Doğum sonrası kardiyomiyositlerde Hücre Döngüsü Varyasyonları görselleştirme ve Çekirdeklenme Belirlenmesi

Özet

To distinguish cell division from cell cycle variations in cardiomyocytes, we present protocols using two transgenic mouse lines: Myh6-H2B-mCh transgenic mice, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and CAG-eGFP-anillin mice, for distinguishing cell division from cell cycle variations.

Özet

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and cytokinesis) and acytokinetic mitosis (karyokinesis but no cytokinesis). Such atypical cell cycle variations result in polyploid and multinucleated cells rather than in cell division. Therefore, to determine cardiac turnover and regeneration, it is of crucial importance to correctly identify cardiomyocyte nuclei, the number of nuclei per cell, and their cell cycle status. This is especially true for the use of nuclear markers for identifying cell cycle activity, such as thymidine analogues Ki-67, PCNA, or pHH3. Here, we present methods for recognizing cardiomyocytes and their nuclearity and for determining their cell cycle activity. We use two published transgenic systems: the Myh6-H2B-mCh transgenic mouse line, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and the CAG-eGFP-anillin mouse line, for distinguishing cell division from cell cycle variations. Combined together, these two systems ease the study of cardiac regeneration and plasticity.

Giriş

kardiyomiyosit çekirdekleri ve hücre döngüsü durumu doğru tespiti kalp kası ciro ve yenilenme belirlenmesi için büyük önem taşımaktadır. Bu hücre siklusunu tanımlamak için bu tür pHH3, Ki-67, ya da Timidin analogları gibi, nükleer belirteçleri, kullanımı için de geçerlidir. Erişkin memeli kardiyomiyositlerinin proliferatif kapasitesi ^1, bir çoğalma tahlilinde sonucu önemli bir fark olabilir bir kardiyomyosit çekirdeğin proliferasyon belirteci için pozitif bir çekirdeğin bir sahte kimlik, çok küçük olduğu için. Ayrıca, kardiyomiyositlerde poliploid ve çok çekirdekli hücrelerde yerine hücre bölünmesi sonucu bu endoreduplication ve acytokinetic mitoz hücre döngüsünde varyasyonları, yatkındır. Bu amaçla, genel hücre döngüsü belirteçleri karşı antikor boyama yorumlanması her durumda kesin değildir.

Burada, biz düz forwa için yöntemler mevcut rd fare kardiyomiyositlerinin tanınması ve bunların çekirdeklerin kesin tanımlanması ile doğum sonrası ve yetişkin aşamalarında yerli izole hücreler ve kalın doku kesitlerinde onların nuclearity. Bu amaçla, Myh6 promoteri (Myh6-H2B-MCH) kontrolü altında insan histon H2B ve mCherry oluşan bir füzyon proteininin kardiyomiyosit spesifik ifadesi ile bir transgenik fare hattı ² kullanıldı. Bir EGFP-anillin füzyon proteinin ekspresyonu, bir CMV artırıcı ile yerde tavuk aktin promoterinin kontrolü altında olduğu bir transgenik proliferasyon göstergesi fare hattı ile fare hattı, çapraz yetiştirme (CAG-EGFP-anillin) sağlar hücre döngüsü durumunun belirlenmesi. Iskeleler proteini anillin özel olarak etkin olan hücreler ³ hücre döngüsü olarak ifade edilir ve hücre döngüsü sırasında ayırıcı hücre içi lokalizasyonu M faz yüksek çözünürlüğe sahip canlı izleme hücre döngüsü ilerlemesi sağlarEF "> 4. Bu nedenle, çift transgenik fareler çoğalan kardiyomiyositlerde ve hücre döngüsü şekilde değişikliklere uğrar olanlar arasında ayrım yapmak için kullanılabilir. Bu, in vitro proliferasyon uyaran maddelerin taranmasında özellikle faydalı olduğu ortaya çıkmaktadır.

Protokol

hayvanları da içeren bu protokol Tüm işlemler Bonn Üniversitesi etik standartlara uygun olarak ve bilimsel amaçlar için kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin Yönerge'de 2010 Avrupa Parlamentosu / 63 / EU gelen kurallarına uyulması.

Doğum Sonrası kardiyomiyositlerde Hücre Döngüsü Faaliyet Vitro Görselleştirme 1.

