La visualizzazione delle variazioni del ciclo cellulare e la determinazione di nucleazione in postnatali cardiomiociti

Riepilogo

To distinguish cell division from cell cycle variations in cardiomyocytes, we present protocols using two transgenic mouse lines: Myh6-H2B-mCh transgenic mice, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and CAG-eGFP-anillin mice, for distinguishing cell division from cell cycle variations.

Abstract

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and cytokinesis) and acytokinetic mitosis (karyokinesis but no cytokinesis). Such atypical cell cycle variations result in polyploid and multinucleated cells rather than in cell division. Therefore, to determine cardiac turnover and regeneration, it is of crucial importance to correctly identify cardiomyocyte nuclei, the number of nuclei per cell, and their cell cycle status. This is especially true for the use of nuclear markers for identifying cell cycle activity, such as thymidine analogues Ki-67, PCNA, or pHH3. Here, we present methods for recognizing cardiomyocytes and their nuclearity and for determining their cell cycle activity. We use two published transgenic systems: the Myh6-H2B-mCh transgenic mouse line, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and the CAG-eGFP-anillin mouse line, for distinguishing cell division from cell cycle variations. Combined together, these two systems ease the study of cardiac regeneration and plasticity.

Introduzione

La corretta identificazione dei nuclei cardiomiociti e lo stato del ciclo cellulare è di cruciale importanza per la determinazione del fatturato muscolo cardiaco e la rigenerazione. Ciò è particolarmente vero per l'uso di marcatori nucleari, come pHH3, Ki-67, o analoghi della timidina, per l'identificazione dell'attività ciclo cellulare. Poiché la capacità proliferativa dei cardiomiociti mammiferi adulti è molto piccolo ^1, una falsa identificazione di un nucleo positivo per un marker di proliferazione di un nucleo cardiomiociti potrebbe fare una differenza cruciale nel risultato di un saggio di proliferazione. Inoltre, cardiomiociti sono inclini a variazioni del ciclo cellulare, come endoreduplicazione e mitosi acytokinetic, che determinano cellule poliploidi e multinucleate piuttosto che nella divisione cellulare. A tal fine, l'interpretazione della colorazione anticorpi contro marcatori del ciclo cellulare comuni non è determinante in tutti i casi.

Qui, vi presentiamo i metodi per il diritto-forwa il riconoscimento Rd di cardiomiociti di topo e la loro nuclearità in cellule isolate nativi e sezioni di tessuto di spessore nelle fasi post-natali e adulti dall'identificazione univoca dei loro nuclei. A tal fine, una linea di topi transgenici con espressione specifici cardiomiociti di una proteina di fusione che consiste di H2B istone umano e mCherry sotto il controllo del promotore Myh6 (Myh6-H2B-MCH) è stato usato ^2. Incroci questa linea di topi con una linea di topi indicatore di proliferazione transgenico, in cui l'espressione di una proteina di fusione eGFP-anillin è sotto il controllo del onnipresente promotore pollo actina con potenziatore CMV (CAG-eGFP-anillin), consente la determinazione dello stato del ciclo cellulare. Il anillin proteina ponteggio è specificamente indicato nella cellula-ciclo cellulare attivo ^3, e il suo differenziale localizzazione subcellulare durante il ciclo cellulare permette per la progressione del ciclo cellulare live-tracciamento con una risoluzione di M-Phaseef "> 4. Pertanto, i topi transgenici doppia può essere utilizzato per discriminare tra cardiomiociti proliferanti e quelli che subiscono variazioni del ciclo cellulare. Questo dimostra particolarmente utile nello screening per sostanze proliferazione di indurre in vitro.

Protocollo

Tutte le procedure di questo protocollo che coinvolge gli animali erano in conformità con gli standard etici della Università di Bonn e rispettate le linee guida della direttiva 2010/63 / UE del Parlamento europeo sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici.

