تصور التغيرات دورة الخلية وتحديد في النواة في ما بعد الولادة العضلية

Summary

To distinguish cell division from cell cycle variations in cardiomyocytes, we present protocols using two transgenic mouse lines: Myh6-H2B-mCh transgenic mice, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and CAG-eGFP-anillin mice, for distinguishing cell division from cell cycle variations.

Abstract

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and cytokinesis) and acytokinetic mitosis (karyokinesis but no cytokinesis). Such atypical cell cycle variations result in polyploid and multinucleated cells rather than in cell division. Therefore, to determine cardiac turnover and regeneration, it is of crucial importance to correctly identify cardiomyocyte nuclei, the number of nuclei per cell, and their cell cycle status. This is especially true for the use of nuclear markers for identifying cell cycle activity, such as thymidine analogues Ki-67, PCNA, or pHH3. Here, we present methods for recognizing cardiomyocytes and their nuclearity and for determining their cell cycle activity. We use two published transgenic systems: the Myh6-H2B-mCh transgenic mouse line, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and the CAG-eGFP-anillin mouse line, for distinguishing cell division from cell cycle variations. Combined together, these two systems ease the study of cardiac regeneration and plasticity.

Introduction

التحديد الصحيح للنوى cardiomyocyte ووضع دورة الخلية هي ذات أهمية حاسمة لتحديد قيمة التداول عضلة القلب والتجدد. هذا ينطبق بشكل خاص على استخدام علامات النووية، مثل pHH3، كي-67، أو النظير ثيميدين، لتحديد النشاط دورة الخلية هذا. كما أن قدرة التكاثري العضلية الثدييات الكبار صغيرة جدا ^1، هوية مزورة من نواة إيجابية لعلامة انتشار نواة cardiomyocyte يمكن أن تحدث فرقا حاسما في نتائج فحص انتشار الأسلحة النووية. وعلاوة على ذلك، العضلية عرضة للتغيرات في دورة الخلية، مثل تنسخ داخلي والانقسام acytokinetic، مما يؤدي في الخلايا المتعددة الصبغيات ومتعددة النوى وليس في انقسام الخلايا. تحقيقا لهذه الغاية، تفسير تلوين الأجسام المضادة ضد علامات دورة الخلية المشتركة ليست قاطعة في جميع الحالات.

هنا، فإننا نقدم طرق ل-forwa على التوالي اعتراف طريق الخلايا العضلية الماوس وnuclearity في الخلايا المعزولة المحلية وأقسام الأنسجة السميكة على بعد الولادة وتعليم الكبار مراحل من تحديد لا لبس فيه من النواة. لهذا الغرض، تم استخدام خط الماوس المعدلة وراثيا مع التعبير عن cardiomyocyte معين من البروتين الانصهار تتكون من H2B هيستون البشري وmCherry تحت سيطرة المروج Myh6 (Myh6-H2B-صحة الأم والطفل) ^2. التهجين هذا الخط الفأر مع خط الماوس مؤشر انتشار المعدلة وراثيا، والتي التعبير عن بروتين الانصهار EGFP-anillin تحت السيطرة في كل مكان المروج الأكتين الدجاج مع محسن CMV (CAG-EGFP-anillin)، يسمح لل تحديد الوضع دورة الخلية. وأعرب anillin البروتين السقالات على وجه التحديد في الخلية دورة الخلية النشطة ^3، والتفضيلية توطين التحت خلوية لها خلال دورة الخلية يسمح ليعيش تتبع تقدم دورة الخلية مع دقة عالية من M-المرحلةEF "> 4. ولذلك، فإن الفئران المعدلة وراثيا مزدوج يمكن استخدامها للتمييز بين المتكاثرة العضلية وتلك التي تخضع لتغيرات دورة الخلية. وهذا يثبت مفيدة بشكل خاص في الكشف عن المواد يحفز تكاثر في المختبر.

Protocol

وكانت جميع الإجراءات من هذا البروتوكول تنطوي على الحيوانات وفقا للمعايير الأخلاقية من جامعة بون وامتثلت للمبادئ التوجيهية من التوجيه 2010/63 / الاتحاد الأوروبي والبرلمان الأوروبي بشأن حماية الحيوانات المستخدمة لأغراض علمية.

