Escaneado de Protocolos de Microscopía Electrónica (SEM) para la Problemática de la planta, Oomycete, y muestras de hongos

Resumen

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Resumen

Los problemas más comunes en el procesamiento de muestras biológicas para observaciones con el microscopio electrónico de barrido (SEM) incluyen colapso celular, el tratamiento de muestras de microambientes húmedos y destrucción de las células. El uso de tejidos florales jóvenes, quistes oomycete y esporas de hongos (Agaricales) como ejemplos, los protocolos específicos para procesar las muestras delicadas están descritos aquí que superan algunos de los principales desafíos en el tratamiento de la muestra para la captura de imágenes bajo el SEM.

meristemos florales fijos con la FAA (formalina-acético-alcohol) y se procesa con el Punto Crítico Secadora (CPD) no mostraron colapsaron paredes celulares u órganos distorsionadas. Estos resultados son cruciales para la reconstrucción del desarrollo floral. Un tratamiento basado en la CPD similar de muestras de microambientes húmedos, como los quistes oomycete fijados con glutaraldehído, es óptimo para poner a prueba el crecimiento diferencial de las características de diagnóstico (por ejemplo, las espinas del quiste) en diferentes tipos de Dobstrates. La destrucción de células de la enfermera adjunta a esporas de hongos se evitó después de la rehidratación, la deshidratación y el tratamiento de CPD, un paso importante para los estudios más funcionales de estas células.

Los protocolos detallados aquí representan bajo costo y alternativas rápidas para la adquisición de imágenes de buena calidad para reconstruir los procesos de crecimiento y estudiar sus características de diagnóstico.

Introducción

En biología, el uso de la microscopía electrónica de barrido (SEM) se ha extendido a los estudios de la evolución estructural, la morfología comparativa, el desarrollo de órganos, y la caracterización de las poblaciones o especies ^1. Con su vista bidimensional de estructuras microscópicas, áreas como la micromorfología y sistemática se beneficiaron de los avances de la técnica SEM desde la segunda mitad del siglo ^20. Por ejemplo, la introducción de la metodología de revestimiento por bombardeo iónico en la década de 1970 hizo posibles observaciones de materiales delicados, como los brotes apicales y flores que potencien la capacidad de formación de imágenes de los tejidos no conductores ^{2, 3.} SEM utiliza electrones expulsados de la superficie de la muestra para reproducir la topografía en un entorno de alto vacío ^4.

Los estudios que implican SEM se centran tanto en la inferencia de caracteres estructurales y la reconstrucción de growtprocesos h. caracteres estructurales nuevos relevantes a la taxonomía y sistemática de una amplia gama de organismos se han descubierto a partir de observaciones de SEM. Por ejemplo, características de las plantas utilizadas para el diagnóstico de las especies o las clasificaciones supraespecíficas, tales como las punteaduras de madera _{^5, la} diversidad estigma ^6, morfología nectario y florales ^{7, 8,} detalles de tricomas ^9, y los granos de polen de ^{10, 11,} no puede visualizarse de forma adecuada y sin SEM. Observaciones exitosas con SEM convencional también se han logrado para los organismos fijados en formalina ¹² desde hace mucho tiempo y especímenes de herbario de plantas ^13.

Por otra parte, los estudios de reconstrucción de los procesos de crecimiento utilizando SEM implican una amplia gama de temas, tales como el desarrollo de órganos ^14, infecciones inducidos por las bacterias ^15, planta de raíz fisiología ^16, mecanismos de fijación parásito-hospedador ^{17, 18,} efectos de medicamentos en los parásitos ^19, micoparasitismo y antibiosis ^{20, 21,} malformación crecimiento del ^22, de desarrollo comparativo de individuos salvajes y mutantes ^23, y ciclos de vida completos ^24. Aunque los microscopios electrónicos de barrido ambiental (ESEM) ²⁵ pueden tener ventajas importantes para la observación de muestras biológicas húmedas en los procesos de crecimiento, material delicado todavía podrá verse comprometido incluso en la condición de bajo vacío del ESEM), y necesitan ser procesados adecuadamente para evitar la pérdida de valiosa observación morfológica.

