Sorunlu Tesisi, Oomiçet ve fungal Örnekleri için Elektron Mikroskobu (SEM) Protokoller tarayarak

Özet

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Özet

taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile gözlemler için biyolojik numunelerin işlem en sık karşılaşılan sorunlardır hücre çökme ıslak mikroçevrelerde ve hücre tahrip örnekler işlemden geçirilmesini içerir. SEM altında fotoğraf çekimi için örnek tedavisinde başlıca zorluklardan bazıları üstesinden burada açıklanmıştır narin örnekleri işlemek için, belirli protokoller genç çiçek dokuları, oomiset kistler ve örnek olarak mantar sporları (Agaricales) kullanma.

FAA ile tespit Çiçek meristemler (Formalin-Alkol-Asetik) ve Kritik Nokta Kurutma (CPD) ile işlenmiş hücresel duvarlar ya da bozuk organları çöktü göstermezse vermedi. Bu sonuçlar çiçek gelişiminin yeniden inşası için büyük önem taşımaktadır. Böyle glutaraldehit sabit oomiset kistleri gibi ıslak mikroçevrelerde, alınan örneklerin benzer bir CPD-temelli tedavi, su farklı türde tanısal özelliklerini diferansiyel büyümesini (örneğin, kist dikenleri) test etmek en uygunudurbstrates. mantar sporları bağlı hemşire hücrelerinin imha rehidrasyon, dehidratasyon ve CPD tedavisi, bu hücrelerin daha fonksiyonel çalışmalar için önemli bir adım sonra kaçınıldı.

Burada ayrıntılı protokoller düşük maliyetli ve büyüme süreçlerini yeniden ve tanı özelliklerini incelemek için iyi kalitede görüntüler elde edilmesi için hızlı alternatifleri temsil etmektedir.

Giriş

Biyolojide, taramalı elektron mikroskobu kullanımı (SEM) yapısal evrimi, karşılaştırmalı morfoloji, organ gelişimi ve nüfus veya türlerin ¹ karakterizasyonu çalışmalarına uzatıldı. Mikroskobik yapılar olan iki boyutlu görüntüsü, böyle bir mikromorffolojisinin ve sistematiği olarak alanlar 20. ^yüzyılın ikinci yarısından itibaren SEM tekniği avans yararlandı. Örneğin, 1970'lerde püskürtmeli kaplama yönteminin tanıtımı olarak iletken olmayan dokularda ^{2, 3} görüntüleme yükseltmiş gibi sürgün uçları ve çiçekler gibi hassas malzemelerin olası gözlemler yapılmıştır. SEM yüksek vakumlu bir ortamda ⁴ topografya yeniden oluşturmak için numune yüzeyinden çıkarılır elektronları kullanır.

SEM ile ilgili çalışmalar yapısal karakterlerin çıkarım ve growt yeniden inşası, hem de odaklanmışh süreçleri. Yeni yapısal taksonomi ile ilgili karakterler ve organizmaların geniş bir sistematiği SEM gözlemlerden tespit edilmiştir. Örneğin, bitki özellikleri gibi ^{10, 11,} düzgün olmadan görüntülendi olamaz ahşap _^5, stigma çeşitliliği ^6, nectary ve çiçek morfolojisi ^{7, 8,} pul detayları ⁹ ve polen taneleri ve vestured çukurlar olarak, türlerin teşhis veya Türüstü sınıflandırmaları için kullanılan SEM. Geleneksel SEM ile Başarılı gözlemler de uzun süre formalin ile fikse organizmalar ¹² için elde edilmiş ve bitki herbaryum ¹³ numune.