1. Doğum Sonrası kardiyomiyosit ayrışma
   1. Ön deney preparatlar
      1. Kültür ortamı (IMDM,% 1 Penisilin / Streptomisin,% 1 temel olmayan amino asitler,% 0.1 β-merkaptoetanol) hazırlanması; ortam 1:% 2 FCS ekleyin; Orta 2:% 20 FCS ekleyin.
      2. Ceket 96 çukurlu bir kültür çanağı (yarı büyüme alanı: 15 mm ²⁾ PBS çözeltisi içinde% 0.1 jelatin ile.
   2. kalp diseksiyonu
      1. PBS 15 ml ile Petri kabı hazırlayın ve buz üzerinde saklayın. Bir kuru cam boncuk sterilizatör koyarak iki cımbız ve küçük bir makas sterilize edin.
      2. dekapitasyon yenidoğan transgenik farelerin (CAG-eGFP-anillin / Myh6-H2B-MCH) Kurban. , Toraks açın Ehler ark açıklandığı gibi, kalbi teşrih. 2013 (J Vis Uzm .; (79):. 50154 doi: 10.3791 / 50154), ve buz gibi soğuk PBS aktarın. Bir sonraki fare üzerinde hareket ettirin.
      3. homozigot olmayan üreyen kullanılıyorsa, bir fluoresan mikroskobu ile transgenik kalpleri tanımlar. Bir floresan mikroskop altında PBS içinde kalpleri koyun. eGFP-anillin ifadesi olup olmadığını kontrol edin (Örn .: 488 nm; Em .: 509 nm) ve H2B-MCH ifade (Örn .: 587 nm; Em .: 610 nm) uygun filtre setleri ile.
   3. kardiyomiyosit izolasyonu
      1. Yenidoğan kalp ayrışma kiti kullanılarak seçilen kalpleri ayırmak. 5 dakika boyunca 37 ° C'de enzim karışımı 1 inkübe edin. Son enzim karışımı 1 ml elde enzim karışımı 2 55 uL enzim karışımı 1 945 mcL ekleyin.
      2. 1.5 mL r P6 farelere - 2 P4 gelen kalplerine P3 fareler veya yukarı - 4 P1 kalplerin kadar transfereaction enzim karışımı 1 mL içeren tüp ve makasla küçük parçalar halinde kalbini kesti. 15 ml'lik tepkime tüpleri içine solüsyonu aktarın.
      3. 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. doku ve enzimler arasındaki teması maksimize etmek için, inkübatör neredeyse yatay 15 ml tüp koydu. 5-ml pipet ile yukarı ve aşağı 10 kez - 5 pipetleme karıştırın. Bu adımı üç kez tekrarlayın.
      4. Enzim reaksiyonu durdurmak için bir orta 2 (% 20 FCS) 7.5 ml. 70 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu Filtre. bir orta 2 3 mL hücre süzgeci durulayın.
      5. 15 dakika boyunca 300 x g'de hücre süspansiyonu Santrifüj ve supernatant atın. ortam 1, 500 uL pelletini; Kırmızı kan hücresi parçalama başka deneyler için gerekli değildir. Pipet 10 hücre sayım odasına hücre süspansiyonu uL ve hücrelerin sayısını belirlemek.
      6. Tohum ortamının 1 120 uL (2% FCS) içinde oyuk başına 10,000 hücre: 96 oyuklu bir plaka için. yerBir inkübatör içine hücreleri (37 ° C ve% 5 _CO2) ve transfeksiyondan hemen devam edin.
2. siRNA'lar veya MiRNA'lar ile yenidoğan kardiyomiyositlerinin Transfeksiyon
   1. RNases kaldırmak için RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile bir tezgah silin. RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile aşağıdaki malzeme temizleyin: 10-uL, 100 uL ve 200 uL pipetler ve bir buz kutusu. buz üzerinde Çözülme siRNA stok alikotları (100 uM).
   2. Azaltılmış serum ortamı (azaltılmış serum ortamı + 2 uL siRNA 100 mcM stok 98 uL) si / miRNA'lar 2 mcM çalışma stokları hazırlayın. Bir çalışma stoğu aynı gün kullanılmalıdır. Donma tavsiye edilmez.
   3. (;: ~ 57 ila 140 nm uL nihai Si / MiRNA konsantrasyonu bir 96-çukurlu miktarında) 0.5 mL'lik bir reaksiyon tüpüne, düşük serum ortamı 6 uL 2 uM stokunun 4 ul ekle. Belirli si / miRNA'nın ile transfekte edilmesi kuyu sayısı için uygun bir birim seçin.
   4. transfeksiyon reaktif bir master karışımı hazırlayın. 10 mcL her kuyu için (transfeksiyon reaktif azaltılmış serum orta + 9.4 uL 0.6 uL) (96 kuyu toplam) kullanın.
