ויזואליזציה של וריאציות מחזור התא וקביעת נוקלאציה ב אחרי לידה cardiomyocytes

Summary

To distinguish cell division from cell cycle variations in cardiomyocytes, we present protocols using two transgenic mouse lines: Myh6-H2B-mCh transgenic mice, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and CAG-eGFP-anillin mice, for distinguishing cell division from cell cycle variations.

Abstract

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and cytokinesis) and acytokinetic mitosis (karyokinesis but no cytokinesis). Such atypical cell cycle variations result in polyploid and multinucleated cells rather than in cell division. Therefore, to determine cardiac turnover and regeneration, it is of crucial importance to correctly identify cardiomyocyte nuclei, the number of nuclei per cell, and their cell cycle status. This is especially true for the use of nuclear markers for identifying cell cycle activity, such as thymidine analogues Ki-67, PCNA, or pHH3. Here, we present methods for recognizing cardiomyocytes and their nuclearity and for determining their cell cycle activity. We use two published transgenic systems: the Myh6-H2B-mCh transgenic mouse line, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and the CAG-eGFP-anillin mouse line, for distinguishing cell division from cell cycle variations. Combined together, these two systems ease the study of cardiac regeneration and plasticity.

Introduction

זיהוי הנכון של גרעיני cardiomyocyte ומעמד מחזור התא הוא בעל חשיבות מכרעת לקביעה ממחזור שריר לב והתחדשות. זה נכון במיוחד עבור שימוש סמנים גרעיניים, כגון pHH3, Ki-67, או אנלוגים תימידין, לזיהוי פעילות מחזור התא. כמו יכולת השגשוג של cardiomyocytes היונק בוגרים הוא קטן מאוד ^1, זיהוי שווא של גרעין חיובי עבור סמן הפצת גרעין cardiomyocyte יכול לעשות הבדל מכריע התוצאה של assay התפשטות. יתר על כן, cardiomyocytes נוטה וריאציות של מחזור התא, כגון endoreduplication ו מיטוזה acytokinetic, אשר תוצאת תאי polyploid ו multinucleated ולא חלוקת תא. לשם כך, הפירוש של מכתים נוגדן כנגד סמני מחזור התא משותפים הוא לא מכריע בכל המקרים.

כאן, אנו מציגים שיטות הישר forwa הכרה rd של cardiomyocytes עכבר nuclearity שלהם בתאים יליד מבודד וקטעי רקמה עבה שלבי הלידה ומבוגרים על ידי זיהוי חד-משמעי של הגרעינים שלהם. לצורך כך, קו עכבר מהונדס עם ביטוי cardiomyocyte הספציפי של חלבון היתוך מורכב H2B היסטון אדם mCherry תחת השליטה של אמרגן Myh6 (Myh6-H2B-MCH) שמש ^2. הכלאות קו העכבר הזה עם קו עכבר מחוון התפשטות מהונדס, שבו הביטוי של חלבון היתוך eGFP-anillin הוא תחת השליטה של ​​האמרגן יקטין עוף בכל המקום עם משפר CMV (CAG-eGFP-anillin), מאפשר בקביעת סטטוס מחזור התא. Anillin פיגומי החלבון מתבטא במיוחד בתאים פעילים-מחזור תא ^3, ולוקליזציה subcellular ההפרש שלה במהלך מחזור התא מאפשרת התקדמות מחזור התא חי-מעקב עם רזולוציה גבוהה של M-שלבEF "> 4. לכן, העכברים המהונדסים הכפולים יכולים לשמש כדי להיפלות בין cardiomyocytes מתרבה ואלה עוברים וריאציות מחזור התא. זה מוכיח שימושי במיוחד הקרנה לגילוי חומרי התרמת התפשטות במבחנה.

Protocol

כל הנהלים של פרוטוקול זה של בעלי-חיים היו בהתאם לסטנדרטים האתיים של אוניברסיטת בון ומילוי כל התחייבויותיו לפי ההדרכה של הדירקטיבה 2010/63 / האיחוד האירופי הפרלמנט האירופי על ההגנה על בעלי החיים המשמשים למטרות מדעיות.