Öte yandan, SEM kullanılarak büyüme süreçlerinin yeniden yapılanma çalışmaları organ gelişimi ^14, INFE gibi konularda, geniş bir yelpazede içerirBakterilerin ^15, bitki kök fizyolojisi ^16, parazit-konak bağlanma mekanizması ^{17, 18,} parazitler ^19, mycoparasitism ve antibiosis ^{20, 21,} büyüme malformasyon ²² vahşi ve mutant bireylerin ²³ karşılaştırmalı gelişme ve tüm yaşam döngülerini uyuşturucu etkileri tarafından uyarılan seksiyonlar ^24. Çevre taramalı elektron mikroskopları (ESEM) ²⁵ büyüme süreçlerinde ıslak biyolojik numunelerin gözlem için önemli avantajlara sahip olsa da, hassas malzeme dahi ESEM) düşük vakum koşullarında tehlikeye ve kaybını önlemek için yeterli işlenmesi gerekir olabilir değerli morfolojik gözlem.

Bu yazıda, üç fark SEM gözlem için özel protokoller bir yorumdaÖrneklerin Erent tip sunulmuştur: floral meristemleri, Oomycetes (Saprolegnia), ve fungal madde. Bu protokoller belirli zorluklar ve alternatif çözümler bulunmuştur önceki SEM temelli çalışmalar ^{26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,} deneyimi derlemek. Bitki karşılaştırmalı gelişimsel ve yapısal çalışmaların durumunda, SEM kullanımı 1970'li yıllarda ^{34, 35} yılında başlayan ve o zamandan beri, araştırmacılar belirli çiçek özellikleri, daha önce ³⁶ düşünüldüğünden daha dayanıksız olduğunu keşfetti. çiçek gelişme İmar genç çiçek meristemler ve anthesis'e arasındaki tüm aşamaların yakalama içerir. Bu amaca ulaşmak için, esse olduğunuÖrnek topografya ve hücre duvarı bütünlüğü fiksasyonu ve sonraki dehidratasyon sonra tehlikeye olmadığını ntial. Genç çiçek meristemler hücre duvarı çöküşüne özellikle savunmasız (Şekil 1a, 1b). Benzer şekilde, nectaries, yaprakları, püskülü ve Sporangium gibi hassas yapıların etkin ve undamaging protokolleri gerektirir. Bu yorum SEM görüntüleme için sağlam genç ve narin dokuları tutmak için optimal bir protokol özetlemektedir.

Mikroplar ve bitkilerden omurgasızlar ve omurgalıların ³⁷ arasında değişen ana Omycetes (Stramenopiles'e) parazitlerin en farklı ve yaygın grupların olduğunuz kişiye durumunda - büyümek ve ıslak ortamda gelişebilir sporlar vardır. sporlar, standart SEM protokoller için uygun değildir yeterli alt tabaka gerektiğinden bu durum SEM gözlem için bir sorun teşkil etmektedir. Omycetes arasında Saprolegnia türleri özel ilgi onlar ca, çünkün su kültürlerinde, balıkçılık ve amfibi nüfus ³⁸ ciddi azalmalar neden olur. Bu tür kistler çengel dikenler olarak mikromorfolojik özellikleri, enfeksiyon kontrolleri ve potansiyel tedaviler ³⁹ kurmak esastır Saprolegnia, türlerini belirlemek için yararlı olduğu tespit edilmiştir. Burada, farklı yüzeylerde kistlerin omurga büyümesinin kalıplarını karşılaştırmak ve kritik nokta kurutma (CPD) hazırlanması ve daha sonraki SEM gözlem için örnek işlemek için bir deneysel protokol var.

Üçüncü durumda, mantarlar Phellorinia Herculanea f sporların bir incelemeden sonra geldi ilginç bulgular vardır. stellata f. nova (Agaricales) ^31. Birlikte sporlarla, beklenmedik kreş hücrelerinin bir grup SEM altında tespit edilmiştir. önceki geleneksel protokoller ve işlenmemiş malzeme ile, hemşire hücreleri ou geldit tamamen (Şekil 1c) çöktü. Sporların ilişkili belirli dokular hakkında ayrıntılı çıkarımlarda burada açıklanan (Şekil 1d) standart yaklaşımlara basit ama önemli değişiklikler yapılabilir.

