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要約

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

要約

走査型電子顕微鏡（SEM）による観察のための生物学的サンプルの処理における一般的な問題は、細胞崩壊、湿式微環境からのサンプルを処理し、細胞の破壊を含みます。 SEM下の画像キャプチャのための試料処理における主な課題のいくつかを克服するため、ここで説明されているデリケートなサンプルを処理するために、特定のプロトコルを若い花の組織、卵菌類嚢胞、および例などの真菌胞子（ハラタケ目）を使用します。

花分裂組織FAA（ホルマリン酢酸 - アルコール）で固定し、臨界点乾燥機（CPD）で処理が崩壊セルラー壁や歪ん臓器が表示されませんでした。これらの結果は、花の開発の復興のために非常に重要です。このようなグルタルアルデヒド固定卵菌類嚢胞等の湿式微小環境からのサンプルの同様のCPDに基づく治療、suコマンドの異なる種類の診断特性（ 例えば、嚢胞棘）の差動成長をテストすることが最適ですbstrates。カビの胞子に取り付けられたナース細胞の破壊を再水和、脱水、及びCPD処理、これらの細胞のさらなる機能研究のための重要なステップの後に回避されました。

ここでの詳細なプロトコルは、成長プロセスを再構築し、診断特性を研究するために、良好な品質の画像を取得するための低コストで迅速な代替物を表します。

概要

生物学では、走査型電子顕微鏡（SEM）の使用は、構造進化の研究、比較形態、器官の発達、及び集団又は種1の特徴に拡張されています。微細構造体の、その2次元図では、このような微細形態や系統などの分野は、20 世紀後半以降のSEM技術の進歩から利益を得ました。例えば、1970年代にスパッタコーティング方法論の導入は、このような非導電性組織2、3のイメージングを高める茎頂や花などの繊細な素材の可能な観察を行いました。 SEMは、高真空環境4の形状を再現するために、試料の表面から放出された電子を使用します。

SEMを含む研究は、構造的な文字の推論とgrowtの復興の両方に重点を置いています時間プロセス。広範囲の生物の分類と系統に関連する新しい構造的な文字は、SEM観察から発見されています。例えば、このような木材5、柱頭の多様性6、蜜腺と花の形態7、8の衣をまとったピットなどの種の診断またはsupraspecific分類ごとに使用される植物の形質、トライコームの詳細9、および花粉粒10、11は 、適切にせずに可視化することはできませんSEM。従来のSEMで成功観察はまた、長時間のホルマリン固定生物12と植物植物標本13のために達成されています。

一方、SEMを用いた成長プロセスの再構成の研究は、このような臓器の発達14、infeなどのトピックの広い範囲を含みます細菌15、植物の根生理学16、寄生虫ホスト接続機構17、18、寄生虫19、mycoparasitismおよび抗生20、21、成長奇形22、野生および変異個体23の比較開発、およびライフサイクル全体を上薬の効果によって誘発されるctions 24。環境走査型電子顕微鏡（ESEM）25は、成長プロセスにおいて湿潤生体試料の観察に重要な利点を有していてもよいが、繊細な材料が依然としてもESEM）の低真空状態で妥協し、損失を回避するために適切に処理する必要があることができます貴重な形態学的観察。

本論文では、3差分のSEM観察のための特定のプロトコルのレビューではサンプルのerent種類が提示されている：花の分裂組織、卵菌類（ ミズカビ ）、および真菌物質を。これらのプロトコルは、特定の困難や代替案が見出されている我々の以前のSEMベースの研究26、27、28、29、30、31、32、33、の経験をコンパイルします。植物の比較発達と構造研究の場合には、SEMの使用は、1970年代34、35で開始して以来、研究者は、特定の花の特徴は、以前に36を考えられていたよりも不安定であることを発見しました。花の開発の復興は、若い花の分裂組織と開花間のすべての段階の捕獲を伴います。この目的を達するためには、ESSEあります試料のトポグラフィー及び細胞壁の完全性は、固定およびその後の脱水後に損なわれないことをntial。若い花分裂組織の細胞壁の崩壊に対して特に脆弱である（ 図1A、1B）。同様に、蜜腺、花弁、柱頭および胞子嚢のような繊細な構造が効果的とundamagingプロトコルを必要とします。このレビューは、SEMイメージングのためそのまま若くて繊細な組織を維持するための最適なプロトコルをまとめたものです。

