خلية واحدة من الحمض النووي الريبي-سيك من مجموعات فرعية محددة من خلايا العقدة الشبكية

Summary

هنا، نقدم نهج كومبيناتوريال لتصنيف أنواع الخلايا العصبية قبل العزلة ولتوصيف لاحقة من ترانسكريبتومس أحادية الخلية. هذا البروتوكول يحسن إعداد عينات لنجاح تسلسل الحمض النووي الريبي (رنا-سيق) ويصف منهجية مصممة خصيصا لتعزيز فهم التنوع الخلوي.

Abstract

اكتشاف علامات نوع الخلية محددة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة وظيفة الخلوية وأصول التجانس الخلوي. مع دفعة مؤخرا لتحسين فهم التنوع العصبي، من المهم تحديد الجينات التي تعبر عن تعريف مجموعات سكانية فرعية مختلفة من الخلايا. الشبكية بمثابة نموذج ممتاز لدراسة التنوع في الجهاز العصبي المركزي، لأنها تتكون من عدة أنواع الخلايا الرئيسية. وقد أسفرت دراسة كل فئة رئيسية من الخلايا علامات الوراثية التي تسهل تحديد هذه المجموعات السكانية. ومع ذلك، توجد أنواع فرعية متعددة من الخلايا داخل كل من هذه الطبقات الخلايا الشبكية الرئيسية، وعدد قليل من هذه الأنواع الفرعية لها علامات وراثية معروفة، على الرغم من أن العديد قد تميزت مورفولوجيا أو وظيفة. ومن شأن معرفة العلامات الجينية لأنواع الشبكية الفردية أن تسمح بدراسة ورسم خرائط لأهداف الدماغ المتعلقة بوظائف بصرية محددة، كما يمكن أن تقدم نظرة ثاقبة على شبكات الجينات التيالحفاظ على التنوع الخلوي. الطرق الحالية المستخدمة لتحديد علامات وراثية من الأنواع الفرعية تمتلك عيوب، مثل تصنيف أنواع الخلايا التالية التسلسل. هذا يمثل تحديا لتحليل البيانات ويتطلب أساليب التحقق من صحة صارمة لضمان أن مجموعات تحتوي على خلايا من نفس الوظيفة. نقترح تقنية لتحديد مورفولوجيا ووظائف الخلية قبل العزلة والتسلسل، والتي سوف تسمح لتسهيل تحديد علامات النوع الفرعي. ويمكن أن تمتد هذه التقنية إلى أنواع الخلايا غير العصبية، فضلا عن السكان النادرة من الخلايا مع اختلافات طفيفة. هذا البروتوكول يعطي بيانات ذات نوعية ممتازة، كما قدمت العديد من المكتبات أعماق قراءة أكبر من 20 مليون يقرأ للخلايا واحدة. هذه المنهجية يتغلب على العديد من العقبات التي تقدمها خلية واحدة رنا-سيق وقد تكون مناسبة للباحثين تهدف إلى تعريف أنواع الخلايا بطريقة واضحة وفعالة للغاية.

Introduction

ويلاحظ التنوع العصبي في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي، وخاصة في شبكية العين الفقارية، الأنسجة المتخصصة للغاية تتكون من 1 الدبقية و 6 أنواع الخلايا العصبية التي تنشأ من عدد واحد من خلايا السلف الشبكية ^{1 ، 2 ، 3} . يمكن تصنيف العديد من الأنواع الفرعية من الخلايا وظيفيا، شكليا، وراثيا. الهدف من هذا البروتوكول هو لربط التباين الوراثي لأنواع الخلايا لخصائص وظيفية و / أو المورفولوجية يمكن التعرف عليها. وقد تم تحديد عدد من الجينات لتصنيف الخلايا، ولكن العديد من الأنواع الفرعية لا تزال تذهب غير معهود، لأنها تمثل جزءا صغيرا من مجموع السكان. وتحديد الجينات داخل هذه الأنواع الفرعية محددة تسمح لفهم أكبر للتنوع الخلايا العصبية داخل شبكية العين، ويمكن أيضا تسليط الضوء على تنويع الخلايا العصبية في مكان آخر. فورثرمور، دراسات خلية واحدة تسمح للكشف عن أنواع الخلايا الجديدة، والتي قد تم تجاهلها بسبب انخفاض تمثيلها بين مجموع السكان ^{4 ، 5 ، 6 ، 7} .