Bu derlemede, SEM gözlem ile ilgili farklı sorunlarla başa çıkmak için kullanılabilecek ayrıntılı SEM protokolleri vardır angiospermleri, bu tür hücre çöküşü ve meristematik doku daralması, kist dikenler optimum olmayan büyüme ve imha olarak Oomycetes ve Agaricales, sırasıyla geçici dokular.

Şekil 1: (A, C) ve (B, D) protokolü FAA-etanol-CPD olmadan muamele edilmiş numunelerin karşılaştırılması. (A - b) anacyclus clavatus, orta gelişme Çiçek tomurcukları. Tomurcuk ozmiyum tetroksit ^{46 işlemden geçirildi/ sup> (a) ve FAA-CPD protokolü (B) ile muamele evlat. (C - d) Phellorinia Herculanea f sporlarla Hemşire hücreleri. stellata. Herhangi bir işleme (C) 'olmayan burada Agaricales'e (d) için tarif edilen protokol ile örnekleri kurutulmuştur. turuncu sporlar. Ölçekler: (ab) 100 mikron (cd) 50 mikron. Resimler Y. Ruiz-León tarafından alınmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.}

Protokol

NOT: Bu protokol, tüm (4-6) ortak prosedürler açıklayan belirli organizmaların (bölümler 1-3), ve üç üç adamış altı ana bölümden içerir. Yıldız (*) denemecileri modifiye adımları göstermektedir.

1. Gelişmekte Olan Araştırmalar ve Tam kurulan Bitki Yapıları

1. Toplama ve sabitleme
   1. bitki materyali bir çeker ocak erişimi olmayan bir yerde toplanması halinde, tanıtmak ve santrifüj tüplerine% 70 etanol içinde malzemeyi batırmayın. İdeal olarak, etanol aşırı su kaybını önlemek için FAA 48 saat (1.1.1-1.1.3 adımlar) sonra malzemeyi daldırın. Bir duman dolap bitki materyali erişilebilir ise, bu adımı görmezden ve 1.1.1 ile devam edin.
   2. bir aldehid filtre takılmış bir çeker ocak formalin-asetik-alkol (FAA) fiksatif hazırlayın. % 70 denatüre etanol içinde 85 kısım,% 60 formaldehid çözeltisi, 10 parça ve buzlu asetik asit 5 ölçü. FAA hazırlayınSadece uzun vadeli depolama, malzeme sabitleme önce ⁴⁰ tavsiye edilmez.
   3. çeker ocak altında, bireysel geniş ağız ve sızdırmaz plastik şişelere FAA stok dökün. Mevcut örnekler var gibi çok sayıda şişe kullanın ve örnek tanımlama etiketleri oluşturmak.
   4. böcekler, mantarlar, ya da aşırı hava koşullarından zarar görmezler sağlanması, düzeltmek için çiçek veya vejetatif meristem seçin. , Dalları kesmek istenmeyen malzeme kaldırma ve FAA çözeltide hemen numuneyi mevduat.
   5. 72-96 saat sonra, kimyasal bertaraf etmek için, plastik bir kap içine FAA dökün. Hemen sonra, herhangi bir kalıntı FAA çıkarmak için taze% 70 etanol ile numuneleri üç kez yıkayın. Sabit madde% 70 etanol içinde süresiz olarak saklanabilir.
2. Diseksiyon ve dehidratasyon