   5. si ekle / miRNA transfeksiyon reaktif karışımı karıştırın. Buz üzerinde 5 dakika boyunca inkübe edin. her bir kuyunun içine pipetleyin 20 mcL. 37 ° C'de 48 saat% 5 _CO2 inkübe hücreleri ve daha sonra 24 saat ya da daha fazla sonra ortam 1 120 uL de her biri orta yerine, tespit ve immünofloresan boyama geçin.
3. Tespit ve immünofloresan boyama
   1. Ortamı çıkarın ve bir kez PBS ile yıkayın hücreleri. 20 dakika boyunca% 4 formaldehit çözeltisi hücreleri örtün. formaldehit çözüm çıkar ve bir kez PBS ile yıkama hücreleri ve daha sonra depolama için PBS ile onları karşılamak veya immün geçin.
   2. En az 2 saat boyunca% 0.2 Triton-X ve% 5 eşek serumu (üreticinin talimatlarına göre konsantrasyon) primer antikor ile inkübe edin.(:; Monoklonal anti-α-aktinin 400 dilüsyon 1) gece boyunca 4 ° C 'de, leke α-aktinin için boyama durumunda.
   3. Primer antikor çıkarın ve 3 defa PBS ile yıkayın. 400 ve ışıktan korunan, oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir: Hoechst çözeltisi 1 sekonder antikor ile seyreltilir. PBS ile 3 kez yıkanır, antikorunu çıkarın ve 4 ° C de depolama için, PBS ile hücrelerden kapsamaktadır.
4. Konfokal Video mikroskopi
   1. görüntü elde etmek için bir konfokal mikroskop kullanın. görüntüleme yazılımı açın. "A1plus Ayarları" açın ve CH1, CH2 ve CH3 kutularını işaretleyin. açılan menüden tıklayarak Cy4 için eGFP, Cy3 CH3 ve Ch4 DAPI, Ch2 için Ch1 ayarlayın.
      1. Her kanal için, HV tıklayın ve kaydırma çubuğunu kullanarak 80 olarak ayarlayın. kaydırma çubuklarını kullanarak ofset 0 olarak ayarlayın ve ana konumuna iğne deliği ayarlamak için "Ev" düğmesine tıklayın. açılan menüden tıklayarak 1024 x 1024 Tarama boyutunu ayarlayın.
      2. açmak için optimize tıklayın"XYZ Boyut Ayarı" penceresi. "Önerilen Adım (z)" başlığı altında "Mükemmel Voksel" kutusunu işaretleyin. resim az pozlanmış ne pozlanmış ne kadar lazer yoğunluklarını artırmak.
         NOT: Örneğin; Ch1 (DAPI):% 16, CH2 (EGFP):% 12, CH3 (Cy3):% 100, CH4 (Cy5):% 1. 0 tüm kanallar için Ofset ayarlayınız.
   2. 20X objektif (200X büyütme) kullanarak fotoğraf çekmek. Karo görüntüleri oluşan geniş bir görüntüyü taramak (örneğin, 3 x 3).
      1. görüntüleme yazılımı olarak, "Edinme" ve açılan menüden "büyük bir görüntü tara" seçeneğini gidin. Altında "Area" 3 x 3 tıklayın için "X ve Y alanların sayısı" açılan menüden "geçerli konumu sol üst köşesinde ise" ve set seçin "Tara."
5. Görüntü analizi
   1. H2B-Ch sinyalleri ve α-aktinin sinyalleri sayarak kardiyomiyositlerinin sayısını sayarak kardiyomiyosit çekirdeklerinin sayısını tanımlayın.
      1. "Tedbir" üzerine tıklayın ve açılan menüden "Elle Ölçüm" seçin. Bir sonraki açılan menüden "Sayımlar" seçiniz. böylece işaretleme ve bunları sayarak, H2B-MCH sinyalleri ile çekirdekler üzerine tıklayın. α-aktinin-pozitif hücreler için aynı şeyi kardiyomiyositlerinin numarasını almak için.
   2. Nükleer eGFP-anillin sinyalleri (eGFP-anillin + / H2BmCh + çekirdekleri) S / G2 fazı kardiyomiyositlerde sayın. "Tedbir" üzerine tıklayın ve açılan menüden "Elle Ölçüm" seçin. Bir sonraki açılan menüden "Sayımlar" seçiniz. üzerine tıklayarak eGFP-anillin sinyalleri ve H2B-MCH sinyalleri ile Mark çekirdekler.
   3. Bu sitoplazmik sinyal, kontraktil halkalar ve midbodies olarak mitoz özgü EGFP-anillin sinyalleri (örneğin, Şekil 1F ve G), kardiyomiyositlerde sayın. "Tedbir" üzerine tıklayın ve açılan menüden "Elle Ölçüm" seçin. Bir sonraki pul gelen "Sayımlar" seçinizldown menü. Mark üzerine tıklayarak mitoz özgü eGFP-anillin sinyalleri (örneğin, Şekil 1F ve G), sitoplazmik sinyalleri, kasılma halkaları ve midbodies ile kardiyomiyositlere.