واحدة من فوائد ترانسكريبتوميكس خلية واحدة هي أن علامات فريدة من نوعها أو مجموعات من علامات التي تحدد نوع فرعي الخلوية معينة يمكن اكتشافها. ويمكن بعد ذلك استخدامها للحصول على الوصول الجيني إلى هذا النوع من الخلايا لالتلاعب مختلفة. على سبيل المثال، نحن نستخدم هذا البروتوكول لتوصيف الجينات نوع معين من الخلايا من مجموعة فرعية من خلايا العقدة الشبكية التي تعبر عن ميلانوبسين فوتوبيغمينت. استخدام علامة الفلورسنت في ميلانوبسين معربا عن خلايا الشبكية العقدة تمكن دراسة هذه الخلايا، كما يتم تجميعها معا بسبب التعبير عن الجين المعروف. ومن المثير للاهتمام، هناك خمسة أنواع فرعية معروفة من هذه الخلية بوبولاتيون في شبكية العين الماوس ⁸ . وهكذا، من أجل عزل الحمض النووي الريبي من الخلايا من كل نوع، استخدمنا تصنيفات المورفولوجية المنشأة ضمن نموذج المعدلة وراثيا لتحديد كل نوع فرعي قبل عزل الخلية. هذه التقنية تسمح لتوصيف الخلايا وكذلك لعزلتها مباشرة من شبكية العين، من دون الحاجة إلى تفكك الأنسجة، والتي قد تسبب استجابة الإجهاد داخل الخلايا والتلوث بسبب قطع التشعبات ⁹ .

وقد ظهرت العديد من التقنيات الجديدة في السنوات القليلة الماضية مع استمرار تطور طريقة رنا-سيق. هذه الأدوات تسمح للحصول على أقصى قدر من اكتساب الخلايا وكفاءة أكبر من حيث التكلفة في حين تقترب من السؤال في متناول اليد ^{4 ، 7 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13} . ومع ذلك، في حينوكانت هذه التقنيات ممتازة يخطو الحجارة، وهناك عدد من العقبات لا تزال تواجه أن هذا البروتوكول هو قادرة على معالجة. أولا، العديد من الإجراءات الحالية عزل الخلايا من الأنسجة فصل ومحاولة استخدام إما تحليل المكون الرئيسي أو التكتل الهرمي بعد مخصصة لتحديد تصنيف الخلية. الاعتماد على هذه الأدوات لتصنيف الأنواع الفرعية قد لا تنتج نتائج موثوقة وقد تجبر واحد على إيجاد طرق جديدة للتحقق من صحة هذه البيانات لربط علامة وراثية لنوع خلية وظيفية. شرط التفكك في بروتوكولات أخرى يمكن أن يؤدي في بعض الأحيان إلى تلف الأنسجة ويمكن أن يسبب قطع الخلايا العصبية إلى قطع، مما أدى إلى خسارة محتملة من مرنا. وعلاوة على ذلك، في الاستعدادات خلية فصلها، قد تبدأ ردود الإجهاد تؤثر على ترانسكريبتوميس من هذه الخلايا ¹⁴ . هذا البروتوكول يتغلب على هذه التحديات من خلال تحديد نوع خلية وظيفية قبل العزلة، ويحافظ على أفضل حثروة الخلايا عن طريق الحفاظ على أنسجة الشبكية سليمة.