   1. ne, ultra ince cımbız kullanarak stereomicroscope altında% 70 etanol sabit malzemeyi teşrihedles, forseps, fırçalar ve mikro-neşter (dokusunun maksimum boyutu yaklaşık 1 cm ³ veya düz malzeme için 2 cm olmalıdır). Kurutma dokuları önlemek için etanol ile kaplı bir Petri kabı içine örnekleri teşrih. Daha iyi kontrast beyaz dokuları görmek için kuru siyah silikon kaplı tabanı ile Petri kabı kullanın.
   2. Kritik nokta kurutucu (CPD, Şekil 2a) için numune kapları disseke malzemeyi koyun. Bu noktada,% 70 etanol ile Petri kabı içine kapları batırmayın ve (kağıt ve kalem ile yapılan) örnek tanımlama etiketleri bulunmaktadır. Daha fazla manipülasyon için daha etkili kurutma için, aynı kapta genç ve olgun örnekleri karıştırma kaçının. *
   3. kapların kapaklarını koyun ve% 70 etanol bol plastik santrifüj tüplerine bırakılması. Malzeme hemen işleme değilse bir gecede tüpleri saklayın.
   4. Aşağıdaki etanol serisi ile disseke malzemeyi aktarın% 70,% 90,% 100 ve% 100: Hermetik kavanoz veya santrifüj tüplerine s. en az 1 saat boyunca, her çözelti içinde numune bırakın. % 100 etanol çözeltisi içinde bir gecede örnekleri tutun.
   5. CPD (bölüm 4) malzeme ile kaplar aktarın.
3. SEM gözlem için montaj ve hazırlanması bitki dokuları
   1. SEM numune tutucuları (yani, alüminyum koçanları) altında numune kimlik numarasını yazın. çift ​​taraflı bant ile koçanları üst kapağı. Bir örnek tutucu (Şekil 2b) içine taslakları yerleştirin.
   2. Bir stereomikroskop altında, dikkatle zaten CPD kurutulmuş genç ve narin örnekleri taşıyan kapları açın. SMG tedavisinden sonra, numuneler elektrostatik daha hafif ve duyarlı hale gelmesi unutmayın. Numuneler toz veya kirleri önlemek için dışarı atılmıştır kez kapları kapatın.
   3. , Taslakları yapışkan yüzeyinde örnekleri koymak öncesi planlama istenenpozisyon (örnekler yüzeyine dokunmayın kez bunları kaldırmak çok zordur). Bu noktada önemli bir diseksiyon taşımak kalkmayın; Sadece almak kolaydır istenmeyen doku kaldırmak. palinolojik çalışmalar için, anter incelemek ve koçanları üzerinde polen maruz açın.
   4. Böyle yatay pozisyonda inflorescences olarak koymak uzun numuneler (örneğin, 2 cm uzunluğunda). Mümkün olduğunda, kutup, tarafı için aynı yapı ve alt görüşlerin şark örnekleri. saplama üzerindeki numuneler arasında yeterince boşluk bırakın.
   5. Numuneler hemen işleme edilemiyorsa, * onları rehidrasyon (Şekil 2c) önlemek için silika jel ile hermetik kapta gecede korunmasını. Coat püskürtmeli kaplayıcı kullanılarak ve SEM aktarmak örnekleri (bölümler 5 ve 6).