1. في المختبر تصور آخر دورة الخلية في ما بعد الولادة العضلية

1. بعد الولادة التفكك cardiomyocyte
   1. استعدادات ما قبل التجريبية
      1. إعداد وسائل الإعلام ثقافة (IMDM، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين، 1٪ الأحماض الأمينية غير الأساسية، 0.1٪ β-المركابتويثانول)؛ المتوسطة 1: إضافة FCS إلى 2٪، متوسط ​​2: إضافة FCS إلى 20٪.
      2. معطف طبق ثقافة 96-جيدا (منطقة نصف النمو: 15 ملم ²⁾ مع الجيلاتين 0.1٪ في حل برنامج تلفزيوني.
   2. تشريح القلب
      1. إعداد طبق بيتري مع 15 مل من برنامج تلفزيوني وتخزينها على الجليد. تعقيم اثنين من ملاقط ومقصات صغيرة من خلال وضعها في جاف الزجاج حبة معقمة.
      2. التضحية الفئران المعدلة وراثيا حديثي الولادة (CAG-EGFP-anillin / Myh6-H2B-صحة الأم والطفل) من خلال قطع الرأس. فتح القفص الصدري، تشريح القلب بها، كما هو موضح في Ehler وآخرون. 2013 (J فيس التصدير؛ (79): 50154 دوى: 10.3791 / 50154)، وتحويلها إلى برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. الانتقال إلى الماوس المقبل.
      3. في حالة استخدام غير متماثل زوجا فقط، التعرف على القلوب المعدلة وراثيا مع المجهر الفلورسنت. وضع قلوب في برنامج تلفزيوني تحت المجهر الفلورسنت. تحقق للتعبير EGFP-anillin (مثال: 488 نانومتر. م .: 509 نانومتر) وH2B-صحة الأم والطفل التعبير (مثال: 587 نانومتر. م .: 610 نانومتر) مع مجموعات مرشح المناسبة.
   3. العزلة Cardiomyocyte
      1. فصل قلوب اختيار باستخدام الأطفال حديثي الولادة عدة التفكك القلب. احتضان مزيج انزيم 1 عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. للحصول على 1 مل من مزيج انزيم النهائي، إضافة 945 ميكرولتر من مزيج انزيم 1-55 ميكرولتر من مزيج انزيم 2.
      2. نقل ما يصل إلى 4 قلوب من P1 - الفئران P3 أو ما يصل إلى 2 قلوب من P4 - الفئران P6 لص 1.5 ملأنبوب eaction تحتوي على 1 مل من مزيج انزيم وقطع القلب إلى قطع صغيرة مع مقص. نقل الحل في 15 أنابيب رد فعل مل.
      3. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. لتحقيق أقصى قدر من الاتصال بين الأنسجة والأنزيمات، ووضع أنبوب 15 مل أفقيا تقريبا في الحاضنة. مزيج من قبل pipetting 5-10 مرات صعودا وهبوطا مع ماصة 5 مل. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
      4. إضافة 7.5 مل من المتوسط ​​2 (20٪ FCS) لوقف رد فعل الانزيم. تصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر. شطف مصفاة الخلية مع 3 مل من المتوسط ​​2.
      5. الطرد المركزي تعليق خلية في 300 × ز لمدة 15 دقيقة وتجاهل طاف. Resuspend وبيليه في 500 ميكرولتر من المتوسطة 1؛ ليس مطلوبا الأحمر تحلل خلايا الدم لمزيد من التجارب. الماصة 10 ميكرولتر من تعليق خلية في غرفة عد الخلايا وتحديد عدد الخلايا.
      6. لوحة 96-جيدا: البذور 10000 خلايا لكل بئر في 120 ميليلتر من متوسط ​​1 (2٪ FCS). مكانالخلايا في حاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO _2)، والشروع فورا في ترنسفكأيشن.
2. ترنسفكأيشن العضلية حديثي الولادة مع الرناوات siRNAs أو miRNAs
   1. مسح مقعد مع ريبونوكلياز الحل لإزالة التلوث لإزالة RNases. تنظيف المواد التالية مع ريبونوكلياز الحل إزالة التلوث: 10 ميكرولتر، 100 ميكرولتر، و 200 ميكرولتر الماصات والجليد مربع. قسامات ذوبان الجليد سيرنا الأوراق المالية (100 ميكرومتر) على الجليد.
   2. إعداد مخزون عمل 2 ميكرومتر سي / miRNAs في انخفاض سيرم (98 ميكرولتر من انخفاض سيرم + 2 ميكرولتر من سيرنا 100 ميكرومتر الأسهم). يجب استخدام الأوراق المالية العاملة في نفس اليوم. لا ينصح التجمد.
   3. إضافة 4 ميكرولتر من الأوراق المالية 2 ميكرومتر إلى 6 ميكرولتر من انخفاض سيرم لأنبوب رد فعل 0،5 مل (مقدار واحد 96-جيدا، الاشتراكية النهائي / تركيز ميرنا في 140 ميكرولتر: ~ 57 نانومتر). اختيار حجم مناسب لعدد من الآبار لتكون transfected مع الاشتراكية معين / ميرنا.
   4. إعداد مزيج الرئيسي كاشف ترنسفكأيشن. استخدام 10 ميكرولتر (0.6 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن + 9.4 ميكرولتر من انخفاض سيرم) لكل بئر (مجموع 96 بئرا).