1. במבחנה ויזואליזציה של פעילות מחזור התא ב אחרי לידה cardiomyocytes

1. דיסוציאציה cardiomyocyte אחרי לידה
   1. תכשירי קדם-ניסיוני
      1. כן תקשורת ותרבות (IMDM, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 1% חומצות אמינו לא חיוניות, 0.1% β-mercaptoethanol); בינוני 1: להוסיף FCS 2%; בינוני 2: להוסיף FCS ל -20%.
      2. מעיל צלחת תרבות 96-היטב (אזור חצי-צמיחה: 15 מ"מ ²⁾ עם ג'לטין 0.1% בפתרון PBS.
   2. לנתיחת לב
      1. הכינו צלחת פטרי עם 15 מ"ל של PBS ולאחסן אותו על הקרח. לעקר שני פינצטה ומספריים קטנים על ידי לשים אותם מעקר חרוז זכוכית יבש.
      2. קורבן עכברים מהונדסים בילוד (CAG-eGFP-anillin / Myh6-H2B-MCH) על ידי עריפת ראש. פתח את בית החזה, לנתח את הלב החוצה, כמתואר אל Ehler et. 2013 (J Vis Exp .; (79):. 50,154 doi: 10.3791 / 50,154), ולהעביר אותו אל PBS קר כקרח. על מנת להעביר את העכבר הבא.
      3. אם אתה משתמש זוגות רבייה שאינם הומוזיגוטים, לזהות את ליבם מהונדס באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מכניסים את הלב ב PBS תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בדוק ביטוי eGFP-anillin (אקס .: 488 ננומטר; Em .: 509 ננומטר) וביטוי H2B-MCH (אקס .: 587 ננומטר; Em .: 610 ננומטר) עם מערכות הסינון המתאים.
   3. בידוד cardiomyocyte
      1. לנתק את הלבבות שנבחרו באמצעות ערכת דיסוציאציה לב בילוד. דגירת תמהיל האנזים 1 ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. כדי להשיג 1 מ"ל של תמהיל האנזים הסופי, להוסיף 945 μL של תמהיל האנזים 1 כדי 55 μL של אנזים לערבב 2.
      2. העבר עד 4 לבבות מ P1 - עכברים P3 או עד 2 לבבות מ P4 - עכברים P6 אל r 1.5 מ"לצינור eaction המכיל 1 מ"ל של תמהיל האנזים וחותכים את הלב לחתיכות קטנות עם מספריים. מעבירים את הפתרון ל -15 צינורות תגובה מ"ל.
      3. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. כדי למקסם את הקשר בין רקמות האנזימים, לשים את הצינור 15 מ"ל כמעט אופקית בחממה. מערבבים על ידי pipetting 5 - 10 פעמים למעלה ולמטה עם טפטפת של 5 מ"ל. חזור על פעולה זו שלוש פעמים.
      4. להוסיף 7.5 מ"ל של מדיום 2 (20% FCS) כדי לעצור את התגובה אנזים. סנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר. יש לשטוף את מסננת תא עם 3 מ"ל של מדיום 2.
      5. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 300 × גרם במשך 15 דקות וזורקים supernatant. Resuspend גלולה ב 500 μL של המדיום 1; תמוגה תא דם אדום אינה נדרשת עבור ניסויים נוספים. Pipet 10 μL של ההשעיה תא אל תא ספירת תאים ולקבוע את מספר התאים.
      6. על צלחת 96-היטב: זרע 10,000 תאים לכל היטב 120 μL של המדיום 1 (2% FCS). מקוםאת התאים לתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂₎ פנה מיד transfection.
2. Transfection של cardiomyocytes בילוד עם siRNAs או miRNAs
   1. נגב ספסל עם פתרון טיהור RNase להסיר את RNases. נקו את החומר הבא עם פתרון טיהור RNase: 10-μL, 100-μL, ו טפטפות 200 μL ותיבת קרח. aliquots המניות ההפשרה siRNA (100 מיקרומטר) על קרח.
   2. כן 2 מיקרומטר מניות עובדים של סי / miRNAs במדיום סרום מופחת (98 μL של מדיום סרום המופחת + 2 μL של siRNA 100 מיקרומטר מניות). המנייה עובדת אמורה לשמש באותו היום. הקפאה אינה מומלצת.
   3. הוסף 4 μL של המניה 2 מיקרומטר עד 6 μL של מדיום סרום מופחת לצינור התגובה 0.5 מ"ל (הסכום עבור אחד 96-היטב; סי הסופי / ריכוז מירנה 140 μL: ~ 57 ננומטר). בחר נפח מתאים עבור מספר הבארות להיות transfected עם סי מסוים / מירנה.