En este trabajo, una revisión de los protocolos específicos para la observación SEM de tres diffSe presenta Erent tipos de muestras: meristemos florales, oomicetos (Saprolegnia), y material fúngico. Estos protocolos compilar la experiencia de nuestros estudios anteriores basados en SEM ^{26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,} donde se han encontrado dificultades específicas y soluciones alternativas. En el caso de la planta comparada estudios estructurales y de desarrollo, el uso de SEM se inició en la década de 1970 ^{34, 35,} y desde entonces, los investigadores descubrieron que ciertas características florales son más lábil que se pensaba anteriormente ^36. Reconstrucción del desarrollo floral implica la captura de todas las etapas entre los meristemos florales jóvenes y antesis. Para alcanzar este objetivo, es essential que la topografía de la muestra y la integridad de la pared celular no se vean comprometidos después de la fijación y la subsiguiente deshidratación. Meristemos florales jóvenes son particularmente vulnerables al colapso de la pared celular (Figuras 1a, 1b). Del mismo modo, las estructuras delicadas como nectarios, pétalos, estigma y esporangios requieren protocolos eficaces y no perjudiquen. Esta revisión resume un protocolo óptimo para mantener los tejidos jóvenes y delicadas intactas para obtener imágenes de SEM.

En el caso de los oomicetos (stramenopiles), uno de los grupos más diversos y generalizadas de los parásitos, con anfitriones que van desde los microbios y plantas de invertebrados y vertebrados ³⁷ - hay esporas que crecen y se desarrollan en un ambiente húmedo. Esta condición representa un desafío para la observación SEM porque las esporas necesitan un sustrato adecuado no es adecuado para protocolos estándar SEM. Entre los oomicetos, especies de Saprolegnia son de particular interés debido a que can causar reducciones severas en la acuicultura, la pesca y las poblaciones de anfibios ^38. Características micromorfológicos, tales como las espinas de gancho de los quistes, se han encontrado para ser útil para identificar especies de Saprolegnia, que es fundamental para establecer los controles de infección y los tratamientos potenciales ^39. Aquí, hay un protocolo experimental para comparar los patrones de crecimiento de la columna vertebral de los quistes en diferentes sustratos y manipular la muestra para la preparación de los Puntos Críticos de secador (CPD) y la posterior observación SEM.

En un tercer caso, hay hallazgos más interesantes que surgieron después de una inspección de las esporas de los hongos Phellorinia Herculanea f. f stellata. nova (Agaricales) ^31. Junto con las esporas, un grupo de células de vivero inesperados se identificó bajo el SEM. Con los protocolos tradicionales anteriores y material sin tratar, las células enfermera entró out se derrumbó por completo (Figura 1c). Más inferencias sobre tejidos particulares asociados a las esporas se pueden hacer con las modificaciones simples pero cruciales a los enfoques estándar descritos aquí (Figura 1D).

En esta revisión, hay protocolos detallados SEM que se pueden utilizar para hacer frente a diferentes problemas asociados con la observación SEM en las angiospermas, oomicetos, y Agaricales, tales como el colapso celular y la contracción del tejido meristemático, el crecimiento no óptima de las espinas del quiste, y la destrucción de tejidos efímeras, respectivamente.

Figura 1: Comparación de las muestras tratadas y sin (a, c) y con (b, d) el protocolo de la FAA-etanol-CPD. (A - b) yemas florales de Anacyclus clavatus, a mitad de desarrollo. Bud tratada con tetróxido de osmio ^{46 <}/ sup> (a) y Bud tratados con el protocolo de la FAA-CPD (b). (C - d) las células de la enfermera con esporas de Phellorinia Herculanea f. stellata. Secado muestras sin ningún tratamiento (c) y con el protocolo aquí descrito para Agaricales (d). Las esporas de color naranja. Escalas: (ab) 100 m, (cd) 50 micras. Las fotografías fueron tomadas por Y. Ruiz-León. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

NOTA: Este protocolo incluye seis secciones principales, tres dedicadas a organismos específicos (secciones 1-3), y tres que describen los procedimientos comunes a todos (4-6). Asteriscos (*) indican los pasos modificados por los experimentadores.