   5. إضافة الاشتراكية / ميرنا مزيج إلى المزيج ترنسفكأيشن الكاشف. احتضان لمدة 5 دقائق على الجليد. الماصة 20 ميكرولتر في كل بئر. احتضان الخلايا لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية و CO ₂ 5٪ ثم قم باستبدال المتوسطة في كل بئر مع 120 ميكرولتر من المتوسطة 1. بعد 24 ساعة أو أكثر، والمضي قدما في تثبيت وتلوين المناعي.
3. تثبيت والمناعي تلطيخ
   1. إزالة المتوسطة وغسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. تغطية الخلايا مع 4٪ محلول الفورمالديهايد لمدة 20 دقيقة. خلع الحل الفورمالديهايد وغسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، ومن ثم تغطيتها مع برنامج تلفزيوني للتخزين أو الشروع في المناعية.
   2. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية (تركيز وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) في 0.2٪ تريتون-X و 5٪ المصل حمار لمدة 2 ساعة على الأقل.إذا تلطيخ لα-actinin (التخفيف 1: 400، وحيدة النسيلة المضادة للα-actinin)، وصمة عار بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
   3. إزالة الأجسام المضادة الأولية ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. تمييع الضد الثانوية في هويشت محلول 1: 400، واحتضان لمدة 1 ساعة على RT محمية من الضوء. إزالة الأجسام المضادة، ويغسل مع برنامج تلفزيوني 3 مرات، وتغطية الخلايا مع برنامج تلفزيوني للتخزين عند 4 درجات مئوية.
4. متحد البؤر المجهري الفيديو
   1. استخدام المجهر متحد البؤر لاقتناء الصورة. فتح برامج التصوير. فتح "إعدادات A1plus" وحدد المربعات لCH1، CH2، وCH3. تعيين CH1 إلى دابي، CH2 إلى EGFP، CH3 لو Cy3، وCH4 إلى Cy4 بالضغط على القائمة المنسدلة.
      1. لكل قناة، انقر على HV وتعيينه إلى 80 باستخدام شريط التمرير. تعيين لإزاحة 0 باستخدام القضبان انزلاق، وانقر على زر "الوطن" لتعيين الثقب إلى موقف البيت. تعيين حجم المسح إلى 1024 X 1024 بالضغط على القائمة المنسدلة.
      2. انقر الأمثل لفتح"XYZ الحجم الإعداد" نافذة. خانة "الكمال فوكسل" تحت عنوان "الخطوة المقترحة (ض)". زيادة كثافة الليزر حتى الصورة ليست قليلة التعرض ولا تعريض.
         ملاحظة: على سبيل المثال، CH1 (دابي): 16٪، CH2 (EGFP): 12٪، CH3 (و Cy3): 100٪، CH4 (Cy5): 1٪. تعيين أوفست لجميع القنوات إلى 0.
   2. التقاط الصور باستخدام الهدف 20X (200X التكبير). مسح صورة كبيرة تتكون من الصور البلاط (على سبيل المثال، 3 × 3).
      1. في برامج التصوير، انتقل إلى "اكتساب" واختيار "مسح صورة كبيرة" من القائمة المنسدلة. تحت عنوان "منطقة"، اختر "الوضع الحالي هو في أعلى الزاوية اليسرى" من القائمة المنسدلة وتعيين "عدد من الحقول في X و Y" ل3 × 3. انقر فوق "مسح".
5. تحليل الصور
   1. تحديد عدد من نوى cardiomyocyte عن طريق عد إشارات H2B CH وعدد الخلايا العضلية عن طريق عد الإشارات α-actinin.
      <لى> انقر على "القياس" واختيار "قياس يدوي" من القائمة المنسدلة. اختيار "التهم" من القائمة المنسدلة المقبلة. انقر على النوى مع إشارات H2B-صحة الأم والطفل، وبالتالي وضع العلامات واعدهم. تفعل الشيء نفسه للخلايا α-actinin إيجابية للحصول على عدد الخلايا العضلية.
   2. عد S / العضلية المرحلة G2 مع إشارات EGFP-anillin النووية (EGFP-anillin + / + H2BmCh نوى). انقر على "القياس" واختيار "قياس يدوي" من القائمة المنسدلة. اختيار "التهم" من القائمة المنسدلة المقبلة. علامة نوى مع إشارات EGFP-anillin وإشارات H2B-صحة الأم والطفل من خلال النقر عليها.
   3. عد العضلية مع إشارات الانقسام محدد EGFP-anillin (على سبيل المثال، الشكل 1F وG)، مثل إشارات cytoplasmatic، حلقات مقلص، وmidbodies. انقر على "القياس" واختيار "قياس يدوي" من القائمة المنسدلة. اختيار "التهم" من بول المقبلالقائمة ldown. العضلية علامة مع إشارات الانقسام محدد EGFP-anillin (على سبيل المثال، الشكل 1F وG)، وإشارات cytoplasmatic، حلقات مقلص، وmidbodies من خلال النقر عليها.