Şekil 2: Örnek işlenmesini Araçlarıve işleme SEM gözlem önce. GBM odası içinde etanol / _CO2 değişimi için delikli duvarlı, (a) çelik yapımı numune kabı. (B) plastik numune tutucu içinde Çelik taslakları. (C) Cam kap nem ve tozdan korunmuş örnekleri tutmak için kullandı. Tabanda, silika jel bir bölme vardır. (D) Kritik Nokta Kurutucu. Önünde, manometre, güç düğmesi, sıcaklık kontrol sistemi, ve sıcaklık göstergesi (soldan sağa) vardır. CO ₂ -etanol değişimi için olağan çalışma basıncı 60 bar (800 psi). üst, merkezi numune odasına yan dört valf (giriş, drenaj, havalandırma ve egzoz kontrolleri) vardır. Resimler Y. Ruiz-León ve MA Bello tarafından alınmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

< p class = "jove_title"> 2. Farklı Yüzeylerde Saprolegnia (Omycetes) Kist Davranışının Çalışması

1. Kistlere Büyüyen ve sabitleme
   1. (+) - - Glukoz (6 g) ve mikolojik pepton (3 g) * pepton ve glikoz (PG-l), D kullanılarak ortam ⁴¹ hazırlayın. Musluk suyu 900 mL toplayın ve 121 ° C'de 40 dakika otoklavda. Daha önce otoklava çözelti A 50 mL (NaH ₂ PO _4, 0.13 M) ve çözelti B 50 mL (Na ₂ HPO _4, 0.13 M) dökün.
   2. Pepton, glikoz, (PG-l olarak değil glikoz ve otoklav önce pepton Avrupa bakteriyolojik agar 10 g eklenerek hazırlanan PGA) ağar medyada tutulan Saprolegnia parasitica suşları stok kültürleri, 0.5 mL misel kolonileri büyümek Petri kutularında 20 ° C'de 24-48 saat için PG-l damlacıklarının. C otoklavlanmış musluk suyu ile üç kere miselleri yıkama ve 20 ° C'de 15 saat boyunca inkübe edilerek bunları sporlanmasını Uyarmaktadır= "xref"> ^{42, 43.}
   3. yavaşça süspansiyon üst kısmını pipetleme tarafından yayımlanan ikincil zoosporlar toplayın ve 1 ml porsiyonlarda bunları havuz. İkincil kistlere ⁴⁴ üretmek için vorteks kuvvetlice 30 saniye boyunca zoosporlar ajitasyon.
   4. Daha önce (somon ve hake balık pulları, ayrı Petri kapları (p60) üzerine kistlerin dikenler diferansiyel büyümesini test etmek için, farklı yüzeyler (yani, karbon, altın ve bakır TEM ızgaraları üzerine ikincil kist süspansiyonu 0.5 mL koymak ağartılmış) ve cam kapak fişleri) *. yüzeye kistlerin eki yana 70 dakika, 20 ° C 'de kist inkübe edin.
   5. sıvı çıkarın ve kistlerin tespiti için her bir yüzeye% 2 gluteraldehit 0.5 mL ekleyin. 1 saat boyunca bir çeker ocak altında oda sıcaklığında örnekleri tutun.
   6. Glutaraldehit çıkarın ve bir etanol serisi (% 30,% 40,% 50,% 60,% 70,% 80 ile örnek dihidrat15 dakika boyunca, her etanol çözeltisi 5 ml ilave% 90,% 100 ve% 100). Son% 100 etanol çözeltisi içinde bir kez, numune bir sızdırmaz Petri kabındaki bir aya kadar saklanabilir. Bu aşamada, numuneler CPD kurutulabilir hazırdır.
   7. Dikkatle CPD (Bölüm 4) için uygun bir tutucuya Petri kabı ızgaraları ve ölçekler aktarın. Bu adım için, birbirinden ayrılmış örnekleri tutmak GBM ızgara tutucu veya bir istifleme numune tutucu kullanın. kistler her zaman ızgaraları yukarı bakacak gerektiğini göz önünde tutarak, cımbız ile ızgaraları ve ölçekler atın. *
2. SEM gözlem için montaj ve hazırlanması kist örnekleri
   1. Daha önce çift taraflı karbon bant ile kaplanmış ve altına etiketli alüminyum taslakları üzerinde ızgaraları ve ölçekler monte edin.
   2. püskürtmeli kaplayıcı (bölüm 5) örnekleri aktarın.
   3. SEM (bölüm 6) altında örnekleri dikkate alınız.