1. Estudios de Desarrollo y Estructuras de las Plantas completamente formado

1. Colección y fijación
   1. Si el material vegetal se recoge en un lugar sin acceso a una campana extractora de humos, introducir y sumergir el material en el 70% de etanol en tubos de centrífuga. Idealmente, sumergir el material después de 48 h en FAA (pasos 1.1.1-1.1.3) para evitar la deshidratación excesiva en el etanol. Si una campana de humos es accesible para el material vegetal, ignore este paso y continuar con 1.1.1.
   2. Preparar el fijador de formalina-ácido acético-alcohol (FAA) en una campana de gases equipado con un filtro de aldehído. Añadir 85 partes de 70% de etanol desnaturalizado, 10 partes de solución de formaldehído al 60%, y 5 partes de ácido acético glacial. Preparar la FAAjusto antes de la fijación del material, como su almacenamiento a largo plazo no se recomienda ^40.
   3. En virtud de la campana extractora de humos, verter el stock de la FAA en boca ancha individual y botellas de plástico a prueba de fugas. Utilice tantas botellas, ya que hay muestras disponibles, y crear etiquetas para identificación de la muestra.
   4. Seleccionar los meristemos florales o vegetales para fijar, asegurando que no son dañados por insectos, hongos o las condiciones climáticas extremas. Cortar las ramas, la eliminación de material no deseado, y depositar la muestra inmediatamente en la solución de la FAA.
   5. Después de 72-96 h, se vierte la FAA en un recipiente de plástico para la eliminación de químicos. Inmediatamente, lavar las muestras tres veces con etanol fresco 70% para eliminar cualquier FAA residual. material fijado se puede almacenar indefinidamente en etanol al 70%.
2. La disección y la deshidratación
   1. Diseccionar el material fijado en el 70% de etanol bajo el microscopio estereoscópico con unas pinzas ultra finas, needles, fórceps, cepillos y micro-escalpelos (el tamaño máximo del tejido debe estar alrededor de 1 cm ^3, o 2 cm de material plano). Diseccionar las muestras en una placa de Petri cubierta con etanol para evitar que los tejidos de secado. Utilice una placa de Petri con la base cubierta de silicona negro seco para ver mejor los tejidos blanco contrastantes.
   2. Poner el material disecado en recipientes de muestras para el secador de punto crítico (CPD, la figura 2a). En este punto, se sumergen los recipientes en la placa de Petri con un 70% de etanol, e incluir las etiquetas de identificación de la muestra (hecho con papel y lápiz). Para un secado más eficaz para su posterior manipulación, evitar mezclar las muestras de jóvenes y adultos en el mismo contenedor. *
   3. Ponga las tapas de los envases y depositarlos en tubos de centrífuga de plástico con un montón de etanol al 70%. Guarde los tubos durante la noche si el material no se procesa inmediatamente.
   4. Transferir el material diseccionado a través de la siguiente serie de etanols en frascos herméticos o tubos de centrífuga: 70%, 90%, 100%, y 100%. Deja las muestras en cada solución durante 1 h a menos. Mantener las muestras durante la noche en una solución de etanol 100%.
   5. La transferencia de los contenedores con el material a la CPD (sección 4).
3. Montaje y preparación de tejidos vegetales para la observación SEM
   1. Escribe el número de identificación de la muestra por debajo de los soportes de muestra SEM (es decir, trozos de aluminio). Cubrir la parte superior de los talones con cinta de doble cara. Coloque los talones en un soporte de la muestra (Figura 2b).
   2. Bajo un microscopio estereoscópico, abra cuidadosamente los contenedores que transporten las muestras pequeños y delicados ya secas en el CPD. Tenga en cuenta que después del tratamiento CPD, las muestras se vuelven más ligeros y sensibles a la electrostática. Cierre los contenedores una vez que las muestras han sido tomadas a cabo para evitar el polvo o impurezas.
   3. Poner las muestras en la superficie pegajosa de los talones, la planificación anticipada de la deseadaposición (una vez que las muestras tocan la superficie, es muy difícil de eliminar de ellos). No trate de realizar una disección importante en este punto; acaba de eliminar el tejido no deseado que es fácil de recoger. Para los estudios palinológicos, diseccionar las anteras y abrirlos para exponer el polen en los talones.
   4. Muestras puesto de largo (por ejemplo, 2 cm de longitud), tales como inflorescencias en la posición horizontal. Cuando sea posible, las muestras de orientar la misma estructura para polar, lateral y vistas inferiores. Deje suficiente espacio entre las muestras en el talón.
   5. Si las muestras no pueden ser procesadas de inmediato, mantenerlos protegidos durante la noche en un contenedor hermético con gel de sílice para evitar la rehidratación (Figura 2c) *. Cubra las muestras utilizando el dispositivo de recubrimiento por pulverización catódica y transferirlos a la SEM (secciones 5 y 6).