1. In Vitro visualizzazione di Cell ciclo di attività in postnatale cardiomiociti

1. Postnatale dissociazione cardiomiociti
   1. preparazioni pre-sperimentali
      1. Preparare terreni di coltura (IMDM, 1% di penicillina / streptomicina, aminoacidi non essenziali 1%, 0,1% β-mercaptoetanolo); medio 1: aggiungi FCS al 2%; media 2: aggiungere FCS al 20%.
      2. Coat un 96 pozzetti cultura piatto (zona mezza di crescita: 15 mm ²⁾ con 0,1% di gelatina in soluzione PBS.
   2. dissezione del cuore
      1. Preparare una capsula di Petri con 15 ml di PBS e memorizzarlo sul ghiaccio. Sterilizzare due pinze e forbici piccole mettendoli in un luogo asciutto sterilizzatore a perle di vetro.
      2. Sacrificio neonatale topi transgenici (CAG-eGFP-anillin / Myh6-H2B-MCH) per decapitazione. Aprire il torace, sezionare il cuore fuori, come descritto in Ehler et al. 2013 (J Exp Vis .; (79):. 50154 doi: 10.3791 / 50154) e le trasferisce al ghiacciata PBS. Passare alla prossima mouse.
      3. Se si utilizza coppie nidificanti non omozigoti, identificare i cuori transgenici con un microscopio a fluorescenza. Mettere i cuori in PBS sotto un microscopio a fluorescenza. Controllare per l'espressione eGFP-anillin (Es .: 488 nm; em .: 509 nm) e l'espressione H2B-MCH (Es .: 587 nm; em .: 610 nm) con gli appositi set di filtri.
   3. isolamento cardiomiociti
      1. Dissociare il cuore selezionati utilizzando il kit di cuore di dissociazione neonatale. Incubare la miscela enzimatica 1 a 37 ° C per 5 min. Per ottenere 1 mL del mix enzimatico finale, aggiungere 945 ml di mix dell'enzima 1-55 ml di enzima mix 2.
      2. Trasferimento fino a 4 cuori da P1 - P3 topi o fino a 2 cuori da P4 - P6 topi ad un R da 1,5 mlTubo eaction contenente 1 ml di miscela enzimatica e tagliare cuore in piccoli pezzi con le forbici. Trasferire la soluzione in 15 ml provette di reazione.
      3. Incubare a 37 ° C per 15 min. Per massimizzare il contatto tra il tessuto e gli enzimi, inserire il tubo 15 mL quasi orizzontalmente nell'incubatrice. Mescolare pipettando 5 - 10 volte su e giù con una pipetta da 5 mL. Ripetere questa operazione tre volte.
      4. Aggiungere 7,5 ml di mezzo 2 (20% FCS) per arrestare la reazione enzimatica. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cella di 70 micron. Risciacquare il filtro cella con 3 ml di terreno 2.
      5. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 g per 15 minuti e scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 500 ml di media 1; rosso lisi delle cellule del sangue non è richiesta per ulteriori esperimenti. Pipettare 10 ml di sospensione cellulare in una camera di conteggio delle cellule e determinare il numero di cellule.
      6. Per una piastra a 96 pozzetti: semi di 10.000 cellule per pozzetto in 120 ml di media 1 (2% FCS). Postole cellule in un incubatore (37 ° C e 5% CO ₂₎ e procedere immediatamente alla trasfezione.
2. Transfection di cardiomiociti neonatali con siRNA o miRNA
   1. Pulire una panchina con soluzione di decontaminazione RNase per rimuovere le RNasi. Pulire il seguente materiale con la soluzione di decontaminazione RNase: 10-ml, 100-ml, e 200-microlitri pipette e una scatola di ghiaccio. Immagini aliquote disgelo siRNA (100 micron) su ghiaccio.
   2. Preparare 2 mM scorte di lavoro del SI / miRNA nel medio siero ridotta (98 ml di riduzione media di siero + 2 ml di siRNA 100 micron magazzino). Lo stock di lavoro deve essere utilizzato lo stesso giorno. Il congelamento non è raccomandato.
   3. Aggiungere 4 ml di 2 mM magazzino a 6 ml di siero medio ridotto a un tubo di reazione 0,5 mL (importo per un 96 pozzetti; SI finale / concentrazione miRNA in 140 ml: ~ 57 nm). Scegliere un volume adeguato numero di pozzi da transfettate con un certo SI / miRNA.
   4. Preparare una master mix del reagente di trasfezione. Utilizzare 10 ml (0,6 ml di trasfezione reagente + 9,4 ml di siero di riduzione media) per ogni pozzetto (96 pozzetti totali).