Langendorff Disosiyasyon ve Kalın Doku Bölümler tarafından Yetişkin kardiyomiyositlerde çekirdeklenme 2. Belirlenmesi

1. Langendorff ayrışma yetişkin kardiyomiyositlerde izolasyonu
   1. Kalp diseksiyonu öncesi hazırlıklar
      1. heparin ile bir insülin şırıngası (30-gauge iğne) (20 ünite / g vücut ağırlığı) doldurun. ensesinden fareyi tutun. Asansör ve enjeksiyon için karın ortaya çıkarmak için geriye doğru fareyi açın.
      2. intraperitoneal gerçekleştirin. geri kafesin içine heparinize fare koyun ve kalp diseksiyonu başlamadan önce en az 15 dakika bekleyin. Durulama ve 5, Langendorff cihazından havalandırma - (perfüzyon tampon maddesi, 10 mL perfüzyon tamponu: 135 mM NaCI, 4 mM KCI, 1 mM MgC_2, 2.5 mM Hepes, 5 mM glikoz ve GKD ₂ O, 25 mM BDM) NaOH ile pH 7.4'e ayarlanır.
   2. kalp diseksiyonu
      1. soğutulmuş (4 ° C) PBS ile 10 cm'lik Petri kabı hazırlayın ve buz üzerine yerleştirin. Dolgu ve PBS ile bir kanül, (20 ölçü) bağlı bir 1 ml şırınga havalandırın. Petri kabı sınırında modelleme kil ile kanül sabitleyin. Biraz PBS yüzeyinin altında kanül ucu yerleştirin.
      2. servikal dislokasyon ile fare Kurban. % 70 etanol çözeltisi ile karın silin. cerrahi makas ile sternum orta karın bir kesi yapmak. diyaframı çıkarın ve cerrahi makas ile bilateral göğüs kafesi kesti.
      3. Kaldırın ve 20-gauge iğne ile sternum düzeltmek, göğüs boşluğu açın ve yavaşça anatomik forseps ile kalbi kavramak. kalbi kaldırın ve çıkış yolunun damarları keserek akciğer ve damar çıkarın.
         NOT: aorta tanımlamak ile kalbi konumlandırmak içinventral yüzü yukarı. Bu, her iki atriyum arasındaki mesafeyi azaltır, bu yüzden onun dalları ile aort kulakçıklar arasında bulunabilir. aort ana dal hala yeterince uzun ise bireysel kalp mimarisi bağlı olarak, dallar kaldırılabilir.
      4. soğutulmuş PBS içeren 10 cm'lik Petri kabı kalbi aktarın (adım 2.1.2.1 bakınız). doku hasarı önlemek için salınan bir çok araç tarafından baskılanmış yanıt gözlendi bir G20x1 ½ enjeksiyon kanül, üzerinde çıkan aort çekerek kalbi cannulate. kanül üzerinde bir iş parçacığı ile aort sabitleyin. Yavaşça şırınga pistonu iterek aşırı kan çıkarmak için PBS ile kalbi durulayın. Kalbin hafif genişleme görünür olmalıdır.
   3. Langendorff kalp ayrışma
      1. Langendorff perfüzyon aparatı de Luer kilit adaptörü hızla kanüle kalbi bağlayın. 1 damla / s akış hızıyla, 5 dakika boyunca 37 ° C 'de soğuk oksijenasyonlu perfüzyon tamponunda 30 mL kalp serpmek. the akış hızı basınç düşürme valfı (0 ile 200 mbar arasındaki basınç) ile Langendorff cihazı içinde O ₂ akışını düzenleyerek ayarlanabilir.
      2. 6 U Kollajenaz B, 10.000 adet Tripsin ve 50 uM _CaCl2 ile perfüzyon tamponu: kullanım hemen önce sindirim tampon hazırlayın. Perfüzyon tamponunu çıkarın ve (37 ° C), sıcak ve oksijenli sindirim tamponu, 30 mL eklenerek enzimatik sindirim başlar.
         Not: kollajenaz B miktarı, farklı yığınların aktivitesine bağlı olarak titre edilmesi gerekmektedir.
      3. 1 damla / sn'lik bir orana akışını ayarlamak ve 10 kalbi sindirmek - 13 dakika. kontaminasyonu önlemek için tekrar akışını kullanmayın. sindirim tampon 5 ml ile 10 cm'lik Petri kabı kalbi aktarın. forseps bir çift ile kalbi tutan ve küçük parçalar halinde kalbini rip diğer çiftini kullanarak forseps ile elle doku teşrih.