3. SEM altında Phellorinia Herculanea Herbaryumun Mantar Sporlarının Çalışması

1. Rehidrasyon ve sporların dehidratasyon
   1. Onları ezmek için özen ~ 0.5-1 cm ² kalem-etiketli zarf oluşturan, filtre kağıdı ile dikkatlice her bir örnek sarın. ataç ile filtre kağıdı mühür. Bir Petri kabı dolu örnekleri aktarın ve sporlar etrafında dokuları rehydrate 10 mL su onları bırakın.
   2. Hemen bir mikrodalga (yaklaşık 20 sn için 600 W) örnekleri koydu. su buharlaşmaya başlar kez malzemeyi çıkarın ve oda sıcaklığında soğumaya bırakın.
   3. Aşağıdaki etanol dizi örnekleri geçirin:% 30,% 50,% 70,% 80,% 90,% 95,% 100 ve% 100. Numunelerin miktarına bağlı olarak, bu aşama için, bir bardak ya da santrifüj tüplerini kullanın. Her bir çözelti içinde 15 dakika boyunca numune bırakın.
   4. CPD (bölüm 4) örnekleri yerleştirin.
2. Montaj ve pSEM gözlem sporlar onarılması
   1. Zarfları açın. çift ​​taraflı bant ile önceden hazırlanmış saplama üzerinde sporları dökün. Alternatif olarak, * onları ezmek için özen koçanları yapışkan yüzeyi ile sporlar toplamak.
   2. Örnekler birkaç sporlar içeren, önceki aşamasına ilave olarak, zarf (~ 1 ila ² mm) ve küçük bir parça kesilmiş ve yeni bir saplama * üzerine yerleştirin.
   3. püskürtmeli kaplayıcı (bölüm 5) içine dokuları yerleştirin.
   4. SEM (bölüm 6) altında gözlemleyin.

Bir Kritik Nokta Kurutma Kullanılması Malzeme 4. Kurutma (CPD, Şekil 2d)

1. havalandırılan bir alanda CPD kullanın ve makinenin tüm vanalar kapalı olduğunu doğrulayın. örnek odası boş ve temiz olup olmadığını kontrol edin.
2. Makinenin açın ve sıcaklık kontrol sistemi testi otomatik olarak gerçekleşir emin olun. SMG harici soğutma banyosu sistemi varsa, i açmadan önce su seviyelerini kontrolüzerinde t.
3. Etanol ve _CO2 değişimi için kullanılan özel CPD üreticinin talimatlarına uyun. Güvenliğiniz için, makinenin kullanımı için eğitilmiş birinin gözetimi altında bu adımı devam. o hızlı basınç değişikliklerine maruz kaldığı, şiddetle dışarı darbe olabilir unutmayın.
4. örnekleri alınız ve bitki dokularında ile çalışan eğer adım 1.3 ile devam Oomycetes kistleri ile çalışan eğer 2.2 adım ve mantar sporları ile çalışan eğer 3.2 adımları.

5. Sputter Coater (Şekil 3a) kullanarak Altın Örnekleri Kaplama

1. püskürtmeli kaplayıcı kontrol edin. altın katot hedefi iyi durumda olduğundan emin olun. Gerekirse vakum odasının duvarlarını ve oda kapağını temizlemek için% 90 etanol ile sırılsıklam bir tüy bırakmayan bir bez kullanın.
2. mikroskop altında örneklerin ileri tanımlama için her saplama deliği yanında sayılarla püskürtme tutucu işaretleyin. Dikkatle, sampl yüklü taslakları yerve es sabitleyin. düzensiz yüzeyleri olan numuneler üzerinde üniform bir kaplama sağlamak için, döner bir planeter örnek sahne kullanın.
3. Böyle bir çalışma mesafesi olarak ayarlarını yapmak için üreticinin talimatlarına uyun, operasyon gaz basıncı (örneğin, x 10 ^-1 5-7 x 10 ^-1 mbar) (örneğin, 30 mm.), Püskürtme süresi (örneğin, 50 s), altın tabakası (örneğin, 12 nm) güncel (örneğin, 15 mA) ve gerilim beslemesi (örneğin, 600 V) ⁴⁵ kalınlığı.
4. taslakları çıkarın ve SEM (bölüm 6) götürün. Seçenek olarak ise, silika jel üzerinde (Şekil 2c) ile kapalı bir kap içine taslakları yerleştirin.