   5. Aggiungere il si / miRNA mix al mix trasfezione reagente. Incubare per 5 minuti in ghiaccio. Pipettare 20 microlitri in ciascun pozzetto. Incubare le cellule per 48 ore a 37 ° C e 5% di CO ₂ e quindi sostituire il mezzo in ogni pozzetto con 120 ml di media 1. Dopo 24 ore o più, procedere alla fissazione e immunofluorescenza.
3. Fissazione e immunofluorescenza
   1. Rimuovere il mezzo e lavare le cellule una volta con PBS. Coprire le cellule con soluzione di formaldeide 4% per 20 min. Togliere la soluzione di formaldeide e lavare le cellule una volta con PBS, e poi coprirli con PBS per lo stoccaggio o procedi alla immunocolorazione.
   2. Incubare con l'anticorpo primario (concentrazione secondo le istruzioni del produttore) in 0,2% Triton-X e 5% di siero asino per almeno 2 h.Se la colorazione per la α-actinina (diluizione 1: 400; monoclonale anti-α-actinina), macchia notte a 4 ° C.
   3. Rimuovere l'anticorpo primario e lavare 3 volte con PBS. Diluire l'anticorpo secondario in soluzione Hoechst 1: 400 e incubare per 1 ora a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Rimuovere l'anticorpo, lavare con PBS 3 volte, e coprire le cellule con PBS per la conservazione a 4 ° C.
4. La microscopia confocale il video
   1. Utilizzare un microscopio confocale per l'acquisizione delle immagini. Aprire il software di imaging. Aprire "Impostazioni A1plus" e selezionare le caselle per Ch1, Ch2 e Ch3. Impostare Ch1 a DAPI, Ch2 per eGFP, Ch3 a Cy3, e CH4 per Cy4 cliccando sul menu a tendina.
      1. Per ogni canale, cliccare su HV e impostarlo su 80 utilizzando la barra di scorrimento. Impostare l'offset a 0 utilizzando le barre di scorrimento, e clicca sul pulsante "Home" per impostare il foro stenopeico alla posizione iniziale. Impostare il formato di scansione di 1.024 x 1.024 cliccando sul menu a tendina.
      2. Fare clic su Ottimizza per aprirefinestra "XYZ Size Setup". Casella "perfetto Voxel" sotto "Passo suggerito (z)". Aumentare l'intensità del laser fino a quando l'immagine non è né sottoesposta né sovraesposto.
         NOTA: Per esempio; Ch1 (DAPI): 16%, Ch2 (eGFP): 12%, Ch3 (Cy3): 100%, Ch4 (Cy5): 1%. Impostare l'offset per tutti i canali a 0.
   2. Riprendere immagini utilizzando un obiettivo 20X (200X di ingrandimento). Scansione una grande immagine costituito da immagini di piastrelle (es, 3 x 3).
      1. Nel software di imaging, andare a "acquisire" e scegliere "Scan grande immagine" dal menu a tendina. In "Area", scegliere "posizione attuale è superiore sinistro" dal menu a tendina e impostare "Numero di campi in X e Y" a 3 x 3. Fare clic su "Scan".
5. analisi delle immagini
   1. Definire il numero di nuclei cardiomiociti contando segnali H2B-Ch e il numero di cardiomiociti contando segnali α-actinina.
      1. Clicca su "Misura" e scegliere "Misurazione manuale" dal menu a tendina. Scegliere "conta" dal successivo menu a tendina. Clicca su nuclei con segnali H2B-MCH, segnando in tal modo e contarli. Fare lo stesso per le cellule α-actinina-positivi per ottenere il numero di cardiomiociti.
   2. Conte S / cardiomiociti fase G2 con segnali eGFP-anillin nucleari (eGFP-anillin + / + H2BmCh nuclei). Clicca su "Misura" e scegliere "Misurazione manuale" dal menu a tendina. Scegliere "conta" dal successivo menu a tendina. Segna i nuclei con segnali eGFP-anillin e segnali H2B-MCH facendo clic su di essi.
   3. Contare i cardiomiociti con segnali specifici per mitosi eGFP-anillin (ad esempio, figura 1F e G), come ad esempio i segnali citoplasmatici, anelli contrattili, e midbodies. Clicca su "Misura" e scegliere "Misurazione manuale" dal menu a tendina. Scegliere "conta" dal prossimo PULmenù ldown. Mark cardiomiociti con segnali specifici per mitosi eGFP-anillin (ad esempio, figura 1F e G), segnali citoplasmatici, anelli contrattili, e midbodies cliccando su di essi.