Figura 2: Herramientas para la muestra manipulatien el procesamiento y antes de la observación SEM. (A) recipiente de la muestra, de acero, con paredes perforadas para el etanol / _CO2 en la cámara de intercambio de CPD. (B) los trozos de acero dentro de un soporte de la muestra plástica. Contenedor (c) de vidrio utilizado para mantener las muestras protegidas de la humedad y el polvo. En la base, hay un compartimento para el gel de sílice. (D) Puntos Críticos de secadora. En la parte delantera, no son (de izquierda a derecha) el manómetro, el interruptor de encendido, el sistema de control de la temperatura, y el indicador de temperatura. Presión de trabajo habitual para el intercambio _{de CO2} etanol es de 60 bares (800 psi). En la parte superior, hay cuatro válvulas (controles de entrada, drenaje, ventilación y de escape) que flanquean la cámara de la muestra central. Las fotografías fueron tomadas por Y. Ruiz-León y MA Bello. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

< p class = "jove_title"> 2. Estudio del comportamiento del quiste de Saprolegnia (oomicetos) en diferentes superficies

1. El cultivo y la fijación de los quistes
   1. Preparar peptona y glucosa (PG-l) medios de comunicación ^{41 por} medio ^de D - (+) - glucosa (6 g) y peptona micológica (3 g) *. Añadir hasta 900 ml de agua del grifo y el autoclave 40 minutos a 121 ° C. Verter 50 ml de la solución A previamente tratado en autoclave (NaH ₂ PO _4, 0,13 M) y 50 ml de solución B (Na ₂ HPO _4, 0,13 M).
   2. De cultivos madre de cepas de Saprolegnia parasitica mantenidos en peptona, glucosa y medio de agar (PGA, que se prepara como PG-l pero la adición de 10 g de agar bacteriológico Europea a la glucosa y la peptona antes de autoclave), crecen colonias micelio en 0,5 ml de PG-l gotitas durante 24-48 horas a 20 ° C en placas de Petri. Inducir la esporulación mediante el lavado de los micelios con agua del grifo esterilizada en autoclave tres veces y su incubación durante 15 horas a 20 ° C= "xref"> ^{42, 43.}
   3. Recoger las zoosporas secundarios liberados pipeteando suavemente la parte superior de la suspensión y los acumularse en porciones de 1 ml. Agitar enérgicamente las zoosporas durante 30 s por agitación para producir quistes secundarios ^44.
   4. Para probar el crecimiento diferencial de los lomos de los quistes, por separado en cajas de Petri (p60), poner 0,5 ml de la suspensión de quiste secundario en diferentes superficies (es decir, carbono, rejillas de oro, y TEM cobre; escalas de salmón y merluza (anteriormente blanqueados); y cubreobjetos de vidrio) *. Incubar los quistes a 20 ° C durante 70 min, lo que favorece la fijación de los quistes a la superficie.
   5. Eliminar el líquido y añadir 0,5 ml de glutaraldehído al 2% a cada superficie para la fijación de los quistes. Mantener las muestras a temperatura ambiente en una campana de humos durante 1 h.
   6. Retire el glutaraldehído y deshidratar la muestra a través de una serie de etanol (30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% y 100%), la adición de 5 ml de cada solución de etanol durante 15 min. Una vez en la última solución de etanol al 100%, la muestra se puede almacenar durante un máximo de un mes en una placa de Petri sellada. En esta etapa, las muestras están listas para ser secado en el CPD.
   7. Transferir cuidadosamente las rejillas y las escamas de la placa de Petri con un soporte adecuado para el CPD (Sección 4). Para este paso, utilizar un soporte de rejilla de CPD o un soporte de la muestra de apilamiento, que mantienen las muestras separadas una de otra. Tome las rejillas y escalas con pinzas, teniendo en cuenta que los quistes deben estar hacia arriba en las redes de todo el tiempo. *
2. Montaje y preparación de muestras para la observación del quiste de la SEM
   1. Montar las rejillas y las escamas en los talones de aluminio, que previamente fueron cubiertos con cinta adhesiva de doble cara de carbono y etiquetados por debajo.
   2. Transferir las muestras al aparato de revestimiento por pulverización catódica (sección 5).
   3. Observar las muestras bajo la (sección 6) SEM.