تم إدخال تقنية واحدة في عام 2014، وتتألف من تحليل في الجسم الحي من ترانسكريبتوم من الخلايا الحية ¹⁵ . في حين أن هذه التقنية تسمح لفحص ترانسكريبتوم مع الحد الأدنى من تعطيل الميكانيكية للأنسجة، فإنه يفتقر إلى القدرة على تصنيف أنواع محددة من الخلايا داخل الأنسجة قبل فحص ترانسكريبتوميس دون استخدام الماوس مراسل محدد جدا. بروتوكولنا لا يتطلب مراسل معين، ونحن الاستفادة من ملء الخلايا والفيزيولوجيا الكهربية لتوصيف الخلايا قبل عزلتها. قيود أخرى من هذا البروتوكول السابق هو أنه يتطلب الطول الموجي محددة لإثارة عنصر فوتواكتيفابل، في حين يسمح بروتوكول لدينا لاستخدام مراسل الفلورسنت وصبغ الفلورسنت، والتي هي متاحة بسهولة أو يمكن اختيارها من قبل كل مختبر على حدة. ومع ذلك، تزوجت مختبرات أخرى طريقتين من الكهرباءالفسيولوجيا و ترانسكريبتوميكس لدراسة التنوع الخلوي. وقد تم استخدام التسجيلات التصحيح المشبك لوصف وظيفة خلية قبل عزلتها على الخلايا العصبية فصل ¹⁶ ، وفي بعض الحالات، وقد سبقت استخدام تحليل ميكروأري ¹⁷ لهذه الدراسات. نفس المضاعفات التي واجهتها تلك النهج، لأنها تتطلب تفكك الأنسجة أو استخدام التكنولوجيا ميكروأري، والتي تعتمد على التهجين من العينات إلى تحقيقات المتاحة. وكان واحدا من أحدث التطورات تطوير البقعة-سيق، وهي تقنية تجمع بين استخدام التسجيلات المشبك التصحيح والتكنولوجيا رنا-سيق لفهم الخلايا من شرائح الدماغ كله ¹⁸ . في حين أن هذه التقنية له أوجه التشابه مع بروتوكول المعروضة هنا، فمن المهم مرة أخرى أن نلاحظ أن نهجنا يسمح للأنسجة لتبقى سليمة لصحة الخلايا. هنا، نقدم بروتوكول ل أوبتيميزاتأيون من هذا التحالف، الذي يولد مكتبات ذات خلية واحدة عالية الجودة لاستخدام رنا-سيق للحصول على عمق قراءة عالية ورسم الخرائط التغطية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (إاكوك) في جامعة نورث وسترن.

1. إعداد حلول للكهربية (4 ساعات)

1. جعل 0.1٪ ديبك المعالجة H ₂ O عن طريق إضافة 1 مل من البيروكربونات ديثيل (ديبك) إلى 999 مل من التناضح العكسي لتنقية H ₂ O. مزيج دقيق والسماح للخلط احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (رت). ثم، الأوتوكلاف و ديبك مختلطة H ₂ O لمدة 15 دقيقة على دورة السائل. السماح ديبك المعالجة H ₂ O بارد في رت.
2. جعل الحل خارج الخلية عن طريق خلط زجاجة واحدة من أميز المتوسطة و 1.9 غرام (23 ملم) من بيكربونات الصوديوم إلى 1 لتر من H ₂ O. فقاعة حل خارج الخلية مع
   95٪ O ₂ /5٪ كو ₂ والحفاظ عليه عند درجة الحموضة من 7.3-7.4.
3. توليد الحل داخل الخلايا من خلال الجمع بين 125 ملي K-غلوكونات، 2 ملي مغكل ₂ ، 10 ملي إغتا، 10 ملي هيبيس، و 0.1٪ ديبك المعالجة H₂ O. تخزينه في 1 مل أليكوتس في -20 درجة مئوية. إضافة 10 ميكرومتر من التتبع الفلورسنت في بداية كل تجربة.
4. جعل محلول انزيم بإضافة 10،000 وحدة من كولاجيناز و 83 ملغ من هيالورونيداز إلى 4.15 مل من محلول خارج الخلية. يجب أن يتم تخزين محلول إنزيم في 50 قسامة ميكرولتر في -20 درجة مئوية.