2. Determinazione di nucleazione in cardiomiociti adulti da Langendorff Dissociazione e spesse tessuto Sezioni

1. L'isolamento di cardiomiociti adulti da Langendorff dissociazione
   1. I preparativi prima della dissezione cuore
      1. Riempire una siringa da insulina (l'ago 30-gauge) con eparina (20 unità / g di peso corporeo). Afferrare il mouse per la collottola del collo. Sollevare e ruotare il mouse all'indietro per esporre l'addome per l'iniezione.
      2. Eseguire un'iniezione intraperitoneale. Mettere il mouse eparina nella gabbia e attendere almeno 15 minuti prima di iniziare la dissezione cuore. Risciacquare e ventilare l'apparato Langendorff con 5 - 10 ml di tampone perfusione (buffer perfusione: 135 mm NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl_2, 2,5 mM HEPES, 5 mM glucosio, e 25 mm BDM in DDH ₂ O, regolare a pH 7,4 con NaOH).
   2. dissezione del cuore
      1. Preparare a 10 cm capsula di Petri con freddo (4 ° C) PBS e posizionarlo sul ghiaccio. Riempire e ventilare una siringa da 1 mL collegato ad un (calibro 20) cannula con PBS. Fissare la cannula con plastilina sul bordo della scatola di Petri. Posizionare la punta della cannula leggermente al di sotto della superficie PBS.
      2. Sacrificare il mouse per dislocazione cervicale. Pulire l'addome con una soluzione di etanolo al 70%. Fare un'incisione dalla metà addome allo sterno con le forbici chirurgiche. Rimuovere il diaframma e tagliare il torace bilateralmente con le forbici chirurgiche.
      3. Sollevare e fissare lo sterno con un ago calibro 20, aprire la cavità toracica, e afferrare delicatamente il cuore con una pinza anatomiche. Sollevare il cuore e rimuoverlo dai polmoni e vasi tagliando i vasi del tratto di efflusso.
         NOTA: Per identificare l'aorta, posizionare il cuore conil suo lato ventrale. Questo diminuisce la distanza tra i due atri, così l'aorta con i suoi rami si trova tra gli atri. In base all'architettura cardiaca dell'individuo, i rami possono essere rimossi se il ramo principale della aorta è ancora abbastanza lungo.
      4. Trasferire il cuore alla piastra di Petri di 10 cm contenente refrigerata PBS (vedi punto 2.1.2.1). Incannulare cuore tirando l'aorta ascendente su una cannula iniezione G20x1 ½, che è stato attenuato da un oscillante multi-utensile per evitare danni ai tessuti. Fissare l'aorta con una filettatura sulla cannula. lavare delicatamente il cuore con PBS per rimuovere il sangue in eccesso spingendo lo stantuffo della siringa. Un leggero allargamento del cuore deve essere visibile.
   3. cuore di dissociazione Langendorff
      1. Collegare il cuore cannulata rapidamente all'adattatore Luer lock alla dell'apparato perfusione Langendorff. Profumato cuore con 30 mL di tampone perfusione ossigenato a 37 ° C per 5 minuti con una portata di 1 goccia / s. thportata e può essere adattato regolando il flusso O ₂ nell'apparato Langendorff utilizzando la valvola di riduzione della pressione (pressione tra 0 e 200 mbar).
      2. Preparare tampone di digestione immediatamente prima dell'uso: buffer di perfusione con 6 U Collagenasi B, 10.000 unità tripsina, e 50 micron CaCl _2. Rimuovere il buffer di perfusione e iniziare la digestione enzimatica aggiungendo 30 ml di acqua calda (37 ° C) e ossigenato tampone di digestione.
         NOTA: La quantità di Collagenasi B deve essere titolato seconda dell'attività di diversi lotti.
      3. Regolare il flusso ad una velocità di 1 goccia / s e digerire il cuore per 10 - 13 min. Per evitare la contaminazione, non utilizzare di nuovo l'efflusso. Trasferire il cuore ad un 10-cm capsula di Petri con 5 mL di tampone di digestione. Sezionare il tessuto manualmente con una pinza tenendo il cuore con un paio di pinze e con l'altra coppia di strappare il cuore in piccoli pezzi.