         NOT: Bu adımda, kulakçıklar küçük kesilmiş, ayrılabilirParçalar (iris makasları ile) ve izole edilmiş atrial hücreleri elde etmek için 37 ° C'de inkübatör içinde sindirim tamponu 750 mcL 30 dakika sindirilmiştir. 1 ml pipet kullanarak saf atriyal kardiyomiyositlerde, pipet yukarı ve aşağı birkaç kez almak için. durdurma çözeltisi 750 mcL ekleyerek enzim reaksiyonu durdurun.
      4. Durdurma çözeltisi 5 mL (% 5 FBS ve 50 uM _CaCl2 perfüzyon tamponu) eklenmesi ile sindirim durdurun. serolojik bir pipet kullanarak, bir 100-mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu filtre edilir ve bir 50-ml santrifüj tüpü içinde hücreleri toplamak. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 80 xg süzüldü hücre süspansiyonu santrifüj.
      5. Süpernatantı atın ve yavaşça 10 ml serolojik pipet kullanarak durdurma çözeltisi 10 ml hücre pelletini. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 80 xg'de hücre süspansiyonu santrifüj.
      6. Santrifüj işleminin ardından, süpernatan atılır ve% 20 FC ile kültür ortamında (IMDM 1 mL hücreleri tekrar süspansiyonS, 0.1 mM temel olmayan amino asitler, kültür için 50 ug / ml penisilin ve streptomisin, ve 0.1 mM β-merkaptoetanol) ekstrakte edildi. Alternatif, hücreler ", immünofloresan boyama" 2.2, adım ve düzeltmek için devam edin.
      7. En az 3 saat süreyle 37 ° C'de kültür ortamında 500 uL, 24 oyuklu plakalar içerisine 24 oyuklu plakalar üzerine tespit iyi 8 ug / ml laminin kaplı lamelleri başına izole edilmiş hücrelerin plaka 10.000 ve% 5 _CO2 için .
2. süspansiyonda Langendorff izole kardiyomiyositlerde üzerinde İmmünfloresan boyama
   1. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS içinde% 4 PFA 1 ml, pH 7.4 içinde Langendorff izole kardiyomiyositlerde düzeltildi. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 800 xg'de hücre süspansiyonu santrifüj Fiksatif çıkarın ve hücreleri iki kez PBS ile yıkayın.
   2. 1 mL PBS sabit kardiyomiyositlerde yeniden süspanse ve her iki immünofloresan boyama ile devam veya oyuk başına PBS 500 uL saklayın4 ° C'de 24 oyuklu plaka. mikrosantrifüj tüpüne - (200 uL ~ 100) hücre süspansiyonu bir parçası aktarın. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 800 xg'de hücre süspansiyonu santrifüj ve supernatant atın.
   3. Permeabilize, blok ve 1 seyreltilmiş birincil antikor, 200 uL eklenmesiyle α-aktinin karşı birincil antikor ile hücreleri leke: oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 0.2 Triton X-100 ve% 5 eşek serumu, PBS içinde 400.
   4. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 800 x g'de santrifüj ve supernatant atın. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 800 x g'de hücre PBS ile pelet ve santrifüj yıkayın. 1 seyreltilmiş süpernatan atılır ve Alexa Fluor-konjuge sekonder antikor 200 uL (anti-fare IgG1) inkübe: Hoechst boya 400 (çalışma çözeltisi: 1 mg / mL) ışıktan korunarak oda sıcaklığında 1 saat boyunca.
   5. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 800 x g'de santrifüj ve supernatant atın. bu adımı yineleyin. ışıktan örnek koruyun. R200 hücreleri esuspend - 500 ul PBS ve 100 aktarma - mikroskopi bölmesinin bir oyuk hücre süspansiyonu 300 uL. Odanın kapağını kapatın ve görüntüleme kadar 4 ° C'de hücreleri saklayın. Işıktan koruyunuz.
3. Langendorff izole kardiyomiyositlerin nuclearity Analizi