2. إعداد الأنسجة الشبكية (2 ساعة)

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الإجراءات في هذا القسم تحت إضاءة حمراء خافتة

1. الحيوانات الداكنة التكيف لمدة 1 ساعة على الأقل قبل تشريح. تنفيذ جميع الإجراءات تحت الإضاءة الحمراء الخافتة.
2. الموت ببطء الحيوانات عن طريق الاختناق كو ₂ واستئصال مقل العيون إلى طبق بتري مع حل خارج الخلية الأوكسجين سابقا.
3. كزة القرنية مع إبرة وقطعه بعيدا عن طريق قطع مع مقص العيون على حدود القرنية والصلبة ¹⁹ .
4. إزالة العدسة باستخدام# 5 ملقط. جعل بلطف المسيل للدموع في الصلبة مع ملقط وقطع العصب البصري حيث يجتمع الشبكية والصلبة. الانتهاء بعناية إزالة الصلبة من شبكية العين.
5. إزالة الزجاجي شفافة باستخدام ملقط # 5. مرة واحدة إزالة، يظهر الجسم الزجاجي كمادة هلامية عالقة على ملقط. شريحة شبكية العين في نصف (حتى أن هناك 4 قطع / الحيوان) وتخزينها في محلول خارج الأكسجين خارج الخلية في رت حتى الاستخدام.
6. عندما تكون جاهزة لتركيب الأنسجة في غرفة التسجيل، ووضع قطعة من الشبكية لاحتضان في محلول انزيم المخفف في 500 ميكرولتر من محلول خارج الأكسجين خارج الخلية. احتضان في طبق بتري لمدة 2 دقيقة في رت على شاكر.
   1. غسل قطعة من الشبكية في محلول الأكسجين خارج الخلية ووضع الأنسجة في غرفة القاع الزجاج القاع. استخدام ماصة نقل البلاستيك مع طرف قطع للسماح للشبكية ليتم نقلها دون التسبب في الأضرار التي لحقت الأنسجة.
7. يسخدم من اجلسيبس لتسطيح بعناية الأنسجة مع طبقة مبصرة تواجه أسفل. إزالة السوائل الزائدة باستخدام ماصة. مرساة الأنسجة باستخدام حلقة البلاتين مع شبكة النايلون.
   ملاحظة: يمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لإعداد الأنسجة لعزل الحمض النووي الريبي من وصفت أماكرين والخلايا ثنائية القطب.
8. ملء الغرفة مع محلول خارج الأكسجين خارج الخلية وتثبيته على مرحلة المجهر. يروي الأنسجة مع محلول خارج الأكسجين خارج الخلية في 2-4 مل / دقيقة.

3. التصور واستهداف غفب + خلايا العقدة الشبكية (10 دقيقة)

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الإجراءات في هذا القسم تحت إضاءة حمراء خافتة