2. تحديد التنوي في العضلية الكبار من Langendorff التفكك وأقسام الأنسجة السميكة

1. عزل العضلية الكبار بحلول Langendorff التفكك
   1. الاستعدادات قبل تشريح القلب
      1. ملء حقنة الأنسولين (عيار 30 إبرة) مع الهيبارين (20 وحدة / غرام من وزن الجسم). فهم الماوس من القفا من الرقبة. رفع وتحويل الماوس الى الوراء لفضح البطن للحقن.
      2. إجراء حقن داخل الصفاق. ضع الماوس heparinized مرة أخرى في قفص والانتظار على الأقل 15 دقيقة قبل البدء في تشريح القلب. شطف وتهوية الجهاز Langendorff مع 5-10 مل من العازلة نضح (العازلة نضح: 135 مم كلوريد الصوديوم، 4 ملي بوكل، 1 ملم MgCl_2، 2.5 ملي HEPES، 5 ملي الجلوكوز، و 25 ملي بي دي إم في ده ₂ O، وضبط لدرجة الحموضة 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم).
   2. تشريح القلب
      1. إعداد 10 سم طبق بتري مع المبردة (4 درجة مئوية) في برنامج تلفزيوني ووضعه على الجليد. ملء وتهوية حقنة 1 مل متصلة (قياس 20) قنية مع برنامج تلفزيوني. إصلاح قنية مع الصلصال على الحدود من طبق بيتري. ضع طرف قنية أقل قليلا من سطح برنامج تلفزيوني.
      2. التضحية الماوس عن طريق خلع عنق الرحم. مسح البطن مع 70٪ من محلول الإيثانول. إجراء شق من البطن منتصف إلى القص مع مقص جراحي. إزالة الحجاب الحاجز وقطع القفص الصدري بشكل ثنائي مع مقص جراحي.
      3. رفع وإصلاح القص بإبرة 20 عيار، فتح التجويف الصدري، وفهم بلطف القلب مع ملقط التشريحية. رفع القلب وإزالته من الرئتين والأوعية الدموية عن طريق خفض السفن في المسالك التدفق.
         ملاحظة: لتحديد الشريان الأورطي، ضع القلبفي بطني حتى الجانب. هذا يقلل من المسافة بين كل من الأذينين، وبالتالي فإن الشريان الأورطي مع فروعها يمكن العثور بين الأذينين. اعتمادا على بنية القلب الفردية، وفروع يمكن إزالتها إذا كان فرع الرئيسي من الشريان الأورطي لا يزال طويلا بما فيه الكفاية.
      4. نقل القلب إلى طبق بتري 10 سم تحتوي على برود برنامج تلفزيوني (راجع الخطوة 2.1.2.1). يقني؛ يدخل القنية القلب عن طريق سحب الأبهر الصاعد على قنية حقن G20x1 ½، الذي قلل من قبل أداة متعددة تتأرجح لتجنب تلف الأنسجة. إصلاح الشريان الأورطي مع موضوع على قنية. شطف بلطف القلب مع برنامج تلفزيوني لإزالة الدم الزائد عن طريق دفع المكبس حقنة. وينبغي أن يكون توسيع طفيف في قلب مرئية.
   3. Langendorff التفكك القلب
      1. ربط القلب مقنى بسرعة إلى محول قفل لور في جهاز نضح Langendorff. يروي القلب مع 30 مل من العازلة نضح الاوكسيجين عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق مع معدل التدفق من 1 قطرة / ثانية. عشريمكن تكييفها معدل التدفق الإلكتروني عن طريق تنظيم تدفق O ₂ داخل جهاز Langendorff باستخدام صمام تخفيض الضغط (ضغط بين 0 و 200 مليبار).
      2. إعداد العازلة الهضم مباشرة قبل الاستعمال: العازلة نضح مع 6 U كولاجيناز B، 10،000 وحدة التربسين، و 50 ميكرومتر CaCl _2. إزالة المنطقة العازلة نضح وبدء عملية الهضم الأنزيمي بإضافة 30 مل من الحارة (37 درجة مئوية) والاوكسيجين العازلة الهضم.
         ملاحظة: مقدار كولاجيناز B يحتاج إلى معاير تبعا لنوع النشاط من دفعات مختلفة.
      3. ضبط تدفق إلى نسبة 1 قطرة / ثانية واستيعاب القلب ل10-13 دقيقة. لتجنب التلوث، لا تستخدم هروب رأس المال مرة أخرى. نقل القلب إلى طبق بتري 10 سم مع 5 مل من العازلة الهضم. تشريح الأنسجة يدويا بالملقط من خلال عقد القلب مع زوج واحد من الملقط واستخدام الزوج الآخر أن يمزق القلب إلى قطع صغيرة.