   1. Bir 250X büyütme karşılık gelen bir 25X amacı ile α-aktinin lekeli kardiyomiyositlere görüntüleri çekin. Sadece düzenli olarak α-aktinin ile boyandı ve tipik çubuk şeklinde bir yapıya göstermek ve bu nedenle sağlam olduğu varsayılır olan bu kardiyomiyositlerde H2B-MCH + çekirdeklerin sayısını.
   2. Üç farklı kalpleri en az 100 kardiyomiyositlerde sayın. mononükleer, iki çekirdekli ve trinuclear kardiyomiyositlerinin yüzdelerini hesaplayınız.
      NOT: - trinuclear hücreler ve çekirdekler daha fazla sayıda olan Langendorff izole kardiyomiyositlerde <% 1 (nadir iken <,% 90 Tipik olarak, iki çekirdekli hücreler yaklaşık 80 kadar yapmak gerekirkalın dilimler halinde% 3). Atriyal kardiyomiyositlerde ventriküler kardiyomiyositlerde önemli ölçüde daha küçüktür. Tipik olarak, mononükleer hücreler toplam nüfusun% 90'ını oluşturan.
4. kalın dilimler için hazırlık olarak izolasyonu, tespit ve yetişkin kalpleri dondurma
   1. Bir Heidelberger uzatma borusu ve bir ikinci 3-yollu bir 3-yollu bir 50 ml şırınga bağlanarak tespit için bir perfüzyon cihazına monte edin. Bu akış yerçekimi etkindir şekilde bir stand şırınga sabitleyin. 15 ml PBS ile doldurun.
   2. adımları 2.1.2.1-2.1.2.4 takip "kalp hazırlanması." kabarcık-ücretsiz-PBS dolu perfüzyon aparatının Luer kilit adaptörü kalp ile G20x1 ½ enjeksiyon kanülü takın ve PBS ile serpmek. Daha sonra kalp ile perfüze PBS içinde% 4 formaldehit 15 mL, - 10 ile doldurun. Immersion gecede% 4 formaldehit çözeltisi içinde kalbi düzeltmek.
   3. % 4 formaldehit değiştirinPBS ile çözeltisi ve oda sıcaklığında 8 saat süre ile 150 rpm'de bir yatay çalkalayıcı üzerinde PBS içerisinde kalp yıkayın. 4 ° C'de bir gece kalp kurutmak için% 20 sukroz çözeltisi ile PBS değiştirin.
   4. Küçük bir kalıpta cryo gömme ortamındaki kalbi dondurun.
      1. 2-metilbütan ile dolu bir beher kurmak ve kuru buz ile bir kutu koyun. Daha önce cryo gömme ortamı ile yarım dolu bir dondurucu kalıp içine kalp koymak ve cryo gömme orta ile tamamen örtün. Dikkatle 2-metilbütan ile cryo-gömülü maddenin temasını engelleyerek, soğuk behere kalıp yerleştirin. kullanılana kadar -80 ° C'de dondurulmuş doku saklayın.
5. Kalın kalp dilim hazırlanması
   1. -18 Ila -20 ° C arasında bir amacı, ısı, -21 -23 ° C arasında bir oda sıcaklığı, 4 ° bıçak tutucu bir temizleme açısı ve tüy R35 mikrotom bıçakları: izlenerek kriyotom kurulumunu kullanın.
   2. Kriyoprezerve o atındondurma kabından rgan ve hızlı dondurma rafı kullanarak cryo gömme ortamı ile örnek diskte sabitleyin. kesit tepesinde başlar şekilde kalp yerleştirin.
   3. Eşit kesim düzlemi elde ve organ görünür hale gelene kadar 50 mikron dilimleri uzak trim. yavaş hız ve bıçak yerleştirilen anti-roll plaka ile manuel modda kriyotom kullanılarak 50-iM doku dilimleri kesin. tuzlu tedavi edilen mikroskop lamı üzerine monte dilimleri. Dilimler, oda sıcaklığında 30 dakika süre ile kurumaya bırakın ve doğrudan bu C ya da leke -80 ° slaytlar saklayın.
6. Kalın kalp dilim boyanması (çekirdekleri ve hücre zarları)
   1. 37 ° C'de 1 saat boyunca bir küvet içinde yıkama tamponu (0.5 M NaCI, 0.1 M Tris pH 7.5, 50 mM EDTA) içinde RNAz A (20 ug / mL) ile, kalp dilimleri tedavi edin. Oda sıcaklığında 30 dakika süre ile tampon yıkama% 0.2 Triton-X dilimleri inkübe edin. Bir ilgili bir küvet içinde yıkama tamponunda her biri 5 dakika iki kez dilimleri yıkayınOda sıcaklığında yatay çalkalayıcı.