         NOTA: A questo punto, gli atri può essere separato, tagliato in piccolipezzi (con le forbici iris), e digerito per 30 minuti in 750 ml di tampone di digestione in incubatore a 37 ° C per ottenere cellule atriali isolate. Per ottenere cardiomiociti atriali puri, pipetta su e giù più volte con una pipetta da 1 ml. Arrestare la reazione enzimatica aggiungendo 750 ml di soluzione di stop.
      4. Arrestare la digestione con l'aggiunta di 5 ml di soluzione di arresto (buffer di perfusione con il 5% FBS e 50 micron CaCl _2). Usando una pipetta sierologica, filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cella 100 micron e raccogliere le cellule in una provetta da centrifuga da 50 mL. Centrifugare la sospensione cellulare filtrato a 80 xg per 1 minuto a temperatura ambiente.
      5. Eliminare il surnatante e risospendere delicatamente il pellet cellulare in 10 ml di soluzione di arresto con una pipetta sierologica 10 ml. Centrifugare la sospensione cellulare a 80 xg per 1 minuto a temperatura ambiente.
      6. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di terreno di coltura (IMDM con il 20% FCS, 0,1 mM aminoacidi non essenziali, 50 pg / mL ciascuno di penicillina e streptomicina, e 0,1 mM β-mercaptoetanolo) per la coltura. In alternativa, procedere al punto 2.2, "immunofluorescenza," e fissare le cellule.
      7. Per il fissaggio su piastre da 24 pozzetti, piatto 10.000 delle cellule isolate per pozzetto 8 ug / mL coprioggetto laminina rivestite in piastre da 24 pozzetti con 500 ml di terreno di coltura a 37 ° C e 5% CO ₂ per almeno 3 h .
2. Immunofluorescenza su cardiomiociti isolati Langendorff-in sospensione
   1. Fix cardiomiociti Langendorff isolate in 1 mL di 4% PFA in PBS, pH 7,4, per 15 min a temperatura ambiente. Centrifugare la sospensione cellulare a 800 xg per 2 minuti a temperatura ambiente, rimuovere il fissativo e lavare le cellule due volte con PBS.
   2. Risospendere i cardiomiociti fisse in 1 ml di PBS e sia procedere con la colorazione di immunofluorescenza o memorizzarli in 500 ml di PBS per pozzetto suuna piastra da 24 pozzetti a 4 ° C. Trasferire una parte della sospensione cellulare (~ 100 - 200 l) in una provetta. Centrifugare la sospensione cellulare a 800 xg per 2 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante.
   3. Permeabilize, blocco, e macchiare le cellule con anticorpo primario contro α-actinina aggiungendo 200 ml di anticorpo primario diluito 1: 400 in PBS con 0,2% Triton X-100 e 5% di siero asino per 1 ora a temperatura ambiente.
   4. Centrifugare a 800 xg per 2 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante. Lavare il pellet di cellule con PBS e centrifugare a 800 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e incubare in 200 ml di Alexa-Fluor-coniugato anticorpo secondario (anti-topo IgG1) diluito 1: 400 in tinta Hoechst (soluzione di lavoro: 1 mg / ml) per 1 ora a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
   5. Centrifugare a 800 xg per 2 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio. Proteggere il campione dalla luce. Resuspend le cellule nel 200 - 500 ml di PBS e trasferire 100 - 300 ml di sospensione cellulare in un pozzetto di una camera di microscopia. Chiudere il coperchio della camera e conservare le cellule a 4 ° C fino imaging. Proteggere dalla luce.
3. Analisi della nuclearità di cardiomiociti Langendorff isolate
   1. Prendere immagini dal cardiomiociti α-actinina-tinto con un obiettivo 25X, corrispondente ad un ingrandimento 250X. Contare il numero di nuclei H2B-MCH + solo in quei cardiomiociti che sono regolarmente macchiati da α-actinina e mostrano tipica forma di bastoncello morfologia e sono quindi considerate intatte.
   2. Contare almeno 100 cardiomiociti da tre diversi cuori. Calcolare le percentuali di mononucleari, binuclear, e cardiomiociti trinuclear.