卵菌類の微生物や植物からの無脊椎動物と脊椎動物37に至るまでのホストと寄生虫の最も多様かつ広範なグループの（ストラメノパイル） -オンの場合、 -成長し、湿潤環境での開発胞子があります。胞子は、標準的なSEMプロトコルには適していない適切な基板を必要とするので、この条件は、SEM観察のための課題です。彼らはcaのため卵菌類のうち、 サプロレグニアの種は特に重要ですnは水産養殖、漁業、および両生類の個体数38で深刻な減少を引き起こします。そのような嚢胞のフック棘などの微細形態の特徴は、感染の制御および潜在的な治療法39を確立することが基本であるサプロレグニア、の種を同定するのに有用であることが見出されています。ここでは、異なる基板上の嚢胞の脊椎の成長パターンを比較し、臨界点乾燥（CPD）の調製とその後のSEM観察用の試料を操作するための実験プロトコルがあります。

第三のケースでは、真菌のPhelloriniaのherculanea fの胞子の検査後に思い付いた興味深い調査結果があります。 stellataの F。新星（ハラタケ目）31。一緒に胞子で、予想外の保育園の細胞のグループがSEMで確認されました。以前の伝統的なプロトコルおよび未処理材料で、ナース細胞は、OUを来ましたtは完全に（ 図1c）を崩壊しました。胞子に関連する特定の組織についてのさらなる推論は、ここで説明する（ 図1D）は、標準的なアプローチにシンプルだが非常に重要な変更を加えて行うことができます。

このレビューでは、このような細胞の崩壊と分裂組織の縮小、嚢胞棘の非最適な成長、および破壊など、さまざまな被子植物におけるSEM観察に関連する問題、卵菌類、およびハラタケ目に対処するために使用することができ、詳細なSEMプロトコルが存在し、それぞれはかない組織。

figure-introduction-3624
図1（C）なしで（B、D）プロトコルFAAエタノール-CPDで処理したサンプルの比較。 （ - b）は Anacyclusのclavatus、ミッド開発の花蕾。バドは<四酸化オスミウム46で処理されました/ SUP>（a）およびFAA-CPDプロトコル（B）で処理した出芽。 （C - D）Phelloriniaのherculanea fの胞子とナース細胞。 stellata。任意の治療（C）なしで、ここハラタケ目（d）に記載のプロトコルを用いてサンプルを乾燥させました。オレンジ色で胞子。スケール：（AB）が100μm、（CD）50μmです。写真はY.ルイス・レオンによって撮影されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

プロトコル

注：このプロトコルは、すべての（4-6）に一般的な手順を記述した特定の生物（セクション1-3）、および三から三献身的な6つの主要なセクションが含まれています。アスタリスク（*）は、実験者によって変更された手順を示しています。

