

5. O revestimento das amostras com ouro Usando o Sputter Coater (Figura 3a)

1. Verifique o revestidor por crepitação. Verifique se o alvo de cátodo de ouro está em boas condições. Use um pano que não solte fiapos encharcado com 90% de etanol para limpar as paredes da câmara de vácuo e da tampa da câmara, se necessário.
2. Marcar o titular da pulverização catódica com números ao lado de cada buraco de stub para posterior identificação das amostras sob o microscópio. Com cuidado, coloque o tocos carregado com o samples e fixá-los. Use um estágio espécime planetária rotativo para garantir um revestimento uniforme em amostras com superfícies irregulares.
3. Siga as instruções do fabricante para ajustar configurações, como a distância de trabalho, pressão de gás de operação (por exemplo, 5 x 10 ^-1 - 7 x 10 ^-1 mbar) (por exemplo, 30 mm.), O tempo de pulverização catódica (por exemplo, 50 s), espessura da camada de ouro (por exemplo, 12 nm) a corrente (por exemplo, 15 mA) e à alimentação de tensão (por exemplo, 600 V) ^45.
4. Remover os tocos e levá-los para o SEM (secção 6). Em alternativa, colocar os tocos em um recipiente fechado, com gel de sílica (Figura 2c).

Figura 3: revestidor por pulverização catódica, (a) e microscopia electrónica de varrimento (b). (A) Vista frontal da câmara de vácuo (à esquerda), valv gáse, temporizador, vácuo e controles atuais. (B) Vista lateral dos componentes principais de SEM (da esquerda para a direita): a coluna de vácuo com a câmara de amostra, a tela do computador com os controles, e um monitor da Câmara. Fotos foram tiradas por Y. Ruiz-León. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. observação ao microscópio eletrônico de varredura (MEV, Figura 3b)

1. SEM arranque
   1. Siga as instruções do fabricante para iniciar e definir o SEM, ajustar a altura da amostra o diâmetro da abertura objetivo (por exemplo, para as plantas 2 mm e para fungos e oomycetes 4 mm), a tensão de operação (por exemplo, 15 kV).
   2. Verifique o alinhamento correcto do sistema de feixe de elétrons e definir o alinhamento axial e os stigmators de acordo com as indicações do fabricante. Ajuste tele distância de trabalho, a fim de se obter uma profundidade de campo adequada.
2. Captura de imagem
   1. Obter uma imagem focalizada da amostra e usá-lo como ponto de partida. Aumentar a ampliação perto do nível máximo e focar a imagem novamente. Escolha áreas com irregularidades da superfície, tais como buracos. corrigir o astigmatismo e ajustar o contraste ideal e brilho.
   2. Capturar a imagem SEM com a alta-resolução. Use o detector de BSE se a imagem mostra que as amostras são cobrados. Caso contrário, o detector ajustado SE. Mudar os detectores seguindo as instruções do fabricante.

Resultados

Desenvolvimento Floral e Fixação de Desenvolvimento e Estruturas Vegetais completamente formado

Usando o protocolo FAA-CPD descrito aqui, jovens e maduros tecidos vegetais são perfeitamente fixadas e desidratadas para geração de imagens SEM. Processos tais como o desenvolvimento floral pode ser reconstruído, porque a topografia ea forma dos botões não é distorcida por celular encolhendo (Figuras 1b, 1d, 4a-f).

Discussão

No que diz respeito aos protocolos SEM padrão, os procedimentos aqui apresentados incluem relativamente rápida, fácil de seguir, e metodologias de baixo custo. Dependendo da quantidade de amostras e na facilidade de processamento, que leva quatro a cinco dias para adquirir imagens de boa qualidade. Incluindo as precauções de segurança adequadas para a CPD e operação SEM, os procedimentos são fáceis de manusear. Um cuidado especial deve ser tomado com formalina e o glutaraldeído (consulte os passos 1.1.1 a 1.1...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	No specific supplier		Skin irritation, eye irritation
aluminium stubs	Ted Pella, Inc.	16221	www.tedpella.com
Centrifuge tubes	No specific supplier
Critical Point Dryer	Polaron Quatum Technologies	CPD7501
D (+) Glucose	Merck	1,083,421,000
Double sided sellotape	No specific supplier
Ethanol absolute	No specific supplier.		Flammable
European bacteriological agar	Conda	1800.00	www.condalab.com
Filter paper	No specific supplier
Forceps	No specific supplier
Formalin 4%	No specific supplier.		Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable
Glass cover slips	No specific supplier
Glass hermetic container	No specific supplier
Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611  (L)	Dismadel S.L.	3336	www.dismadel.com
Mycological peptone	Conda	1922.00	www.condalab.com
needles	No specific supplier
Petri dishes	No specific supplier
Plastic containers	No specific supplier
Sample holder with lid  for the critical point dryer	Ted Pella, Inc.	4591	www.tedpella.com
scalpels	No specific supplier
Scanning Electron Microscope	Hitachi	S3000N
Software for SEM
Solution A: NaH2PO4
Solution B: Na2HPO4
Specimen holders	No specific supplier
Sputter coater	Balzers	SCD 004
Stereomicroscope	No specific supplier
Transmission Electron Microscope (TEM) grids	Electron Microscopy Sciences	G200 (Square Mesh)	www.emsdiassum.com
Tweezers	No specific supplier