   4. להכין תערובת מאסטר של מגיב transfection. השתמש 10 μL (0.6 μL של מגיב transfection + 9.4 μL של מדיום בסרום מופחת) עבור כל טוב (96 בארות בסך הכל).
   5. מוסיפים את סי / מירנה לערבב לתערובת מגיב transfection. דגירה במשך 5 דקות על קרח. Pipet 20 μL לבאר כל אחד. דגירת התאים למשך 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ ולאחר מכן להחליף את המדיום בכל טוב עם 120 μL של מדיום 1. לאחר 24 שעות או יותר, המשך קיבעון והכתים immunofluorescence.
3. מכתים קיבוע immunofluorescence
   1. הסר בינוני לשטוף את התאים פעם עם PBS. לכסות את התאים עם פתרון פורמלדהיד 4% במשך 20 דקות. תוריד את פתרון פורמלדהיד לשטוף את התאים פעם עם PBS, ולאחר מכן לכסות אותם עם PBS לאחסון או להמשיך immunostaining.
   2. דגירה עם נוגדן ראשוני (ריכוז פי הוראות היצרן) בסרום חמור 0.2% Triton-X ו -5% עבור h 2 לפחות.אם מכתים עבור-actinin α (דילול 1: 400;-actinin אנטי-α monoclonal), כתם לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
   3. הסר את הנוגדן הראשוני לשטוף 3 פעמים עם PBS. לדלל את הנוגדן משני Hoechst פתרון 1: 400 ו דגירה של 1 ש 'ב RT מוגן מפני אור. הסר את הנוגדן, לשטוף עם 3 פעמים PBS, ולכסות את התאים עם PBS לאחסון על 4 מעלות צלזיוס.
4. מיקרוסקופיה וידאו Confocal
   1. שימוש במיקרוסקופ confocal לרכישת התמונה. פתח את תוכנת ההדמיה. פתח "A1plus הגדרות" וסמן את התיבות עבור CH1, CH2, ו CH3. הגדר CH1 כדי DAPI, CH2 כדי eGFP, CH3 כדי Cy3, ו CH4 כדי Cy4 ידי לחיצה על התפריט הנפתח.
      1. עבור כל ערוץ, לחץ על HV ולהגדיר אותו 80 באמצעות סרגל המחוון. הגדר את קיזוז ל -0 באמצעות הסורגים המחוון, ולחץ על כפתור "בית" כדי להגדיר את חריר לעמדת המוצא. הגדר את גודל סריקה 1,024 x 1,024 על ידי לחיצה על התפריט הנפתח.
      2. לחץ אופטימיזציה לפתוח"XYZ גודל Setup" חלון. בדוק "Perfect Voxel" התיבה "השלב המוצע (z)". הגדל את עוצמות הליזר עד שהתמונה אינה חשיפה חסרה ולא מחשיפת יתר.
         הערה: לדוגמה; CH1 (DAPI): 16%, CH2 (eGFP): 12%, CH3 (Cy3): 100%, CH4 (Cy5): 1%. הגדר את הקיזוז עבור כל הערוצים לעיצוב 0.
   2. צלם תמונות באמצעות מטרת 20X (גדלת 200X). סריקת תמונה גדולה המורכבת תמונות אריח (למשל, 3 x 3).
      1. בשנת תוכנת ההדמיה, ללכת "רוכש" ובחר "סרוק תמונה גדולה" מהתפריט הנפתח. תחת "פינת" לבחור "את המיקום הנוכחי הוא בפינה השמאלית העליונה" מהתפריט הנפתח ולהגדיר "מספר שדות ב X ו- Y" עד 3 x 3. לחץ "סריקה".
5. ניתוח תמונה
   1. הגדר את מספר הגרעינים cardiomyocyte ידי ספירת אותות-Ch H2B ומספר cardiomyocytes ידי ספירת אותות-actinin α.
      1. לחץ על "מדוד" ובחר "מדידה ידנית" מתוך התפריט הנפתח. בחר "ספירות" מתוך התפריט הנפתח הבא. הקישו על גרעינים עם אותות H2B-MCH, ובכך לסימון לספור אותם. לעשות את אותו הדבר עבור תאים-חיוב α-actinin כדי לקבל את מספר cardiomyocytes.
   2. הרוזן S / cardiomyocytes שלב G2 עם אותות eGFP-anillin גרעיני (eGFP-anillin + / H2BmCh + גרעינים). לחץ על "מדוד" ובחר "מדידה ידנית" מתוך התפריט הנפתח. בחר "ספירות" מתוך התפריט הנפתח הבא. סמן את הגרעינים עם אותות eGFP-anillin אותות H2B-MCH על ידי לחיצה עליהם.
   3. ספירת cardiomyocytes עם אותות מיטוזה ספציפי eGFP-anillin (למשל, איור 1F ו- G), כגון אותות cytoplasmatic, טבעות התכווצות, ו midbodies. לחץ על "מדוד" ובחר "מדידה ידנית" מתוך התפריט הנפתח. בחר "ספירות" מן pul הבאתפריט ldown. מארק cardiomyocytes עם אותות מיטוזה ספציפי eGFP-anillin (למשל, איור 1F ו- G), אותות cytoplasmatic, טבעות התכווצות, ו midbodies על ידי לחיצה עליהם.