1.開発の研究と完全に形成されたプラントの構造

  1. コレクションと固定
    1. 植物材料は、ドラフトチャンバーへのアクセスなしで所定の位置に収集されている場合は、導入して遠心分離管に70％エタノールで材料を浸します。理想的には、エタノールに過度の脱水を避けるためにFAAで48時間（ステップ1.1.1-1.1.3）後の材料を浸します。ドラフトチャンバーは、植物材料からアクセス可能である場合は、この手順を無視し、1.1.1に進みます。
    2. アルデヒドフィルタを装着した通風室にホルマリン、酢酸、アルコール（FAA）固定液を準備します。 70％変性エタノール85部、60％ホルムアルデヒド水溶液10部、および氷酢酸の5部を加えます。 FAAの準備ちょうどその長期保存として、材料を固定する前に、40をお勧めしません。
    3. ドラフトチャンバーの下では、個々の広口及び漏れ防止プラスチックボトルにFAAの株式を注ぎます。利用可能なサンプルと同数のボトルを使用し、試料を識別するためのラベルを作成します。
    4. 彼らは昆虫、真菌、または極端な気象条件によって損傷されていないことを確認して、修正するために花のや栄養分裂組織を選択します。不要な材料を除去、枝を切断し、FAA溶液中ですぐにサンプルを堆積させます。
    5. 72〜96時間後、化学的処理のためのプラスチック容器にFAAを注ぎます。直ちに、残留FAAを除去するために、新鮮な70％エタノールで試料を3回洗浄します。固定された物質を70％エタノール中で無期限に保存することができます。
  2. 解剖と脱水
    1. ね、超微細ピンセットを用いて、実体顕微鏡下で70％エタノールで固定材料を解剖edles、鉗子、ブラシ、およびマイクロメス（組織の最大サイズは約1 cm 3であり、または平坦な材料は2 cmでなければなりません）。乾燥から組織を防止するために、エタノールで覆われたペトリ皿にサンプルを分析。より良い対照的な白の組織を見るために、乾燥ブラックシリコンで覆われたベースでペトリ皿を使用してください。
    2. 臨界点乾燥機（CPD、 図2a）のための検体容器内の解剖材料を入れてください。この時点で、70％エタノールでペトリ皿に容器を浸漬し、（紙と鉛筆を用いて作られた）サンプル識別ラベルを含みます。さらなる操作のためのより効果的な乾燥のために、同じ容器に若く、成熟したサンプルを混合しないようにしてください。*
    3. コンテナに蓋を入れて、70％エタノールをたっぷりとプラスチック製遠心管にそれらを堆積させます。材料はすぐに処理されていない場合は一晩チューブを保管してください。
    4. 以下のエタノールセリエを通して解剖材料を転送密閉瓶または遠心チューブ中の70％、90％、100％、100％。少なくとも1時間のために、各溶液中の試料を残します。 100％エタノール溶液中で一晩サンプルを保管してください。
    5. CPD（セクション4）の材料でコンテナを転送します。
  3. SEM観察のための植物組織をマウントと準備
    1. SEM試料ホルダー（ すなわち、アルミスタブ）の下にサンプル識別番号を書きます。両面テープでスタブの上部をカバーしています。試料ホルダー（ 図2b）にスタブを配置します。
    2. 実体顕微鏡下では、慎重に既にCPD中で乾燥させ、若くて繊細なサンプルを運ぶコンテナを開きます。 CPD処理後、試料は軽く、静電気に敏感になることに注意してください。サンプルは、ほこりや不純物を避けるために取り出された後、容器を閉じます。
    3. 先に希望を計画し、スタブの粘着性表面上にサンプルを置きます位置（試料が表面に触れると、それらを削除することは非常に困難です）。この時点で、主要な解剖を運ぶためにしようとしないでください。ただ拾うのは簡単である不要な組織を除去します。花粉分析研究のために、葯を分析し、スタブに花粉を公開するためにそれらを開きます。
    4. このような水平位置にある花序として入れて長いサンプル（ 例えば、長さ2cm）。可能な場合、極性、側についても同様の構造、および底面図の配向サンプル。スタブ上のサンプル間に十分なスペースを入れてください。
    5. サンプルはすぐに処理することができない場合は、*再水和（ 図2c）を避けるためには、シリカゲルと密閉容器中で一晩保護しておきます。コートスパッタコーターを使用し、SEMに転送サンプル（セクション5及び6）。

figure-protocol-2416
図2：サンプルmanipulatiためのツール上およびSEM観察の前処理。 CPDチャンバ内のエタノール/ CO 2交換のための穴のあいた壁を有する（a）は、スチール製の試料容器。 （b）はプラスチック製試料ホルダー内のスチールスタブ。 （C）ガラス容器は、湿気や埃から保護し、サンプルを保持するために使用されます。基部には、シリカゲルのためのコンパートメントがあります。 （d）の臨界点乾燥機。前に、圧力計、電源スイッチ、温度制御システム、および温度表示（左から右へ）があります。 CO 2 -エタノール交換のための通常の作動圧力は、60バール（800 psi）です。上部では、中央の試料室に隣接する4バルブ（入口、ドレイン、換気、排気コントロール）があります。写真はY.ルイス・レオンとMAベロによって撮影されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