1. قبل البدء، سحب ميكروبيبيتس الزجاج (أود: 1.2 ملم، إد: 0.69 مم) للتسجيلات الكهربية باستخدام مجتذب ميكروبيبيت. استخدام بروتوكول التالية للأقطاب (يرجى ملاحظة أن المعلمات ينبغي تعديلها وفقا لذلك لتحقيق المقاومة المطلوبة وسوفتختلف عبر مجتذب ومع الزجاج مختلفة): الحرارة: المنحدر +10؛ سحب: 0؛ فيل: 23؛ التأخير: 1؛ الضغط: 500؛ حلقة البرنامج: 5 مرات. تأكد من أن النصائح هي ~ 1 ميكرون في القطر، مع مقاومة 2-4 MΩ لاستهداف الخلايا الكبيرة و5-7 MΩ لاستهداف الخلايا الصغيرة.
2. مراقبة طبقة الخلايا العقدة باستخدام الأشعة تحت الحمراء التباين التداخل التباين (إر-ديك) البصريات ( الشكل 1A ). تحديد غفب + خلايا العقدة الشبكية (رغس) باستخدام إبيفلورزنس (~ 480 نانومتر) ( الشكل 1B ).
3. تحديد موقع ماصة مليئة حل داخل الخلايا في مدينة دبي للإنترنت. تطبيق ضغط إيجابي طفيف و صفر أي إزاحة الجهد على مكبر للصوت.
4. اضغط على ميكروبيبيت الزجاج ضد خلية + غفب وتطبيق الضغط السلبي لتشكيل ختم G between بين ماصة وغشاء الخلية. تطبيق خطوات قيادة اختبار الجهد (على سبيل المثال، 5 مف) لمراقبة مقاومة الختم. بعد تشكيل ختم مستقر، تمزق الغشاء عن طريق تطبيق نبضات موجزة من نالضغط الإيجابي للحصول على الوصول إلى خلية كاملة.
5. انتظر 1-2 دقيقة لتشعبات الخلية لملء مع التتبع الفلورسنت.
   ملاحظة: يمكن كتابة الخلية شكليا من خلال دراسة التشكل في إبيفلورزنس ( الشكل 1C ). في حالة رغس التعبير عن الميلانوبسين، يتم تصور الطبقية التغصنية في الطبقة الضفيرية الداخلية عن طريق فحص التشعبات مليئة التتبع الفلورسنت تحت إضاءة إبيفلورزنت وتحديد ما إذا كانت تصنف بعيدا عن سوما في أوف سوبلامينا (M1 إبرغس)، بالقرب من العقدة (M2 و M4 إبرغس)، أو كليهما (M3 إبرغس). هذه الملاحظة، جنبا إلى جنب مع حجم سوما (M4S لها سوماس كبيرة بشكل ملحوظ مقارنة مع جميع الأنواع الفرعية إبرغس أخرى)، والسماح لتحديد نوع الخلية ^{20 ، 21 ، 22} . وهكذا، فإن هذه التقنية تسمح لتحديد نوع الخلية في المختبر قبل إسو رناlation. ويمكن تعديل هذه الطريقة لبروتوكولات تعريف نوع الخلية الأخرى التي تنطوي على التشكل الجذعي أو علم وظائف الأعضاء الخلوية.

4. عزل الخلية (2 دقيقة)

1. قبل البدء، تعيين ميكروسنتريفوج الطاولة إلى 2000 × ز. إعداد جهاز طرد العينة عن طريق ربط الأنابيب (أود: 3/32 في، إد: 1/32 في) مع حقنة 1 سم مكعب.
2. وضع 0.2 مل أنابيب ير تحتوي على 10 ميكرولتر من العازلة تحلل و 1٪ β ميركابتويثانول على الجليد. إعداد حقنة 1 سم مكعب تحتوي على ديبك المعالجة H ₂ O لشطف نصائح ماصة. إعداد وعاء من الثلج الجاف لتجميد العازلة تحلل بعد جمع العينة.
3. استخراج بعناية المحتوى السيتوبلازمي من ماصة الخلية عن طريق تطبيق الضغط السلبي باستخدام حقنة 10 مل. يجب استخراج جميع المحتوى السيتوبلازمي، بما في ذلك العضيات، إذا أمكن.
   1. رصد الاستخراج في مدينة دبي للإنترنت من خلال تصور الجسم الخلية المتناقصة في الحجم. بعد استخراج ومحتويات السيتوبلازمية، ورفع ماصة بعناية قبالة من الأنسجة وسرعة إزالة ماصة من الحل.
4. إزالة بسرعة ماصة من رئيس مرحلة حامل وشطف طرف ماصة لفترة وجيزة مع ديبك المعالجة H ₂ O باستخدام حقنة 1 مل. ربط ماصة إلى حقنة 1 مل عبر أنبوب ضيق المناسب لطرد العينة.
5. على الفور طرد الخلايا إلى 10 ميكرولتر من العازلة تحلل 1 تحتوي على 1٪ β ميركابتويثانول في 0.2 مل أنابيب ير.
   ملاحظة: يجب طرد نضح كامل مع الخلايا بلطف حتى لا يعرض فقاعات.
   1. طرد مركزي لفترة وجيزة الأنبوب في الطرد المركزي مصغرة الطاولة في 2000 x ج لمدة 10 ثانية. على الفور فلاش تجميد العينات لمدة 5 دقائق على الجليد الجاف. بعد التجميد، تخزينها في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين للحصول على أفضل النتائج. قد تستمر العينات لفترة أطول، ولكن من المستحسن معالجتها بأسرع وقت ممكن.