         ملاحظة: في هذه الخطوة، الأذينين يمكن فصلها، يقتطع الصغيرةقطعة (مع مقص القزحية)، وهضمها لمدة 30 دقيقة في 750 ميكرولتر من العازلة الهضم في الحاضنة عند 37 درجة مئوية وذلك للحصول على خلايا الأذيني معزولة. للحصول على العضلية الأذينية نقية، الماصة صعودا وهبوطا عدة مرات باستخدام ماصة 1 مل. وقف رد فعل الانزيم بإضافة 750 ميكرولتر من وقف الحل.
      4. وقف عملية الهضم وذلك بإضافة 5 مل من حل توقف (العازلة نضح مع 5٪ FBS و 50 ميكرومتر CaCl _2). باستخدام ماصة المصلية، تصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرون وجمع الخلايا في أنبوب الطرد المركزي 50 مل. الطرد المركزي تعليق الخلية التي تمت تصفيتها في 80 x ج لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      5. تجاهل طاف و resuspend بلطف بيليه الخلية في 10 مل من توقف الحل باستخدام ماصة المصلية 10 مل. الطرد المركزي تعليق خلية في 80 x ج لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      6. بعد الطرد المركزي، ونبذ طاف و resuspend الخلايا في 1 مل من مستنبت (IMDM مع 20٪ FCS، 0.1 ملي الأحماض الأمينية غير الأساسية، 50 ميكروغرام / مل كل من البنسلين والستربتومايسين، و 0.1 ملي β-المركابتويثانول) للزراعة. بدلا من ذلك، انتقل إلى الخطوة 2.2، "المناعي تلطيخ"، وإصلاح الخلايا.
      7. لتثبيت على 24 لوحات جيدا، لوحة 10،000 من خلايا معزولة لكل بئر في 8 ميكروغرام / مل coverslips المغلفة laminin في 24 لوحات جيدة مع 500 ميكرولتر من مستنبت عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ لمدة 3 ساعة على الأقل .
2. تلوين المناعي على العضلية معزولة Langendorff في تعليق
   1. إصلاح العضلية معزولة Langendorff في 1 مل من 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4، لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الطرد المركزي تعليق خلية في 800 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وإزالة تثبيتي، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني.
   2. Resuspend والعضلية الثابتة في 1 مل من برنامج تلفزيوني وإما المضي قدما في تلطيخ المناعي أو تخزينها في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر على24 لوحة جيدا في 4 درجات مئوية. نقل جزء من تعليق خلية (~ 100-200 ميكرولتر) إلى أنبوب microcentrifuge. الطرد المركزي تعليق خلية في 800 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل طاف.
   3. Permeabilize، كتلة، وصمة عار على الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية ضد α-actinin بإضافة 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخفف 1: 400 في برنامج تلفزيوني مع 0.2٪ تريتون X-100 و 5٪ المصل حمار لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
   4. أجهزة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل طاف. غسل بيليه الخلية مع برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تجاهل طاف واحتضان في 200 ميكرولتر من اليكسا فلور مترافق الضد الثانوية (مكافحة فأر IgG1) المخفف 1: 400 في هويشت صبغ (العمل الحل: 1 ميكروغرام / مل) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء.
   5. أجهزة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل طاف. كرر هذه الخطوة. حماية عينة من الضوء. Resuspend الخلايا في 200-500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ونقل 100-300 ميكرولتر من تعليق خلية إلى بئر من غرفة الفحص المجهري. إغلاق غطاء غرفة وتخزين الخلايا في 4 درجات مئوية حتى التصوير. احم من الضوء.
3. تحليل nuclearity العضلية معزولة Langendorff-