< Pクラス= "jove_title"> 2。異なる面にミズカビ （卵菌類）の嚢胞挙動の研究

  1. 嚢胞の成長と定着
    1. （+） - -グルコース（6グラム）と菌学的ペプトン（3グラム）*ペプトンとグルコース（PG-L）Dを使用してメディア41を準備します。水道水の900ミリリットルまで追加し、121℃で40分間オートクレーブ。あらかじめオートクレーブ溶液Aの50ミリリットル（のNaH 2 PO 4、0.13 M）、溶液Bの50ミリリットルし（Na 2 HPO 4、0.13 M）を注ぎます。
    2. サプロレグニアパラシティカの株のストック培養物から0.5 mLの菌糸のコロニーを育て、ペプトン、グルコース、寒天培地（PG-リットルのように調製したが、グルコース、オートクレーブ前ペプトンにヨーロッパの細菌学的寒天10gを加えているPGA）上に維持ペトリ皿中で20℃で24〜48時間、PG-L滴。オートクレーブ水道水で3回菌糸体を洗浄し、20℃で15時間、それらをインキュベートすることによって胞子形成を誘導します= "外部参照"> 42、43。
    3. 優しくサスペンションの上部をピペッティングすることにより放出される二次遊走子を収集し、1 mLの部分でそれらをプール。二次嚢胞44を生成するためにボルテックスすることによって積極的に30秒のための遊走子を攪拌。
    4. 嚢胞の棘の差動成長をテストするには、別々のペトリ皿（P60）に、異なる表面（ すなわち、炭素、金、銅TEMグリッド上に二次嚢胞懸濁液0.5 mLのを入れて、サケやメルルーサ魚の鱗（以前漂白）、およびガラスカバースリップ）*。表面に嚢胞の付着を有利に70分、20℃で嚢胞をインキュベートします。
    5. 液体を除去し、嚢胞の固定のために各表面に2％グルタルアルデヒドの0.5 mLを加え。 1時間のドラフトチャンバー下、室温でサンプルを保管してください。
    6. グルタルアルデヒドを除去し、エタノール系列（30％、40％、50％、60％、70％、80％を通して試料を脱水、90％、100％、100％）、15分間の各エタノール溶液5mLを加えます。最後に100％エタノール溶液で一度、サンプルを密閉ペトリ皿内月まで保存することができます。この段階では、サンプルは、CPD中で乾燥する準備ができています。
    7. 慎重CPD（第4節）に適したホルダーにペトリ皿からグリッドとスケールを転送します。この工程のために、互いから分離されたサンプルを保持CPDグリッドホルダーまたは積層試料ホルダを使用します。嚢胞はすべての時間のグリッド上で上向きにする必要があることを念頭に置いて、ピンセットでグリッドとスケールを取ります。*
  2. SEM観察用のマウントと準備嚢胞サンプル
    1. 以前両面カーボンテープで覆われ、その下に標識したアルミニウムスタブ上のグリッドとスケールをマウントします。
    2. スパッタコーター（セクション5）にサンプルを転送します。
    3. SEM（セクション6）の下でサンプルを観察します。