e "> 5. تنقية الحمض النووي الريبي (30 دقيقة)

1. قبل البدء، إعداد جهاز فاصل مغناطيسي عن طريق تسجيل الجزء العلوي من مقلوب P20 أو P200 حامل طرف إلى موقف المغناطيسي 96-جيدا ²³ .
2. إعداد الطازجة 70٪ من الإيثانول (إتوه) - ما يقرب من 1 مل لكل عينة سوف تكفي. إزالة الحبات المغناطيسية رنا من 4 درجة مئوية تخزين ذوبان الجليد لهم في رت لمدة 30 دقيقة على الأقل.
   ملاحظة: لا ينبغي معالجة أكثر من 8 عينات في وقت واحد، والعديد من الخطوات في هذا البروتوكول تعتمد على الكفاءة والتعامل السريع.
3. وبمجرد أن الخرز المغناطيسي هي في رت، دوامة لمدة 30 ثانية لضمان أن الحل هو مختلطة بشكل جيد.
   ملاحظة: تستخدم الخرز المخزن المؤقت رنا محددة لربط الحمض النووي الريبي انتقائي، وأنها تسمح لإزالة النفايات الخلوية الأخرى عند استخدامها مع موقف لوحة المغناطيسي.
4. خلايا ذوبان الجليد في رت لمدة 1 دقيقة، ومن ثم إضافة 5 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية H ₂ O لكل عينة. ماصة صعودا وهبوطا. إضافة 22 ميكرولتر من الخرز رنا لكل أنبوب و بيبيته جيدا لخلط. احتضان العينات في رت لمدة 5 دقائق للسماح للحمض النووي الريبي للتفاعل وربط مع الخرز المغناطيسي.
5. وضع أنابيب على جهاز فاصل المغناطيسي والسماح الجلوس لمدة 8 دقائق. قبل المتابعة، وضمان أن طاف واضح. مراقبة الخرز من بيليه واحدة وتأكد من عدم فصله خلال بيبتينغ.
6. إزالة طاف من العينات وإضافة 150 ميكرولتر من إتوه 70٪. إزالة إتوه وكرر غسل مرتين أكثر من ذلك.
7. السماح للعينات لتجفيف الهواء لمدة 6 دقائق. تحقق بشكل متقطع لمعرفة ما إذا كان المزيد من إتوه جمعت في الجزء السفلي من الأنبوب. أزلها وفقا لذلك.
8. في حين أن العينات تجفيف، وإعداد 10X العازلة رد فعل من خلال الجمع بين 19 ميكرولتر من العازلة تحلل 2 و 1 ميكرولتر من المانع ريبونوكلياز (40 U / ميكرولتر). تدور لفترة وجيزة أسفل والحفاظ على الجليد.
9. مرة واحدة عينات جافة وحبيبات الكريات لم تعد تظهر لامعة، وإزالة أنابيب من فاصل المغناطيسي وإضافة 9.5 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية H ₂ Oلترطيب العينات. وضع العينات على الجليد وإضافة 1 ميكرولتر من العازلة رد فعل 10X لكل عينة.

6. النسخ العكسي (10 دقيقة)

ملاحظة: قبل البدء، ذوبان الجليد الكواشف اللازمة للنسخ العكسي (رت؛ باستثناء الانزيم) على الجليد. وتشمل هذه: التمهيدي الثاني، العازلة 1، قليل النوكليوتيد، ومثبط ريبونوكلياز.