2. קביעת נוקלאציה למבוגרים cardiomyocytes ידי Langendorff דיסוציאציה וקטעי רקמה עבה

1. בידוד של cardiomyocytes מבוגר על ידי ניתוק Langendorff
   1. כנות לפני לנתיחת לב
      1. למלא מזרק אינסולין (מחט 30-מד) עם הפרין (20 יחידות / g משקל גוף). אחוז את העכבר על ידי בעורפו. רם ולהפוך את העכבר אחורה כדי לחשוף את הבטן להזרקה.
      2. בצע זריקה intraperitoneal. שים את העכבר heparinized בחזרה אל תוך הכלוב להמתין לפחות 15 דקות לפני תחילת לנתיחה הלב. שטפו לאוורר את המנגנון Langendorff עם 5 - 10 מ"ל של חיץ זלוף (חיץ זלוף: 135 mM NaCl, KCl 4 מ"מ, 1 מ"מ MgCl_2, 2.5 מ"מ HEPES, 5 גלוקוז מ"מ, 25 מ"מ BDM DDH ₂ O, להסתגל 7.4 pH עם NaOH).
   2. לנתיחת לב
      1. הכינו צלחת 10 ס"מ פטרי עם מצונן (4 ° C) PBS ומניחים אותו על קרח. מילוי לאוורר מזרק 1 מ"ל מחובר (מד 20) צינורית עם PBS. תקן צינורית עם פלסטלינה בגבול של צלחת פטרי. מניחים את קצה הצינורית מעט מתחת לפני השטח PBS.
      2. להקריב את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם. נגב את הבטן עם פתרון אתנול 70%. עושים חתך מהבטן באמצע אל עצם החזה עם מספריים כירורגיות. הסר את הסרעפת לחתוך את החזה בילטרלי עם מספריים כירורגיות.
      3. רם ולתקן את עצם החזה עם מחט 20-מד, לפתוח את חלל בית החזה, בעדינות לתפוס את הלב עם מלקחיים אנטומי. הרם את הלב ולהסיר אותו מריאות כלי הדם על ידי חיתוך הכלי של דרכי היצוא.
         הערה: כדי לזהות את אבי העורקים, מקם את הלב עםלמעלה בצד הגחון שלה. זה מקטין את המרחק בין שני הפרוזדורים, כך האאורטה עם ענפיו ניתן למצוא בין הפרוזדורים. בהתאם אדריכלות לב הפרט, הענפים ניתן להסיר אם הסניף הראשי של אב העורקים הוא עדיין מספיק זמן.
      4. מעבירים את הלב אל צלחת 10 ס"מ פטרי המכילות PBS מקורר (ראה שלב 2.1.2.1). Cannulate בלב ידי משיכת האאורטה עולה על צינורית הזרקת G20x1 ½, אשר נקטע על ידי כלי-רב נדנוד כדי למנוע נזק לרקמות. תקן את אב העורקים עם חוט על הצינורית. לשטוף בעדינות את הלב עם PBS להסיר דם עודף ידי דחיפת הבוכנה במזרק. לנפיחות של הלב צריכה להיות גלויה.
   3. דיסוציאציה לב Langendorff
      1. חברו את הלב cannulated במהירות למתאם מנעול Luer על מנגנון זלוף Langendorff. Perfuse הלב עם 30 מ"ל של חיץ זלוף מחומצן על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עם קצב הזרימה של 1 טיפה / s. thשיעור דואר זרימה יכול להיות מותאם על ידי ויסות זרימת O ₂ בתוך מנגנון Langendorff באמצעות שסתום מפחיתי לחץ (לחץ בין 0 ל 200 mbar).
      2. הכן חיץ העיכול מיד לפני השימוש: חיץ זלוף עם 6 U Collagenase B, 10,000 יחידות טריפסין, ו -50 מיקרומטר CaCl _2. הסר את חוצץ זלוף ולהתחיל את עיכול אנזימטי על ידי הוספת 30 מ"ל של חם (37 מעלות צלזיוס) ו חיץ העיכול מחומצן.
         הערה: כמות Collagenase B צריך להיות טיטרציה בהתאם לפעילות של קבוצות שונות.
      3. התאם את הזרימה לשיעור של 1 טיפה / s ולעכל את הלב במשך 10 - 13 דקות. כדי למנוע זיהום, אין להשתמש בזרימה שוב. מעבירים את הלב אל צלחת 10 ס"מ פטרי עם 5 מ"ל של חיץ העיכול. לנתח את הרקמה באופן ידני עם מלקחיים על ידי החזקת הלב עם זוג אחד של מלקחיים באמצעות הזוג האחר לקרוע את הלב לחתיכות קטנות.