3。 SEM下Phelloriniaのherculaneaのハーバリウム真菌胞子の研究

  1. 胞子の再水和と脱水
    1. 〜0.5〜1センチメートル2、それらを粉砕しないように注意しながら鉛筆で標識された封筒を形成し、ろ紙で慎重に各サンプルを包みます。ペーパークリップで濾紙をシール。ペトリ皿にパックされたサンプルを移し、胞子周囲の組織を再水和するために10mLの水でそれらを浸します。
    2. すぐにマイクロ波（約20秒間600 W）でサンプルを置きます。水が蒸発し始めたら、材料を除去し、それを室温で冷却することができます。
    3. 以下エタノールシリーズを通して試料を通過する30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％、100％。サンプルの量に応じて、このステップのためにビーカーや遠心管を使用しています。各溶液中で15分間サンプルを残します。
    4. CPD（セクション4）にサンプルを置きます。
  2. 取付けおよびpSEM観察のための胞子をreparing
    1. 封筒を開きます。両面テープで予め用意スタブに胞子を注ぎます。また、*それらを粉砕しないように注意しながら、スタブの粘着性表面に胞子を収集します。
    2. サンプルは、いくつかの胞子が含まれている場合は、前のステップに加えて、エンベロープ（〜1ミリメートル2）の小片をカットして、新しいスタブ*上に置きます。
    3. スパッタコーター（第5節）に組織を置きます。
    4. SEM（セクション6）の下で観察します。

臨界点乾燥機を使用した素材の4乾燥（CPD、図2d）

  1. 換気された場所でCPDを使用して、マシンのすべてのバルブが閉じていることを確認します。試料室が空であり、汚れていないか確認してください。
  2. マシンのスイッチをオンにし、温度制御システムの試験は自動的に行われることを確認します。 CPDは、外部冷凍浴システムを持っている場合は、私を切り替える前に、水のレベルを確認上のT。
  3. エタノールとCO 2の交換に使用される特定のCPDの製造元の指示に従ってください。安全のため、機械の使用のために訓練誰かの監督の下で、この手順を続けていきます。それは急激な圧力変化にさらされていることを忘れないでください、それは激しく吹き消すことができます。
  4. サンプルを取り出し、植物組織、ステップ2.2で作業する場合は卵菌類嚢胞を扱う場合は、手順1.3を継続し、カビの胞子で作業している場合3.2を繰り返します。

5.スパッターコーター（図3a）を使用したゴールドでサンプルをコーティング

  1. スパッタコーターを確認してください。金陰極ターゲットが良好な状態であることを確認します。必要に応じて、真空チャンバと、チャンバ蓋の壁をきれいにするために90％エタノールでびっしょり糸くずの出ない布を使用してください。
  2. 顕微鏡下での試料のさらなる識別のための各スタブ穴の横に番号がスパッタホルダーをマークします。慎重に、samplを搭載したスタブを配置エスと固定します。不規則な表面を持つ標本上に均一なコーティングを確実にするために、回転式の遊星試料ステージを使用してください。
  3. このような作動距離として設定を調整するには、製造元の指示に従って、動作ガス圧（ 例えば、×10 -1 5から7×10 -1ミリバール）（ 例えば 、30ミリメートル。）、スパッタ時間（ 例えば、50秒）、金層（ 例えば、12 nm）の電流（ 例えば 、15ミリアンペア）と電圧源（ 例えば、600 V）45の厚さ。
  4. スタブを削除し、SEM（セクション6）にそれらを取ります。また、シリカゲル（ 図2c）と密閉容器内にスタブを配置します。

figure-protocol-6743
図3：スパッタコーター（a）および走査型電子顕微鏡（B）。 （a）は 、真空チャンバ（左）の正面図、ガスVALV電子、タイマー、真空、および現在のコントロール。 （b）は （左から右へ）SEMの主要な構成要素の側面図：試料室と真空カラム、コントロールとコンピュータ画面、および室のモニターを。写真はY.ルイス・レオンによって撮影されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