3. Estudio de esporas de hongos del herbario de Herculanea Phellorinia bajo SEM

1. La rehidratación y deshidratación de esporas
   1. Envolver cada muestra con cuidado con papel de filtro, formando sobres marcados con lápiz ~ 0,5-1 cm ^2, teniendo cuidado de no aplastarlas. Sellar el papel de filtro con los clips de papel. La transferencia de las muestras envasadas en una placa de Petri y sumergirlos en 10 ml de agua para rehidratar los tejidos alrededor de las esporas.
   2. Inmediatamente poner las muestras en un horno de microondas (600 W durante aproximadamente 20 s). Retire el material una vez que el agua comienza a evaporarse, y deje que se enfríe a temperatura ambiente.
   3. Pasar las muestras a través de la siguiente serie de etanol: 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% y 100%. Dependiendo de la cantidad de muestras, utilice un vaso de precipitados o de centrifugación de tubos para este paso. Deja las muestras durante 15 minutos en cada solución.
   4. Colocar las muestras en el CPD (sección 4).
2. El montaje y la preparing esporas para la observación SEM
   1. Abrir los sobres. Verter las esporas en un trozo previamente preparado con cinta de doble cara. Alternativamente, recoger las esporas con la superficie pegajosa de los talones, teniendo cuidado de no aplastarlas *.
   2. Si las muestras contienen pocas esporas, además del paso anterior, cortar un pequeño trozo de la envolvente (~ 1 mm ²⁾ y colocarla en un nuevo trozo *.
   3. Coloque los tejidos en el dispositivo de recubrimiento por pulverización catódica (sección 5).
   4. Observe bajo la (sección 6) SEM.

4. El secado del material utilizando un secador de punto crítico (CPD, la figura 2d)

1. Utilice la CPD en un área ventilada y verifique que todas las válvulas de la máquina están cerrados. Compruebe si la cámara de muestra está vacía y limpia.
2. Conectar la máquina y verificar que la prueba del sistema de control de temperatura se lleva a cabo de forma automática. Si el DPC tiene un sistema de baño de refrigeración externo, compruebe los niveles de agua antes de cambiar iT el.
3. Siga las instrucciones del fabricante de la DPC específico utilizado para el etanol y _CO2 intercambio. Por razones de seguridad, llevar a cabo este paso bajo la supervisión de una persona capacitada para el uso de la máquina. Recuerde que está expuesta a cambios rápidos de presión, que podría estallar de forma violenta.
4. Sacar las muestras y continuar con el paso 1.3 si se trabaja con tejidos de la planta, paso 2.2 si se trabaja con oomicetos quistes, y los pasos 3.2 si se trabaja con esporas de hongos.

5. El recubrimiento de las muestras con oro utilizando el Sputter Coater (Figura 3a)

1. Compruebe el dispositivo de recubrimiento por pulverización catódica. Compruebe que el objetivo de cátodo de oro está en buenas condiciones. Utilice un paño sin pelusa empapado con etanol al 90% para limpiar las paredes de la cámara de vacío y la tapa de la cámara si es necesario.
2. Marcar el titular de pulverización catódica con números al lado de cada agujero talón para una mejor identificación de las muestras bajo el microscopio. Con cuidado, colocar los talones cargado con el samplES y asegurarlos. Usa una etapa espécimen planetario giratorio para asegurar un revestimiento uniforme sobre especímenes con superficies irregulares.
3. Siga las instrucciones del fabricante para ajustar la configuración como la distancia de trabajo, presión de gas operación (por ejemplo, 5 x 10 ^-1 - 7 x 10 ^-1 mbar) (por ejemplo, 30 mm.), El tiempo de pulverización catódica (por ejemplo, 50 s), espesor de la capa de oro (por ejemplo, 12 nm), la corriente (por ejemplo, 15 mA) y la tensión de alimentación (por ejemplo, 600 V) ^45.
4. Retire los talones y llevarlos a la (sección 6) SEM. Alternativamente, colocar los talones en un recipiente sellado con gel de sílice (Figura 2c).