         הערה: בשלב זה, הפרוזדורים ניתן להפריד, וחותכים קטניםחתיכות (עם איריס מספרית), ו מתעכלות במשך 30 דקות ב 750 μL של חיץ עיכול בחממה ב 37 מעלות על מנת להשיג תאי פרוזדורים מבודדים. כדי לקבל cardiomyocytes פרוזדורים טהור, pipet מעלה ומטה מספר פעמים בעזרת פיפטה 1 מ"ל. עצור את תגובת האנזים על ידי הוספת 750 μL של פתרון להפסיק.
      4. עצור את מערכת העיכול על ידי הוספת 5 מ"ל של תמיסת התחנה (חיץ זלוף עם FBS 5% ו -50 מיקרומטר CaCl _2). בעזרת פיפטה סרולוגיות, לסנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 100 מיקרומטר לאסוף את התאים צינור צנטריפוגות 50 מ"ל. צנטריפוגה השעית התא המסוננת ב 80 XG עבור 1 דקות בטמפרטורת חדר.
      5. בטל supernatant בעדינות resuspend התא גלולה ב 10 מ"ל של תמיסת להפסיק בעזרת פיפטה סרולוגיות 10 מ"ל. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 80 XG עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.
      6. בעקבות צנטריפוגה, לבטל את supernatant ו resuspend התאים 1 מ"ל של מדיום תרבות (IMDM עם 20% FCS, 0.1 מ"מ שאינם חיוניים חומצות אמינו, 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​כל אחד פניצילין סטרפטומיצין, ו -0.1 מ"מ β-mercaptoethanol) עבור culturing. לחילופין, המשך לשלב 2.2, "מכתים immunofluorescence," ולתקן את התאים.
      7. עבור קיבעון על 24 גם צלחות, צלחת 10,000 של תאים בודדים לכל טוב על 8 מיקרוגרם / מ"ל מצופה laminin coverslips ב 24 גם צלחות עם 500 μL של המדיום תרבות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ לפחות 3 שעות .
2. מכתים Immunofluorescence על cardiomyocytes מבודד Langendorff בתרחיף
   1. תקן cardiomyocytes Langendorff-מבודדים 1 מ"ל של 4% PFA ב- PBS, pH 7.4, במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה השעית התא ב 800 XG במשך 2 דקות בטמפרטורת חדר, הסר את המקבע, לשטוף את התאים פעמים עם PBS.
   2. Resuspend את cardiomyocytes קבוע ב 1 מ"ל של PBS ו תעברו עם מכתים immunofluorescence או לאחסן אותם 500 μL של PBS לכל טוב עלצלחת 24 גם ב 4 ° C.. העברת חלק השעית התא (~ 100 - 200 μL) אל צינור microcentrifuge. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 800 XG במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר וזורקים supernatant.
   3. Permeabilize, לחסום, להכתים את התאים עם נוגדן ראשוני נגד actinin-α על ידי הוספת 200 μL של נוגדן ראשוני מדולל 1: 400 ב PBS עם 0.2% Triton X-100 ו -5% בסרום חמור עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר.
   4. צנטריפוגה ב 800 XG במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר וזורקים supernatant. שטפו את תא גלולה עם PBS ו צנטריפוגות ב 800 XG במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. לבטל את supernatant מדגירים 200 μL של אלקסה פלואוריד מצומדות נוגדנים משני (אנטי עכבר IgG1) מדולל 1: 400 ב לצבוע Hoechst (הפתרון עובד: 1 מיקרוגרם / מ"ל) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.
   5. צנטריפוגה ב 800 XG במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר וזורקים supernatant. חזור על שלב זה. הגנה על מדגם מן האור. Resuspend התאים ב 200 - 500 μL של PBS ו להעביר 100 - 300 μL של ההשעיה תא אל באר תא מיקרוסקופ. סגור את המכסה של החדר ולאחסן את התאים ב 4 ° C עד הדמיה. להגן מפני אור.
3. ניתוח של nuclearity של cardiomyocytes Langendorff-מבודדים