      NOTA: in genere, le cellule binucleari dovrebbe costituiscono circa l'80 - 90%, mentre le cellule trinuclear e quelli con un maggior numero di nuclei sono rare (<1% in cardiomiociti Langendorff-isolate, <3% in fette spesse). cardiomiociti atriali sono significativamente più piccola di cardiomiociti ventricolari. Tipicamente, le cellule mononucleate costituiscono il 90% della popolazione totale.
4. L'isolamento, la fissazione e la crioconservazione dei cuori adulti come preparazione per fette spesse
   1. Assemblare un apparato perfusione per il fissaggio collegando una siringa da 50 ml a un rubinetto a 3 vie con un tubo di estensione Heidelberger ed un secondo rubinetto a 3 vie. Fissare la siringa in una posizione in modo tale che il flusso-through viene abilitato per gravità. Riempire il sistema con 15 ml di PBS.
   2. Seguire i passaggi 2.1.2.1-2.1.2.4, "preparazione cuore". Collegare la cannula iniezione G20x1 ½ con il cuore per l'adattatore Luer lock dell'apparato perfusione-PBS-riempite senza bolle e profumato con PBS. Riempire il sistema con 10 - 15 mL di formaldeide al 4% in PBS, che viene poi perfusi attraverso il cuore. Immersione fissare il cuore in una soluzione di formaldeide al 4% durante la notte.
   3. Sostituire la formaldeide 4%soluzione con PBS e lavare cuore in PBS su un agitatore orizzontale a 150 rpm per 8 ore a temperatura ambiente. Sostituire il PBS con una soluzione di saccarosio al 20% per disidratare cuore notte a 4 ° C.
   4. Congelare il cuore in medio crio-embedding in un piccolo stampo.
      1. Impostare un bicchiere pieno di 2-metilbutano e metterlo in un contenitore con ghiaccio secco. Mettere il cuore in uno stampo di congelamento precedentemente riempito a metà con crio mezzo di inclusione e coprire completamente con crio mezzo di inclusione. Posizionare con cura lo stampo nel bicchiere freddo, evitando il contatto del mezzo di crio-embedding con il 2-metilbutano. Conservare il tessuto congelato a -80 ° C fino al momento dell'uso.
5. Preparazione di fette spesse di cuore
   1. Utilizzare la seguente configurazione in un cryotome: una temperatura oggetto di -18 a -20 ° C, una temperatura della camera di -21 a -23 ° C, un angolo di compensazione sul porta-lama di 4 °, e le lame del microtomo Feather R35.
   2. Prendere la o crioconservatirgan dal contenitore congelamento e fissarlo sul disco dei campioni con il mezzo crio-embedding utilizzando lo scaffale di congelamento rapido. Posizionare cuore in modo tale che sezionamento inizia all'apice.
   3. Tagliare via fette di 50 micron fino a quando un piano di taglio uniforme è raggiunto e l'organo diventa visibile. Tagliare 50 micron fette di tessuto utilizzando la cryotome in modo manuale con una velocità lenta e con la piastra anti-rollio collocato sul coltello. fette di montaggio su vetrini da microscopio soluzione salina trattata. Lasciare le fette asciugare per 30 minuti a temperatura ambiente e conservare i campioni a -80 ° C o macchia direttamente.
6. La colorazione di fette di cuore di spessore (nuclei e membrane cellulari)
   1. Trattare fette cuore con RNasi A (20 mg / ml) in tampone di lavaggio (0,5 M NaCl, 0,1 M Tris pH 7,5, e 50 mM EDTA) in una cuvetta per 1 ora a 37 ° C. Incubare le fette in 0,2% Triton-X in tampone di lavaggio per 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare le fette due volte per 5 minuti ciascuno in tampone di lavaggio in una cuvetta su unaagitatore orizzontale a temperatura ambiente.
   2. Stain notte con 1 pM TO-PRO3 ioduro (642/661) e fluoresceina accoppiato germe di grano agglutinina (WGA, 1: 100) in tampone di lavaggio a 4 ° C. Lavare le fette di tre volte per 5 minuti ciascuno con tampone di lavaggio in cuvette su un agitatore orizzontale e coprirli con alcol polivinilico mezzo di montaggio con un reagente anti-sbiadimento e un vetrino di vetro.