走査型電子顕微鏡（SEM、図3b）の下で6観察

  1. SEMは起動します
    1. サンプル高対物絞り径（ 例えば、植物が2μmおよび菌類と卵菌類4μmのため）、動作電圧（ 例えば、15 kVの）を調整、SEMを起動し、設定する製造元の指示に従ってください。
    2. 電子ビームシステムの正しい配置を確認し、製造業者の指示に従って軸方向に整列し、スティグメータを設定します。トンを調整彼は、フィールドの十分な深さを得るために、作動距離。
  2. 画像キャプチャ
    1. サンプルの合焦画像を取得し、出発点としてそれを使用しています。最大レベルに近い倍率を増やして、再び画像の焦点を合わせます。このような穴のような表面の凹凸のある地域を選択してください。乱視を矯正すると、最適なコントラストと明るさを調整します。
    2. 高解像度でのSEM画像をキャプチャします。画像はサンプルが帯電していることを示していた場合にBSE検出器を使用してください。それ以外の場合は、SE検出器を設定します。製造者の指示に従って検出器を変更します。

結果

花の開発と開発の固定と完全に形成されたプラントの構造

ここで説明FAA-CPDのプロトコルを使用して、若い成熟した植物組織を最適に固定され、SEMイメージングのために脱水されています。芽の地形や形状が収縮細胞（ 図1B、1D、図4A-F）によって歪まされていないので、このような花の発達等の処理を再構成す?...

ディスカッション

標準的なSEMプロトコルに関しては、ここで紹介する手順は、比較的、迅速な追随しやすく、かつ低コストの方法論を含みます。試料の量と処理の容易さに応じて、良好な品質の画像を取得するために4〜5日かかります。 CPDとSEMの操作のための適切な安全措置を含め、手続きは、取り扱いが容易です。特に注意が（1.1.3およびプロトコルの2.1.5へのステップ1.1.1を参照）、ホルマリンやグルタル?...

開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

このプロジェクトは、このマニュアルでは、唯一の著者の見解を反映し、欧州委員会は、情報を挙げることができる任意の使用のための責任を負うことはできません付与契約番号634429.の下で、欧州連合（EU）のホライゾン2020年研究と技術革新プログラムから資金提供を受けていますその中に含まれます。我々はまた、レアルハルディンボタニコ、CSIC製の資金拠出を認めます。 SRはサプロレグニアで彼女の研究をサポートするため、欧州連合（EU）[ITN-SAPRO-238550]に感謝しています。我々はまた、親切Phelloriniaのherculanea画像を提供し、処理サンプルについてB.プエヨ（図5）のためのフランシスコカロンジュに感謝したいと思います。すべての画像はマドリードでレアルハルディンボタニコ-CSICのSEMサービスによって撮影されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidNo specific supplierSkin irritation, eye irritation
aluminium stubsTed Pella, Inc.16221www.tedpella.com
Centrifuge tubesNo specific supplier
Critical Point DryerPolaron Quatum TechnologiesCPD7501
D-(+)-GlucoseMerck1,083,421,000
Double sided sellotapeNo specific supplier
Ethanol absoluteNo specific supplierFlammable
European bacteriological agarConda1800.00www.condalab.com
Filter paperNo specific supplier
ForcepsNo specific supplier
Formalin 4%No specific supplierHarmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable
Glass cover slipsNo specific supplier
Glass hermetic container No specific supplier
Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611  (L)Dismadel S.L.3336www.dismadel.com
Mycological peptoneConda1922.00www.condalab.com
needlesNo specific supplier
Petri dishesNo specific supplier
Plastic containersNo specific supplier
Sample holder with lid  for the critical point dryer Ted Pella, Inc.4591www.tedpella.com
scalpelsNo specific supplier
Scanning Electron MicroscopeHitachiS3000N
Software for SEM
Solution A: NaH2PO4
Solution B: Na2HPO4
Specimen holdersNo specific supplier
Sputter coaterBalzersSCD 004
StereomicroscopeNo specific supplier
Transmission Electron Microscope (TEM) gridsElectron Microscopy SciencesG200 (Square Mesh)www.emsdiassum.com
TweezersNo specific supplier

参考文献

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