   1. קח תמונות cardiomyocytes מוכתם α-actinin עם מטרה 25x, המקביל ל בהגדלה 250X. ספירת H2B-MCH + גרעינים רק cardiomyocytes אלה מגואלות באופן קבוע על ידי-actinin α ולהראות מורפולוגיה טיפוסית בצורת מוט ולכן הם הניחו להיות שלמים.
   2. רוזן לפחות 100 cardiomyocytes משלושה לבבות שונים. חישובים של אחוזי mononuclear, binuclear, ו cardiomyocytes trinuclear.
      הערה: בדרך כלל, תאי binuclear צריך לפצות סביב 80 - 90%, ואילו תאי trinuclear ואלה עם מספר גדול יותר של גרעינים נדירים (<1% ב cardiomyocytes Langendorff-מבודד, <3% ב פרוסות עבות). cardiomyocytes פרוזדורים הם קטנים משמעותיים cardiomyocytes חדרית. בדרך כלל, תאי mononuclear לפצות 90% מכלל האוכלוסייה.
4. בידוד, קיבעון, cryopreservation של לבבות למבוגרים כהכנה פרוסות עבות
   1. להרכיב מנגנון זלוף עבור קיבעון על ידי חיבור מזרק 50 מ"ל כדי שסתום 3 כיווני עם צינורית הארכה Heidelberger ואת שסתום 3-הדרך השנייה. תקן את המזרק עמדה בצורה כזאת כי הזרימה דרך מופעלת על ידי כוח הכבידה. מלאו את המערכת עם 15 מ"ל של PBS.
   2. בצע את השלבים 2.1.2.1-2.1.2.4, "הכנת הלב." חבר את צינורית הזרקת G20x1 ½ עם הלב אל מתאם מנעול Luer של מנגנון זלוף מלא בועה נטולת-PBS ו perfuse זה עם PBS. מלאו את המערכת עם 10 - 15 מ"ל של פורמלדהיד 4% ב- ​​PBS, אשר perfused אז דרך הלב. טבילה לתקן את הלב בתמיסת פורמלדהיד 4% בין לילה.
   3. החזר את פורמלדהיד 4%פתרון עם PBS ולשטוף את הלב ב PBS על שייקר אופקי ב 150 סל"ד במשך 8 שעות בטמפרטורת החדר. להחליף את PBS עם 20% תמיסת סוכרוז כדי לייבש את לב הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
   4. להקפיא את הלב במדיום הטבעה-קריו בתוך תבנית קטנה.
      1. הגדרת כוס המלאה 2-methylbutane ומניח אותו בתוך קופסא עם קרח יבש. שים לב לתבנית הקפאה בעבר חצי מלאים בינוני הטבעה קריו ולכסות אותו לחלוטין עם קריו הטבעה בינוני. בזהירות את התבנית לתוך המבחנה הקרה, מניעת קשר של מדיום ההטבעה-קריו עם 2-methylbutane. אחסן את הרקמה הקפואה ב -80 ° C עד השימוש.
5. הכנת פרוסות לב עבות
   1. השתמש ההתקנה הבאה בתוך cryotome: טמפרטורת מושא -18 ל -20 מעלות צלזיוס, טמפרטורת לשכת -21 ל -23 מעלות צלזיוס, זווית סליקה על בעל הסכין של 4 מעלות, ולהבי microtome R35 הנוצה.
   2. קח את o cryopreservedrgan ממכל ההקפאה ולתקן אותה על דיסק הדגימה עם מדיום ההטבעה-קריו באמצעות מדף ההקפאה המהיר. מקם את הלב בצורה כזאת כי חתך מתחיל בשיא.
   3. חתוך משם פרוס 50 מיקרומטר עד מטוס חיתוך אפילו מושגת והאיבר הופך לגלוי. חותכים פרוסות הרקמה 50 מיקרומטר באמצעות cryotome במצב ידני עם מהירות איטית ועם צלחת אנטי רול להציב על הסכין. פרוסות הר בשקופיות מיקרוסקופ שטופלו מלוחים. תנו פרוסות להתייבש במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ולאחסן את השקופיות ב -80 ° C או כתם ישירות.
6. הכתמה של פרוסות לב עבות (גרעינים ואת קרום תא)
   1. פנקו את פרוסות הלב עם RNAse A (20 מיקרוגרם / מ"ל) ב חיץ כביסה (0.5 M NaCl, 0.1 M טריס pH 7.5, ו -50 מ"מ EDTA) ב קובט של 1 ש 'על 37 מעלות צלזיוס. דגירה הפרוסה-X טריטון 0.2% חיץ כביסה למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. פעמים לשטוף את הפרוסות במשך 5 דקות כל אחד כביסת חיץ קובט עלשייקר אופקי בטמפרטורת החדר.