1. لكل أنبوب، إضافة 2 ميكرولتر من التمهيدي الثاني (آغكاغتغاتسكاغاغتاكت ₍₃₀₎ N _-1 N، والتي N _-1 يمكن أن يكون A، C، أو G و N يمكن أن يكون A، C، G، أو T؛ 12 ميكرومتر). وضع أنابيب في ثيرمويكلر التي تم تسخينها في 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
2. أثناء الحضانة، وإعداد مزيج الرئيسي رت. لكل رد فعل، إضافة 4 ميكرولتر من العازلة 1 (250 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.3، 375 ملي بوكل، و 30 ملي مغكل ₂ )، 1 ميكرولتر من قليل النوكليوتيد (48 ميكرومتر)، و 0.5 ميكرولتر من المانع ريبونوكلياز (40 U / ميكرولتر).
3. مباشرة بعد الحضانة، ضع الأنابيب علىالجليد لمدة 2 دقيقة.
4. إضافة 2 ميكرولتر لكل رد فعل من ترانسكريبتاس العكسي (100 U / ميكرولتر) إلى مزيج الرئيسي وماصة بدقة. إضافة 7.5 ميكرولتر من مزيج الرئيسي إلى كل أنبوب وتخلط بيبتينغ بلطف. تدور لفترة وجيزة الأنابيب لجمع محتويات في الجزء السفلي ووضعها في ثيرمويكلر مسخن مع البرنامج التالي: 42 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة، 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، وعقد في 4 درجات مئوية.
5. تخزين الأنابيب في -20 ° كو / N قبل الشروع، على الرغم من أنه من المستحسن أن يتم نقل العينات من خلال خطوة التضخيم قبل أن يتم تخزينها لفترات طويلة من الزمن. وتقترح مصادر أخرى تخزين O / N عند 4 درجات مئوية سيكون مقبولا أيضا في هذه الخطوة ²⁴ .

7. تضخيم [كدنا] (2.5 ساعة)

ملاحظة: قبل البدء، ذوبان الجليد ير العازلة و ير التمهيدي على الجليد وتدور أنابيب أسفل في الطرد المركزي مصغرة الطاولة قبل اتخاذ مزيج الرئيسي ير.

1. لكل رد فعل، صريبار مزيج الرئيسي ير تحتوي على 25 ميكرولتر من العازلة ير، 1 ميكرولتر من ير التمهيدي (12 ميكرومتر)، 1 ميكرولتر من البلمرة الحمض النووي، و 3 ميكرولتر من نوكليس خالية H ₂ O. إضافة بوليميراز الحمض النووي الماضي، فقط قبل إضافة من مزيج الرئيسي إلى العينات.
2. إضافة 30 ميكرولتر من مزيج الرئيسي إلى كل أنبوب وتدور في 2000 x ج لمدة 10 ثانية لجمع محتويات في الجزء السفلي من الأنابيب.
3. وضع أنابيب في ثيرمويكلر مسخن مع البرنامج التالي: 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. 34 دورات من 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، 65 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 68 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. وعقد في 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: تم زيادة عدد دورات لهذا ير إلى 34، تختلف عن تعليمات الشركة المصنعة المقترحة. بعد تكرار الاختبار، تم العثور على هذا الرقم دورة لإنتاج نتائج موثوقة باستمرار.
4. تخزين الأنابيب في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة قبل الشروع.