Figura 3: recubridor por pulverización catódica (a) y microscopio electrónico de barrido (b). (A) Vista frontal de la cámara de vacío (izquierda), el gas VALVe, temporizador, de vacío, y los controles actuales. (B) Vista lateral de los componentes principales de SEM (de izquierda a derecha): la columna de vacío con la cámara de muestra, la pantalla del ordenador con los controles, y el monitor de la cámara. Las fotografías fueron tomadas por Y. Ruiz-León. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Observación bajo el microscopio electrónico de barrido (SEM, Figura 3b)

1. SEM puesta en marcha
   1. Siga las instrucciones del fabricante para iniciar y establecer el SEM, el ajuste de la altura de la muestra el diámetro de apertura objetivo (por ejemplo, para las plantas de 2 micras y para los hongos y oomicetos 4 micras), la tensión de servicio (por ejemplo, 15 kV).
   2. Comprobar la alineación correcta del sistema de haz de electrones y establecer el alineamiento axial y las estigmadores de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Ajuste tque la distancia de trabajo con el fin de obtener una profundidad adecuada de campo.
2. Captura de imagen
   1. Obtener una imagen enfocada de la muestra y utilizarla como punto de partida. Aumentar la ampliación cerca del nivel máximo y enfocar la imagen de nuevo. Elige zonas con irregularidades de la superficie tales como agujeros. corregir el astigmatismo y ajustar el contraste y el brillo óptimo.
   2. Capturar la imagen SEM con la alta resolución. Utilizar el detector de EEB si la imagen muestra que las muestras se cargan. De lo contrario, ajuste el detector de SE. Cambiar los detectores siguientes instrucciones del fabricante.

Resultados

Desarrollo floral y Fijación de Desarrollo y Estructuras de las Plantas completamente formado

Utilizando el protocolo FAA-CPD se describe aquí, tejidos de plantas jóvenes y maduras se fijan de manera óptima y se deshidrata para obtener imágenes de SEM. Procesos tales como el desarrollo floral se pueden reconstruir porque la topografía y la forma de las yemas no se ve distorsionada por las células contracción (Fig...

Discusión

Con respecto a los protocolos estándar SEM, los procedimientos que aquí se presentan son relativamente rápido, fácil de seguir, y metodologías de bajo costo. Dependiendo de la cantidad de muestras y en la facilidad de procesamiento, se tarda de cuatro a cinco días para adquirir imágenes de buena calidad. Incluidas las precauciones de seguridad adecuadas para el CPD y el funcionamiento SEM, los procedimientos son fáciles de manejar. Particular, se debe tener cuidado con formalina y el glutaraldehído (consulte lo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	No specific supplier		Skin irritation, eye irritation
aluminium stubs	Ted Pella, Inc.	16221	www.tedpella.com
Centrifuge tubes	No specific supplier
Critical Point Dryer	Polaron Quatum Technologies	CPD7501
D (+) Glucose	Merck	1,083,421,000
Double sided sellotape	No specific supplier
Ethanol absolute	No specific supplier.		Flammable
European bacteriological agar	Conda	1800.00	www.condalab.com
Filter paper	No specific supplier
Forceps	No specific supplier
Formalin 4%	No specific supplier.		Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable
Glass cover slips	No specific supplier
Glass hermetic container	No specific supplier
Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611  (L)	Dismadel S.L.	3336	www.dismadel.com
Mycological peptone	Conda	1922.00	www.condalab.com
needles	No specific supplier
Petri dishes	No specific supplier
Plastic containers	No specific supplier
Sample holder with lid  for the critical point dryer	Ted Pella, Inc.	4591	www.tedpella.com
scalpels	No specific supplier
Scanning Electron Microscope	Hitachi	S3000N
Software for SEM
Solution A: NaH2PO4
Solution B: Na2HPO4
Specimen holders	No specific supplier
Sputter coater	Balzers	SCD 004
Stereomicroscope	No specific supplier
Transmission Electron Microscope (TEM) grids	Electron Microscopy Sciences	G200 (Square Mesh)	www.emsdiassum.com
Tweezers	No specific supplier