7. Acquisizione dell'immagine
   1. Idealmente, utilizzare un microscopio confocale a scansione laser invertito dotato di 40X / 1.15 NA obiettivo acqua-immersione. Ricerca per occhio per un'area all'interno della fetta che si compone di cardiomiociti longitudinalmente allineati; a tal fine, il canale fluoresceina-WGA (Es .: 488 nm) è più adatto.
      NOTA: Questo passaggio è essenziale, come i limiti superiori e inferiori dei cardiomiociti dovrebbero essere visibili nel z-stack per successive analisi. Poiché la profondità di imaging è limitata a ~ 30 nm e lo spessore della fetta è 50 um, non è possibile imsezioni trasversali età di queste cellule (lunghezza delle cellule: ~ 120 micron).
   2. Regolare la messa a punto all'interno del software di imaging. Aprire il software di imaging. Aperte A1plus Impostazioni e selezionare le caselle di CH2, CH3 e CH4. Impostare Ch2 per eGFP, Ch3 a Alx546, e CH4 per Alx647 cliccando sul menu a tendina.
      1. Per ogni canale, cliccare su HV e impostarlo su 80 utilizzando la barra di scorrimento. Impostare l'offset a 0 utilizzando le barre di scorrimento. Fare clic sul pulsante "Home" per impostare il foro stenopeico alla posizione iniziale. Impostare il formato di scansione di 1.024 x 1.024 cliccando sul menu a tendina e fare clic su Ottimizza per aprire la finestra "XYZ Size Setup". Selezionare la casella "perfetto Voxel" sotto "Passo suggerito (z)".
   3. Clicca su "live scan" e regolare l'intensità del laser, cliccando sulle barre di scorrimento sui singoli canali. Selezionare la casella "Serie Z" sulla finestra "ND Acquisition" e fare clic sulla casella "definito dal pulsante in alto". Definire la parte superiore ePulsante della z-stack facendo clic sui pulsanti appropriati dopo aver regolato la messa a fuoco sul microscopio. Impostare la larghezza Z-passo a 0,5 micron.
      NOTA: La profondità della z-stack è limitata dalla penetrazione ottica all'interno del tessuto e il rapporto segnale-rumore.
   4. Vai a "A1plus Impostazioni" e impostare la linea di media / integrale per 2-4 facendo clic sul menu a tendina. Mettere a punto le intensità del laser; il foro deve essere il più piccolo possibile per immagine con un piano focale.
8. Analisi di nucleazione
   1. Aprire il software di analisi di immagine e caricare lo z-pila di interessi.
   2. determinare manualmente nucleazione nelle z-stack scorrendo attraverso i diversi strati della pila per identificare le cellule che si trovano completamente all'interno della pila; questo è il caso quando la colorazione WGA è visibile in tutte le dimensioni. Contare il numero di nuclei (la maggior parte di loro sarà binuclear) e segnare la cellula analizzata da un'annotazione nel software.
   3. Determinare il numero di nuclei cm (H2B-MCH +) e nuclei totali (TO-PRO3 +) in ricostruzioni 3D per i singoli canali (Figura 2D). Nel software di imaging, clicca su "binari" e scegliere "Definisci Soglia 3D" dal menu a tendina. Scegliere dal menu a tendina del canale sia Alx546 per il numero di nuclei CM o Alx647 per il numero di nuclei totali. Cliccando le frecce appropriate, impostare il programma per "4x Smooth", Clean 1x, e riempire i fori ON. Selezionare la casella "Dimensione" e impostarlo su 5 micron utilizzando la barra di scorrimento. Impostare la soglia utilizzando la barra di scorrimento fino a quando compaiono oggetti separati.
      NOTA: Dopo aver applicato la frammentazione, la finestra dei risultati mostra una tabella di eventi quantificati e una frammentazione di colore dell'immagine. Come alcuni nuclei contatti direttamente tra loro, correggere manualmente il risultato della misurazione automatica per doppietti, che potrebbero non essere separati correttamente dal software.