Şekil 3: püskürtme kaplayıcıda (a) ve tarama elektron mikroskobu (B). (A) vakum odası (solda) önden görünümü, gaz valvE, zamanlayıcı, vakum ve mevcut kontroller. (Soldan sağa) SEM ana bileşenden (b) Yandan görünüm: numune odasına, kontrol grubu ile bilgisayar ekranı ve bölmenin monitör ile vakum sütun. Resimler Y. Ruiz-León tarafından alınmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tarama altında 6. Gözlem Elektron Mikroskobu (SEM, Şekil 3b)

1. SEM başlatmak
   1. Başlangıç ve (bitkiler 2 mikron ve mantarlar ve Omycetes 4 mikron için, örneğin), çalışma gerilimine (örneğin, 15 kV) numune yüksekliği objektif diyafram çapı ayarlayarak, SEM ayarlamak için üreticinin talimatlarına uyun.
   2. elektron ışını sisteminin doğru hizalanmasını kontrol edin ve eksenel hizalama ve üreticilerin endikasyona göre stigmators ayarlayın. t ayarlayıno alanın yeterli bir derinlik elde etmek için çalışma mesafesi.
2. görüntü yakalama
   1. numunenin odaklanmış bir görüntü almak ve bir başlangıç ​​noktası olarak kullanabilirsiniz. maksimum seviyeye büyütme yakın arttırmak ve görüntüyü yeniden odaklanır. Bu tür delikler gibi yüzey düzensizlikler olan alanları seçin. Doğru astigmatizma ve optimum kontrast ve parlaklık ayarı.
   2. yüksek çözünürlüklü SEM Resmi yakalayın. görüntü örnekleri ücret olduğunu gösterir eğer BSE dedektörü kullanın. Aksi takdirde, SE dedektörü ayarlayın. Üreticinin talimatlarını takip dedektörleri değiştirin.

Sonuçlar

Çiçek Gelişim ve Geliştirme Fiksasyon ve Tam kurulan Bitki Yapıları

Burada anlatılan FAA-CPD protokolü kullanarak, genç ve olgun bitki dokuları optimal sabit ve SEM görüntüleme için susuz vardır. Tomurcuklarının topografya ve şekli küçülen hücre (Şekil 1b, 1d, 4a-f) tarafından deforme olmaz çünkü bu tür çiçek gelişme olarak Süreçler yeniden inşa edilebilir. Karmaşık şekilli y...

Tartışmalar

Standart SEM protokollere göre, burada sunulan prosedürler nispeten hızlı takip edilmesi kolay ve düşük maliyetli metodolojileri içerir. Numunelerin miktarı ve işleme kolaylığı bağlı olarak, kaliteli görüntüler elde etmek için dört-beş gün sürer. CPD ve SEM çalışması için yeterli güvenlik önlemleri de dahil olmak üzere, prosedürler ele kolaydır. Özellikle dikkat (1.1.3 ve protokolün 2.1.5 adımları 1.1.1 bakınız) formalin ve glutaraldehid ile alınmalıdır. Örnekleri zarar veya ö...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	No specific supplier		Skin irritation, eye irritation
aluminium stubs	Ted Pella, Inc.	16221	www.tedpella.com
Centrifuge tubes	No specific supplier
Critical Point Dryer	Polaron Quatum Technologies	CPD7501
D (+) Glucose	Merck	1,083,421,000
Double sided sellotape	No specific supplier
Ethanol absolute	No specific supplier.		Flammable
European bacteriological agar	Conda	1800.00	www.condalab.com
Filter paper	No specific supplier
Forceps	No specific supplier
Formalin 4%	No specific supplier.		Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable
Glass cover slips	No specific supplier
Glass hermetic container	No specific supplier
Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611  (L)	Dismadel S.L.	3336	www.dismadel.com
Mycological peptone	Conda	1922.00	www.condalab.com
needles	No specific supplier
Petri dishes	No specific supplier
Plastic containers	No specific supplier
Sample holder with lid  for the critical point dryer	Ted Pella, Inc.	4591	www.tedpella.com
scalpels	No specific supplier
Scanning Electron Microscope	Hitachi	S3000N
Software for SEM
Solution A: NaH2PO4
Solution B: Na2HPO4
Specimen holders	No specific supplier
Sputter coater	Balzers	SCD 004
Stereomicroscope	No specific supplier
Transmission Electron Microscope (TEM) grids	Electron Microscopy Sciences	G200 (Square Mesh)	www.emsdiassum.com
Tweezers	No specific supplier