   2. הכתם לילה עם 1 מיקרומטר TO-PRO3 יודיד (642/661) ו agglutinin נבט חיטה מצמידים והעמסת (WGA, 1: 100) במאגר כביסה על 4 מעלות צלזיוס. לשטוף את פרוסות שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם חיץ כביסה ב cuvettes על שייקר אופקי ומכסים אותם עם הרכבה בינונית אלכוהול פוליוויניל עם מגיב נגד דהייה ו coverslip זכוכית.
7. רכישת תמונה
   1. באופן אידיאלי, משתמשים במיקרוסקופ סריקת לייזר confocal הפוכה מצויד מטרה 40X / 1.15 NA מים טבילה. חיפוש לפי עין עבור שטח בתוך הפרוסה שמורכבת cardiomyocytes המרופדת longitudinally; למטרה זו, בערוץ וההעמסה-WGA (488 ננומטר .: אקס) הוא מתאים ביותר.
      הערה: שלב זה הוא הכרחי, כמו הגבולות העליונים ותחתונים של cardiomyocytes צריכים להיות גלויים בתוך Z- המחסנית עבור ניתוחים מאוחר יותר. ככל עומק הדמיה מוגבל ~ 30 ננומטר ואת עובי של הפרוסה הוא 50 מיקרומטר, זה לא ניתן imחתכי גיל של תאים אלה (אורך תא: ~ 120 מיקרומטר).
   2. התאם את ההגדרה בתוכנת ההדמיה. פתח את תוכנת ההדמיה. הגדרות A1plus להרחיב וסמן את התיבות עבור CH2, CH3, ו CH4. הגדר CH2 כדי egfp, CH3 כדי Alx546, ו CH4 כדי Alx647 ידי לחיצה על התפריט הנפתח.
      1. עבור כל ערוץ, לחץ על HV ולהגדיר אותו 80 באמצעות סרגל המחוון. הגדר את הקיזוז ל -0 באמצעות סורגי המחוון. לחץ על כפתור "בית" כדי להגדיר את חריר לעמדת המוצא. הגדר את גודל סריקה 1,024 x 1,024 על ידי לחיצה על התפריט הנפתח ולחץ לייעל כדי לפתוח את החלון "XYZ גודל Setup". סמן את התיבה "Perfect Voxel" תחת "שלב שהוצע (z)".
   3. לחץ על "סריקה בזמן אמת" ולהתאים את עוצמות לייזר על ידי לחיצה על הסורגים המחוון על ערוצים בודדים. סמן את התיבה "סדרת Z" על החלון "ND הרכישה" ולחץ על "שהוגדר על ידי כפתור העליון" התיבה. גדר העליונהכפתור של Z- מחסנית על ידי לחיצה על הכפתורים המתאימים לאחר התאמת המוקד על המיקרוסקופ. הגדר את רוחב z-צעד ל -0.5 מיקרומטר.
      הערה: עומק Z- המחסנית מוגבלת על ידי החדירה האופטית בתוך הרקמה ואת יחס אות לרעש.
   4. יש להקליק על "A1plus הגדרות" ולהגדיר את הקו ממוצע / Integral 2-4 על ידי לחיצה על התפריט הנפתח. מכווננים את עוצמות לייזר; החריר צריך להיות קטן ככל האפשר על מנת תמונת מטוס מוקד.
8. ניתוח של התגרענות
   1. פתח את תוכנת ניתוח התמונה ואת לטעון את Z- מחסנית של עניין.
   2. ידני לקבוע התגרענות בין המדפים-z ידי גלילת השכבות השונות של המחסנית כדי לזהות תאים המצויים לחלוטין בתוך הערימה; זה המקרה כאשר מכתים WGA גלוי בכל הממדים. ספירת הגרעינים (רובם יהיה binuclear) ולסמן את התא נותח על ידי ביאור בתוכנה.
   3. לקבוע את מספר גרעיני CM (H2B-MCH +) גרעינים כוללים (TO-PRO3 +) ב שחזורי 3D עבור הערוצים הבודדים (איור 2 ד). בשנת תוכנת ההדמיה, לחץ על "בינארי" ולבחור "גדר 3D סף" מהתפריט הנפתח. בחר מתוך התפריט הנפתח ערוץ או Alx546 עבור במספר הגרעינים CM או Alx647 עבור במספר הגרעינים הכולל. על ידי לחיצה על החצים המתאימים, להגדיר את התכנית "4x החלק", 1x הנקי, ומלא חורים. סמן את התיבה "גודל" ולהגדיר אותו 5 מיקרומטר באמצעות סרגל המחוון. הגדר את הסף באמצעות סרגל המחוון עד מופיעים אובייקטים נפרדים.
      הערה: לאחר החל את הפיצול, את חלון התוצאות מראה טבלה של אירועים לכמת פיצול בצבע של התמונה. כמו גרעינים כמה קשר זה לזה באופן ישיר, באופן ידני לתקן את תוצאת המדידה האוטומטית עבור כפילויות, אשר עשויים שלא להיות מופרדת כראוי על ידי התוכנה.