Risultati

Al fine di analizzare gli effetti di siRNA / miRNA sull'attività ciclo cellulare di cardiomiociti post-natale in vitro, cardiomiociti di topi Myh6-H2B-MCH / CAG-eGFP-anillin doppio transgenici sono stati isolati in postnatale giorno 3 (P3) e transfettate con ciclo cellulare attività che inducono miR199 ^5, siRNA p27, e siRNA Fzr1. Rispetto al controllo negativo (Figura 1A), le immagini di miR199- (Figura 1B) e siRNA ...

Discussione

C'è una polemica sul fatto cardiomiociti sono in grado di rientrare nel ciclo cellulare e dividere dopo l'infortunio e durante l'omeostasi dei tessuti. I valori per il fatturato base dei cardiomiociti hanno ricevuto nell'intervallo tra 1% e 80% ^{1 7.} Anche dopo una lesione cardiaca, l'induzione dell'attività ciclo cellulare e la generazione di nuovi cardiomiociti è stata riportata nella zona di confine, con valori compresi tra 0,0083%

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Sarstedt	821472
100 µm cell strainer	Becton Dickinson GmbH/Falcon	352360
2,3-Butanedione monoxime (BDM)	Sigma-Aldrich	B0753
G20x1 ½ injection cannula, Sterican	Braun, Melsungen	4657519
20 gauge needle	Becton Dickinson GmbH	301300
24-well plates	Becton Dickinson GmbH/Falcon	353047
2-Methyl-butane	Carl Roth GmbH + Co. KG	3927.1
37% formaldehyde solution	AppliChem GmbH	A0936,1000
3-way stopcock	B. Braun Medical Inc.	16494C
50 mL syringe	B. Braun Medical Inc.	8728810F
70% ethanol	Otto Fischar GmbH	27669
Alexa-Fluor-conjugated secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	115-605-205
Alpha-Aktinin EA-53, Mouse IgG	Sigma-Aldrich, Steinheim	A7811
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Cell Culture Microplate, 96 Well, Half Area	Greiner bio-one	675986
Collagenase B	Roche	11088815001
confocal microscope Eclipse Ti-E	Nikon
cryostat CM 3050S	Leica
donkey serum	Jackson Immuno Research, Suffolk, GB	017-000-121
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537
EDTA	Sigma-Aldrich	E4884
fetal calf serum	PromoCell, Heidelberg
Formaldehyde solution (4%)	PanReac AppliChem	A3697
Gelatine from porcine skin, Type A	Sigma-Aldrich, Steinheim	G2500
glass coverslips	VWR	631-0146
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Heidelberger extension tube	IMPROMEDIFORM GmbH	MF 1833
Heparin-Natrium	Ratiopharm	5394.02.00
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
HistoBond microscope slides	Marienfeld	0810000
Hoechst 33342 (1 mg/mL)	Sigma Aldrich, Taufkirchen	B2261
Insulin syringe	Becton Dickinson GmbH	300334
Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium (IMDM)	Gibco/Life Technologies, Darmstadt	21980-032
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
Laminin	Corning	354221
Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti	Nikoninstruments, Düsseldorf
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt	13778075
Mouse IgG Cy5 (donkey)	Jackson ImmunoResearch	715-175-151
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
microcentrifuge tube	Sarstedt	72690
Mini shaker	VWR	12620-940
mirVana miRNA mimic, hsa-miR199a-3p	Ambion/Thermo Fischer Scientific	4464066
Biopsy Mold	Sakura Finetek/ VWR	4565
M-slide 8-well ibiTreat	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaOH	Merck Millipore	567530
negative control(scrambled RNA)	Ambion/Thermo Fischer Scientific	AM4611
Neonatal Heart Dissociation Kit	Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach	130-098-373
NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit	Nikoninstruments, Düsseldorf
Non essential amino acids, NEAA	Gibco/Life Technologies, Darmstad	11140-035
Opti-MEM, Reduced Serum Medium	Gibco	51985-026
P21-siRNA	Ambion/Thermo Fischer Scientific	4390771
P27-siRNA	Ambion/Thermo Fischer Scientific	4390771
Penicillin/Streptomycin	Gibco/Life Technologies, Darmstadt	15140-122
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, Steinheim	14190-094
Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading	Sigma-Aldrich	10981
RNase A	Qiagen	1007885
RNaseZap	Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt	AM9780
sample containers	Vitlab	80731
Serological pipette	Greiner	607180
software NIS Elements	Nikon
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek/ VWR	25608-930
ToPro3 iodide (642/661)	Molecular probes/ThermoFisher Scientific	T3605
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X	Fluka	93418
Triton X-100	Fluka	93418
Trypsin	Sigma-Aldrich	T1426
Wheat germ agglutinin (WGA) Fluorescein labeled	Vector Laboratories	VEC-FL-1021-5
α-actinin antibody	Sigma-Aldrich	A7811
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich, Steinheim	M3148