   2. Leke, gece boyunca 1 uM-PRO3 iyodür (642/661) ve floresan bağlanmış buğday tohumu aglutinin (WGA, 1: 100) ile 4 ° C'de yıkama tamponunda. yatay çalkalayıcıda küvetlerde yıkama tamponu ile 5 dakika her biri için dilimleri üç kez yıkayın ve bir anti-solma tepkin maddesi ve bir cam lamel polivinilalkol montaj orta ile kapsar.
7. Görüntü edinme
   1. İdeal olarak, 40X / 1.15 NA suda daldırma objektif ile donatılmış bir ters odaklı lazer tarama mikroskopu kullanın. uzunlamasına çizgili kardiyomiyositlerinin oluşan dilim içinde bir alan için göz göre ara; Bu amaçla, floresan WGA kanalı (örn .: 488 nm) uygundur.
      NOT: kardiyomiyositlerinin alt ve üst sınırları, daha sonra analiz için z yığının içinde görünür olması gerektiği gibi Bu adım, esastır. Görüntüleme derinliği 30 nm ~ ile sınırlıdır ve dilimin kalınlığı 50 um olduğu için, im mümkün değildirBu hücrelerin yaş kesitleri (hücre uzunluğu: ~ 120 mikron).
   2. görüntüleme yazılımı içinde kurulum ayarlayın. görüntüleme yazılımı açın. Açık A1plus Ayarlar CH2, CH3 ve Ch4 için onay kutularını ve. açılan menüden tıklayarak Alx647 için, Alx546 CH3 ve CH4 EGFP için Kn2 ayarlayın.
      1. Her kanal için, HV tıklayın ve kaydırma çubuğunu kullanarak 80 olarak ayarlayın. Set kaydırma çubuklarını kullanarak 0'a Ofset. ana konumuna iğne deliği ayarlamak için "Ev" butonuna tıklayın. açılan menüden tıklayarak 1024 x 1024 Tarama boyutunu ayarlayın ve "XYZ Boyut Ayarı" penceresini açmak için optimize tıklatın. "Önerilen Adım (z)" başlığı altında "Mükemmel Voksel" kutusunu işaretleyin.
   3. "Canlı tarama" üzerine tıklayın ve bireysel kanallarında kaydırma çubukları tıklayarak lazer yoğunlukları ayarlayın. "ND Toplama" penceresinde "Z Serisi" kutusunu işaretleyin ve "üst düğmesi ile tanımlanan" kutusuna tıklayın. üst tanımlayın vemikroskop odak ayarladıktan sonra uygun düğmeleri tıklayarak z yığının düğmesine basın. 0.5 mikron z adım genişliğini ayarlayın.
      Not: z yığın derinliği doku ve sinyal-gürültü oranı olan, optik nüfuz ile sınırlıdır.
   4. "A1plus Ayarlar" gidin ve açılan menüden tıklayarak 2-4 İntegral Hat Ortalama / ayarlayın. İnce ayar lazer yoğunlukları; İğne deliği bir odak düzleminde görüntü için mümkün olduğu kadar küçük olmalıdır.
8. nükleasyon analizi
   1. Görüntü analiz yazılımı açın ve ilgi z-yığını yükleyin.
   2. El ile yığının içinde tamamen yalan hücreleri belirlemek için yığının farklı katmanlar gezinerek z-yığınlarının içinde çekirdeklenme belirlemek; WGA boyama her boyutta görünür olduğunda bu böyledir. çekirdeklerin sayısını (çoğu iki çekirdekli olacak) ve yazılımdaki bir açıklama ile analiz hücreyi işaretleyin.
   3. CM çekirdekleri (H2B-MCH +) ve tek kanallara (Şekil 2B) 3D rekonstrüksiyonlarında (TO-PRO3 +) toplam çekirdeklerin sayısını belirler. görüntüleme yazılımı olarak, "İkili" tıklayın ve açılan menüden "Eşik 3D tanımla" seçin. toplam çekirdeklerin sayısı CM çekirdekleri veya Alx647 sayısı için kanal açılan menüden ya Alx546 seçin. Uygun okları tıklayarak programı için "Smooth 4x" Temiz 1x ayarlayın ve AÇIK Delik doldurun. "Boyut" kutusunu işaretleyin ve kaydırma çubuğunu kullanarak 5 mikron ayarlayın. Ayrı nesneler görünür kadar kaydırma çubuğunu kullanarak eşiğini ayarlayın.
      NOT: parçalanma uygulandıktan sonra, sonuçlar penceresi sayısal olaylar ve görüntünün renkli bir parçalanma bir tablo göstermektedir. Bazı çekirdekler birbirleriyle doğrudan temas gibi, elle doğru yazılım tarafından ayrılmış olabilir çiftler için otomatik ölçüm sonucunu düzeltin.