   1. التقاط صور من العضلية ملطخة α-actinin مع هدف 25X، الموافق التكبير 250X. حساب عدد H2B-صحة الأم والطفل + نوى إلا في تلك العضلية التي هي ملطخة بشكل منتظم من قبل α-actinin وعرض نموذجي قضيب على شكل التشكل، وبالتالي يفترض أن تكون سليمة.
   2. عدد لا يقل عن 100 العضلية من ثلاثة قلوب مختلفة. حساب النسب المئوية من وحيدات النوى، ثنائي النواة، والعضلية trinuclear.
      ملاحظة: عادة، يجب أن خلايا ثنائي النواة يشكلون حوالي 80 - 90٪، في حين أن الخلايا trinuclear وذوي أعداد أكبر من نوى نادرة (<1٪ في العضلية معزولة Langendorff، <3٪ في شرائح سميكة). العضلية الأذينية هي أصغر بكثير من العضلية البطين. عادة، وخلايا وحيدات النوى يشكلون 90٪ من مجموع السكان.
4. العزلة، التثبيت، والحفظ بالتبريد من قلوب الكبار كتحضير للشرائح سميكة
   1. تجميع جهاز نضح لتثبيت من خلال ربط حقنة 50 مل إلى 3 في اتجاه ومحبس مع تمديد أنبوب هايدلبيرغر و3-الطريقة الثانية محبس. إصلاح حقنة في موقف في مثل هذه الطريقة يتم تمكين هذا التدفق من خلال طريق الجاذبية. ملء النظام مع 15 مل من برنامج تلفزيوني.
   2. اتبع الخطوات 2.1.2.1-2.1.2.4 "إعداد القلب." ربط حقن قنية G20x1 ½ مع القلب إلى تأمين محول لور من جهاز نضح مملوءة PBS-فقاعة خالية ويروي مع برنامج تلفزيوني. ملء النظام مع 10-15 مل من 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني، وهو ما يتم perfused من خلال القلب. الغمر إصلاح القلب في 4٪ محلول الفورمالديهايد بين عشية وضحاها.
   3. استبدال الفورمالديهايد 4٪الحل مع برنامج تلفزيوني، ويغسل القلب في برنامج تلفزيوني على شاكر الأفقي في 150 دورة في الدقيقة لمدة 8 ساعات في درجة حرارة الغرفة. تبادل برنامج تلفزيوني مع محلول السكروز 20٪ إلى يذوى القلب بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
   4. تجميد القلب في المتوسط ​​تضمين البرد في قالب صغير.
      1. إعداد كوب مملوء 2-methylbutane وضعه في مربع مع الثلج الجاف. وضع القلب في قالب تجميد سابقا شغل نصف مع البرد تضمين المتوسطة وتغطية ذلك تماما مع البرد تضمينها المتوسطة. وضع بعناية القالب في الكأس الباردة، ومنع الاتصال من الخطة المتوسطة الأجل تضمين البرد لدى methylbutane 2. تخزين الأنسجة المجمدة في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
5. إعداد شرائح سميكة القلب
   1. استخدام الإعداد التالية في مبضع بردي: درجة حرارة جسم من -18 إلى -20 درجة مئوية، ودرجة حرارة الغرفة -21 إلى -23 درجة مئوية، زاوية المقاصة على حامل السكين من 4 درجات، والريشة R35 شفرات مشراح.
   2. خذ يا cryopreservedrgan من الحاوية تجميد وإصلاحه على القرص العينة مع متوسطة تضمين البرد باستخدام رف التجميد السريع. وضع القلب في مثل هذه الطريقة التي باجتزاء يبدأ في ذروة.
   3. تقليم بعيدا شرائح 50 ميكرومتر حتى يتحقق طائرة حتى قطع والجهاز تصبح مرئية. قطع 50 ميكرومتر شرائح الأنسجة باستخدام مبضع بردي في الوضع اليدوي مع سرعة بطيئة ومع لوحة المضادة للدوران وضعت على سكين. شرائح جبل على الشرائح المجهر المعالجة المالحة. السماح للشرائح تجف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وتخزين الشرائح في -80 درجة مئوية أو وصمة عار مباشرة.
6. تلطيخ شرائح سميكة قلب (نواة وأغشية الخلايا)
   1. علاج شرائح القلب مع ريبونوكلياز ألف (20 ميكروغرام / مل) في غسل العازلة (0.5 M كلوريد الصوديوم، 0.1 م تريس 7.5 درجة الحموضة، و 50 ملي EDTA) في كفيت لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. احتضان الشرائح في 0.2٪ تريتون-X في غسل العازلة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تغسل شرائح مرتين لمدة 5 دقائق في كل من غسل العازلة في كوفيت علىشاكر الأفقي في درجة حرارة الغرفة.