תוצאות

על מנת לנתח את ההשפעות של miRNAs siRNAs / על פעילות מחזור התא של cardiomyocytes לאחר הלידה במבחנה, cardiomyocytes של עכברים פעמיים מהונדס Myh6-H2B-MCH / CAG-eGFP-anillin בודדו על יום לאחר הלידה 3 (P3) ו טרנספקציה עם פעילות וישכנע מחזור התא miR199 ^5, p27 siRNA, ו siRNA Fzr1. לעומת שליט...

Discussion

ישנה מחלוקת בשאלה האם cardiomyocytes מסוגלים להזין את מחזור התא ולחלק לאחר פציעה ובמהלך הומאוסטזיס רקמות. הערכים של המחזור הבסיסי של cardiomyocytes ניתנו בטווח שבין 1% ¹ ו -80% ^7. גם לאחר נגע לב, האינדוקציה של פעילות תא מחזור וההדור של cardiomyocytes החדש דווחה באזור...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Sarstedt	821472
100 µm cell strainer	Becton Dickinson GmbH/Falcon	352360
2,3-Butanedione monoxime (BDM)	Sigma-Aldrich	B0753
G20x1 ½ injection cannula, Sterican	Braun, Melsungen	4657519
20 gauge needle	Becton Dickinson GmbH	301300
24-well plates	Becton Dickinson GmbH/Falcon	353047
2-Methyl-butane	Carl Roth GmbH + Co. KG	3927.1
37% formaldehyde solution	AppliChem GmbH	A0936,1000
3-way stopcock	B. Braun Medical Inc.	16494C
50 mL syringe	B. Braun Medical Inc.	8728810F
70% ethanol	Otto Fischar GmbH	27669
Alexa-Fluor-conjugated secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	115-605-205
Alpha-Aktinin EA-53, Mouse IgG	Sigma-Aldrich, Steinheim	A7811
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Cell Culture Microplate, 96 Well, Half Area	Greiner bio-one	675986
Collagenase B	Roche	11088815001
confocal microscope Eclipse Ti-E	Nikon
cryostat CM 3050S	Leica
donkey serum	Jackson Immuno Research, Suffolk, GB	017-000-121
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537
EDTA	Sigma-Aldrich	E4884
fetal calf serum	PromoCell, Heidelberg
Formaldehyde solution (4%)	PanReac AppliChem	A3697
Gelatine from porcine skin, Type A	Sigma-Aldrich, Steinheim	G2500
glass coverslips	VWR	631-0146
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Heidelberger extension tube	IMPROMEDIFORM GmbH	MF 1833
Heparin-Natrium	Ratiopharm	5394.02.00
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
HistoBond microscope slides	Marienfeld	0810000
Hoechst 33342 (1 mg/mL)	Sigma Aldrich, Taufkirchen	B2261
Insulin syringe	Becton Dickinson GmbH	300334
Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium (IMDM)	Gibco/Life Technologies, Darmstadt	21980-032
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
Laminin	Corning	354221
Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti	Nikoninstruments, Düsseldorf
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt	13778075
Mouse IgG Cy5 (donkey)	Jackson ImmunoResearch	715-175-151
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
microcentrifuge tube	Sarstedt	72690
Mini shaker	VWR	12620-940
mirVana miRNA mimic, hsa-miR199a-3p	Ambion/Thermo Fischer Scientific	4464066
Biopsy Mold	Sakura Finetek/ VWR	4565
M-slide 8-well ibiTreat	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaOH	Merck Millipore	567530
negative control(scrambled RNA)	Ambion/Thermo Fischer Scientific	AM4611
Neonatal Heart Dissociation Kit	Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach	130-098-373
NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit	Nikoninstruments, Düsseldorf
Non essential amino acids, NEAA	Gibco/Life Technologies, Darmstad	11140-035
Opti-MEM, Reduced Serum Medium	Gibco	51985-026
P21-siRNA	Ambion/Thermo Fischer Scientific	4390771
P27-siRNA	Ambion/Thermo Fischer Scientific	4390771
Penicillin/Streptomycin	Gibco/Life Technologies, Darmstadt	15140-122
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, Steinheim	14190-094
Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading	Sigma-Aldrich	10981
RNase A	Qiagen	1007885
RNaseZap	Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt	AM9780
sample containers	Vitlab	80731
Serological pipette	Greiner	607180
software NIS Elements	Nikon
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek/ VWR	25608-930
ToPro3 iodide (642/661)	Molecular probes/ThermoFisher Scientific	T3605
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X	Fluka	93418
Triton X-100	Fluka	93418
Trypsin	Sigma-Aldrich	T1426
Wheat germ agglutinin (WGA) Fluorescein labeled	Vector Laboratories	VEC-FL-1021-5
α-actinin antibody	Sigma-Aldrich	A7811
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich, Steinheim	M3148