Sonuçlar

In vitro doğum sonrası kardiyomiyositlerinin çift transgenik Myh6-H2B-AÇS / CAG-eGFP-anillin farelerin kardiyomiyositlerinin hücre döngüsü aktivitesi üzerine siRNA'lar / miRNA'ların etkilerini analiz etmek için doğum sonrası 3. günde (P3) üzerine izole edildi ve transfekte hücre döngüsü aktivitesi indükleyici miR199 ^5, siRNA p27'yi ve siRNA Fzr1. Negatif kontrol (Şekil 1A) ile karşılaştırıldığında,...

Tartışmalar

kardiyomiyositlerde hücre döngüsünü tekrar girin ve yaralanma sonrası ve doku homeostazında sırasında bölmek mümkün olmadığı üzerinde bir tartışma vardır. Kardiyomiyositlerinin temel ciro değerleri% 1 ¹ ve% 80 ⁷ aralığında verilmiştir. % 40 - ⁷ da kardiyak lezyon sonrası, hücre döngüsü aktivitesinin indüksiyonu ve yeni kardiyomiyositlerde üretimi 0.0083,% ⁸ ve 25 arasında değerler ile, sınır...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Sarstedt	821472
100 µm cell strainer	Becton Dickinson GmbH/Falcon	352360
2,3-Butanedione monoxime (BDM)	Sigma-Aldrich	B0753
G20x1 ½ injection cannula, Sterican	Braun, Melsungen	4657519
20 gauge needle	Becton Dickinson GmbH	301300
24-well plates	Becton Dickinson GmbH/Falcon	353047
2-Methyl-butane	Carl Roth GmbH + Co. KG	3927.1
37% formaldehyde solution	AppliChem GmbH	A0936,1000
3-way stopcock	B. Braun Medical Inc.	16494C
50 mL syringe	B. Braun Medical Inc.	8728810F
70% ethanol	Otto Fischar GmbH	27669
Alexa-Fluor-conjugated secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	115-605-205
Alpha-Aktinin EA-53, Mouse IgG	Sigma-Aldrich, Steinheim	A7811
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Cell Culture Microplate, 96 Well, Half Area	Greiner bio-one	675986
Collagenase B	Roche	11088815001
confocal microscope Eclipse Ti-E	Nikon
cryostat CM 3050S	Leica
donkey serum	Jackson Immuno Research, Suffolk, GB	017-000-121
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537
EDTA	Sigma-Aldrich	E4884
fetal calf serum	PromoCell, Heidelberg
Formaldehyde solution (4%)	PanReac AppliChem	A3697
Gelatine from porcine skin, Type A	Sigma-Aldrich, Steinheim	G2500
glass coverslips	VWR	631-0146
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Heidelberger extension tube	IMPROMEDIFORM GmbH	MF 1833
Heparin-Natrium	Ratiopharm	5394.02.00
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
HistoBond microscope slides	Marienfeld	0810000
Hoechst 33342 (1 mg/mL)	Sigma Aldrich, Taufkirchen	B2261
Insulin syringe	Becton Dickinson GmbH	300334
Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium (IMDM)	Gibco/Life Technologies, Darmstadt	21980-032
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
Laminin	Corning	354221
Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti	Nikoninstruments, Düsseldorf
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt	13778075
Mouse IgG Cy5 (donkey)	Jackson ImmunoResearch	715-175-151
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
microcentrifuge tube	Sarstedt	72690
Mini shaker	VWR	12620-940
mirVana miRNA mimic, hsa-miR199a-3p	Ambion/Thermo Fischer Scientific	4464066
Biopsy Mold	Sakura Finetek/ VWR	4565
M-slide 8-well ibiTreat	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaOH	Merck Millipore	567530
negative control(scrambled RNA)	Ambion/Thermo Fischer Scientific	AM4611
Neonatal Heart Dissociation Kit	Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach	130-098-373
NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit	Nikoninstruments, Düsseldorf
Non essential amino acids, NEAA	Gibco/Life Technologies, Darmstad	11140-035
Opti-MEM, Reduced Serum Medium	Gibco	51985-026
P21-siRNA	Ambion/Thermo Fischer Scientific	4390771
P27-siRNA	Ambion/Thermo Fischer Scientific	4390771
Penicillin/Streptomycin	Gibco/Life Technologies, Darmstadt	15140-122
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, Steinheim	14190-094
Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading	Sigma-Aldrich	10981
RNase A	Qiagen	1007885
RNaseZap	Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt	AM9780
sample containers	Vitlab	80731
Serological pipette	Greiner	607180
software NIS Elements	Nikon
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek/ VWR	25608-930
ToPro3 iodide (642/661)	Molecular probes/ThermoFisher Scientific	T3605
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X	Fluka	93418
Triton X-100	Fluka	93418
Trypsin	Sigma-Aldrich	T1426
Wheat germ agglutinin (WGA) Fluorescein labeled	Vector Laboratories	VEC-FL-1021-5
α-actinin antibody	Sigma-Aldrich	A7811
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich, Steinheim	M3148