   2. وصمة عار بين عشية وضحاها مع 1 ميكرومتر TO-PRO3 يوديد (642/661) وإلى جانب فلوريسئين جنين القمح راصة (WGA، 1: 100) في غسل العازلة عند 4 درجات مئوية. تغسل شرائح ثلاث مرات لمدة 5 دقائق مع كل غسل العازلة في cuvettes على شاكر الأفقي وتغطيتها مع البولي فينيل الكحول المتوسطة المتزايدة مع كاشف يتلاشى مكافحة وساترة الزجاج.
7. الحصول على الصور
   1. من الناحية المثالية، استخدم مقلوب ليزر متحد البؤر مجهر المسح مجهزة NA الهدف المياه غمس 40X / 1.15. البحث عن طريق العين إحدى المناطق في نطاق الشريحة التي تتكون من العضلية اصطف طوليا. لهذا الغرض، وقناة فلوريسئين-WGA (مثال: نانومتر 488) هو الانسب.
      ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية، والحدود العليا والدنيا للالعضلية يجب أن يكون مرئيا داخل ض المكدس للتحليلات لاحقة. كما يقتصر عمق التصوير ل~ 30 نانومتر، وسمك شريحة 50 ميكرون، فإنه ليس من الممكن ايمعبر عمر أقسام من هذه الخلايا (طول الخلية: ~ 120 ميكرون).
   2. ضبط الإعداد ضمن برامج التصوير. فتح برامج التصوير. افتح إعدادات A1plus والتحقق من صناديق لCH2، CH3، وCH4. تعيين CH2 إلى EGFP، CH3 إلى Alx546، وCH4 إلى Alx647 بالضغط على القائمة المنسدلة.
      1. لكل قناة، انقر على HV وتعيينه إلى 80 باستخدام شريط التمرير. تعيين إزاحة 0 باستخدام قضبان المنزلق. انقر على زر "الوطن" لتعيين الثقب إلى موضعها الأصلي. تعيين حجم المسح إلى 1024 X 1024 عن طريق النقر على القائمة المنسدلة وانقر فوق تحسين لفتح نافذة "XYZ الحجم الإعداد". ضع علامة في المربع "الكمال فوكسل" تحت عنوان "الخطوة المقترحة (ض)".
   3. انقر على "مسح العيش" وضبط شدة الليزر عن طريق النقر على أشرطة التمرير على القنوات الفردية. ضع علامة في المربع "زد" على نافذة "ND اقتناء" وانقر على "يحددها الزر العلوي" مربع. تحديد أعلى وزر من ض المكدس عن طريق النقر على الأزرار المناسبة بعد ضبط التركيز على المجهر. تعيين عرض ض خطوة إلى 0.5 ميكرون.
      ملاحظة: عمق ض المكدس محدودة بسبب اختراق البصرية داخل الأنسجة ونسبة الإشارة إلى الضوضاء.
   4. انتقل إلى "إعدادات A1plus" وتعيين خط متوسط ​​/ جزءا لا يتجزأ من 2-4 بالضغط على القائمة المنسدلة. صقل شدة الليزر. وينبغي أن يكون الثقب صغيرا قدر الإمكان من أجل صورة في المستوى البؤري.
8. تحليل التنوي
   1. فتح برنامج تحليل الصور وتحميل ض المكدس في المصالح.
   2. يدويا تحديد التنوي في Z-مداخن بالتنقل بين طبقات مختلفة من كومة من أجل تحديد الخلايا التي تقع بالكامل داخل كومة. هذا هو الحال عندما تلطيخ WGA مرئيا في جميع الأبعاد. حساب عدد النوى (ومعظمهم من سيكون ثنائي النواة) وعلامة الخلية تحليلها من قبل الشرح في البرنامج.
   <لى> تحديد عدد النوى سم (H2B-صحة الأم والطفل +) ومجموع النوى (TO-PRO3 +) في عمليات إعادة البناء 3D للقنوات واحدة (الشكل 2D). في برامج التصوير، اضغط على "ثنائي" ثم اختر "تحديد عتبة 3D" من القائمة المنسدلة. اختر من القائمة المنسدلة قناة إما Alx546 لعدد من نوى CM أو Alx647 عن إجمالي عدد النوى. من خلال النقر على الأسهم المناسبة، وضع برنامج ل"4X السلس"، 1X تنظيف، وملء الثقوب. ضع علامة في المربع "حجم" وتعيينه إلى 5 ميكرون باستخدام شريط التمرير. تعيين عتبة باستخدام شريط التمرير حتى تظهر كائنات منفصلة.
   ملاحظة: بعد تطبيق تجزئة، يظهر إطار النتائج جدول الأحداث كميا وتجزئة اللون من الصورة. حيث أن بعض نوى الاتصال مباشرة بعضها البعض، يدويا تصحيح نتيجة القياس التلقائي للالحلل، والتي قد لا يمكن فصلها بشكل صحيح من قبل البرنامج.

النتائج

من أجل تحليل آثار الرناوات siRNAs / miRNAs على النشاط دورة الخلية العضلية بعد الولادة في المختبر، العضلية من ضعف المعدلة وراثيا الفئران Myh6-H2B-صحة الأم والطفل / CAG-EGFP-anillin تم عزل في يوم ما بعد الولادة 3 (P3) وtransfected مع النشاط الذي يحفز دورة الخلية miR199

Discussion

هناك جدل حول ما اذا العضلية قادرة على إعادة إدخال دورة الخلية وتقسيم بعد الاصابه وخلال توازن الأنسجة. وقد تم إعطاء القيم لدوران الأساسي العضلية في نطاق بين 1٪ ¹ و 80٪ ^7. أيضا بعد الآفة القلبية، وقد تم الإبلاغ عن تحريض النشاط دورة الخلية وتوليد ا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Sarstedt	821472
100 µm cell strainer	Becton Dickinson GmbH/Falcon	352360
2,3-Butanedione monoxime (BDM)	Sigma-Aldrich	B0753
G20x1 ½ injection cannula, Sterican	Braun, Melsungen	4657519
20 gauge needle	Becton Dickinson GmbH	301300
24-well plates	Becton Dickinson GmbH/Falcon	353047
2-Methyl-butane	Carl Roth GmbH + Co. KG	3927.1
37% formaldehyde solution	AppliChem GmbH	A0936,1000
3-way stopcock	B. Braun Medical Inc.	16494C
50 mL syringe	B. Braun Medical Inc.	8728810F
70% ethanol	Otto Fischar GmbH	27669
Alexa-Fluor-conjugated secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	115-605-205
Alpha-Aktinin EA-53, Mouse IgG	Sigma-Aldrich, Steinheim	A7811
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Cell Culture Microplate, 96 Well, Half Area	Greiner bio-one	675986
Collagenase B	Roche	11088815001
confocal microscope Eclipse Ti-E	Nikon
cryostat CM 3050S	Leica
donkey serum	Jackson Immuno Research, Suffolk, GB	017-000-121
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537
EDTA	Sigma-Aldrich	E4884
fetal calf serum	PromoCell, Heidelberg
Formaldehyde solution (4%)	PanReac AppliChem	A3697
Gelatine from porcine skin, Type A	Sigma-Aldrich, Steinheim	G2500
glass coverslips	VWR	631-0146
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Heidelberger extension tube	IMPROMEDIFORM GmbH	MF 1833
Heparin-Natrium	Ratiopharm	5394.02.00
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
HistoBond microscope slides	Marienfeld	0810000
Hoechst 33342 (1 mg/mL)	Sigma Aldrich, Taufkirchen	B2261
Insulin syringe	Becton Dickinson GmbH	300334
Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium (IMDM)	Gibco/Life Technologies, Darmstadt	21980-032
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
Laminin	Corning	354221
Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti	Nikoninstruments, Düsseldorf
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt	13778075
Mouse IgG Cy5 (donkey)	Jackson ImmunoResearch	715-175-151
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
microcentrifuge tube	Sarstedt	72690
Mini shaker	VWR	12620-940
mirVana miRNA mimic, hsa-miR199a-3p	Ambion/Thermo Fischer Scientific	4464066
Biopsy Mold	Sakura Finetek/ VWR	4565
M-slide 8-well ibiTreat	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaOH	Merck Millipore	567530
negative control(scrambled RNA)	Ambion/Thermo Fischer Scientific	AM4611
Neonatal Heart Dissociation Kit	Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach	130-098-373
NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit	Nikoninstruments, Düsseldorf
Non essential amino acids, NEAA	Gibco/Life Technologies, Darmstad	11140-035
Opti-MEM, Reduced Serum Medium	Gibco	51985-026
P21-siRNA	Ambion/Thermo Fischer Scientific	4390771
P27-siRNA	Ambion/Thermo Fischer Scientific	4390771
Penicillin/Streptomycin	Gibco/Life Technologies, Darmstadt	15140-122
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, Steinheim	14190-094
Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading	Sigma-Aldrich	10981
RNase A	Qiagen	1007885
RNaseZap	Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt	AM9780
sample containers	Vitlab	80731
Serological pipette	Greiner	607180
software NIS Elements	Nikon
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek/ VWR	25608-930
ToPro3 iodide (642/661)	Molecular probes/ThermoFisher Scientific	T3605
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X	Fluka	93418
Triton X-100	Fluka	93418
Trypsin	Sigma-Aldrich	T1426
Wheat germ agglutinin (WGA) Fluorescein labeled	Vector Laboratories	VEC-FL-1021-5
α-actinin antibody	Sigma-Aldrich	A7811
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich, Steinheim	M3148