8. تنقية كدن تضخيمA (30 دقيقة)

1. قبل البدء في تنقية، وجلب حبات الحمض النووي و شطف عازلة ل رت لمدة 30 دقيقة على الأقل. إعداد الطازجة إتوه 80٪. 1 مل لكل عينة يجب أن يكون كافيا. إضافة 1 ميكرولتر من 10X تحلل العازلة لكل عينة.
2. دوامة حبات الحمض النووي لمدة 30 ثانية وإضافة 50 ميكرولتر من الخرز الحمض النووي لكل عينة. مزيج جيدا عن طريق بيبتينغ، ومن ثم تدور لفترة وجيزة لهم في 2000 x ج لمدة 10 ثانية. احتضان الأنابيب في رت لمدة 8 دقائق.
3. وضع أنابيب على جهاز الفصل المغناطيسي لمدة 5 دقائق. ماصة بلطف طاف صعودا وهبوطا مرتين والسماح للعينات للجلوس لمدة 2 دقيقة. في حين أن العينات هي على الجهاز المغناطيسي، وإزالة طاف وتجاهل.
4. إضافة 150 ميكرولتر من إتوه 80٪ الطازجة إلى كل عينة والسماح لهم للجلوس في رت لمدة 30 ثانية. إزالة إتوه وتكرار غسل إتوه مرة واحدة.
5. تدور لفترة وجيزة العينات ووضعها مرة أخرى على فاصل المغناطيسي لمدة 1 دقيقة. إزالة أي إتوه المتبقية والسماح للعينات للهواء الجاف لمدة 5 دقائق.
6. التحقق من عينات بشكل متقطع لمعرفة ما إذا كان أي إتوه قد جمعت وإزالته مع ماصة.
7. مرة واحدة حبة بيليه لم يعد يظهر لامعة، ولكن قبل الشقوق تبدأ في الظهور، وإزالة أنبوب من فاصل المغناطيسي وإضافة 17 ميكرولتر من العازلة شطف. ماصة بلطف صعودا وهبوطا إلى ريسوسبيند الخرز تماما.
8. احتضان العينات معلق في رت لمدة 2 دقيقة.
9. تدور لفترة وجيزة العينات لجمع كل السائل في الجزء السفلي ووضعها على فاصل المغناطيسي لمدة 2 دقيقة. نقل 15 ميكرولتر من طاف واضح إلى أنبوب خالية من ريبونوكلياز مل 1.5 وتخزينه في -20 درجة مئوية.
10. دراسة نوعية وحجم مكتبة [كدنا] مع حساسية عالية بيواناليزر رقاقة باستخدام 1 ميكرولتر من [كدنا]. الحجم المثالي لمكتبة [كدنا] 0.3-2 كب، مع تركيز لا يقل عن 10 نانوغرام / ميكرولتر ( الشكل 2 ).
    ملاحظة: يمكنك اختيار استخدام ير كوسيلة لفحص العينات لضمان التعبير عن علامات معروفة قبل الشروع في عينة بيأرeparation.

9. تحديد تركيزات و تاجمنت [كدنا (20 دقيقة)

1. قبل البدء، وجلب كاشف الفحص، المخزن المؤقت التخفيف، والمعايير ل رت لمدة 30 دقيقة. إعداد مزيج الرئيسي التي تحتوي على 1 ميكرولتر من كاشف الفحص و 199 ميكرولتر من المخزن المؤقت التخفيف في رد الفعل. قسامة 199 ميكرولتر من هذا الخليط في 500 أنابيب فحص ميكرولتر. إضافة 1 ميكرولتر من العينة وتخلط جيدا.
2. قسامة 190 ميكرولتر من مزيج الرئيسي إلى أنبوب 1 و 2. إضافة 10 ميكرولتر من معيار 1 إلى أنبوب 1 و 10 ميكرولتر من معيار 2 إلى أنبوب 2. دوامة جميع أنابيب العينة والأنابيب القياسية لمدة 5 ثوان. احتضان في رت لمدة 3 دقائق.
3. تحديد تركيز العينات مع فلوريوميتر حساسية عالية. تأكد من كمية العينة الصحيحة تم إدخال عن طريق تحديد الخيار "حساب حل المخزون" وتسليط الضوء على "1 ميكرولتر". تمييع كل عينة في أنبوب 1.5 مل منفصلة إلى تركيز النهائي من 0.2 نانوغرام / ميكرولتر في خالية من ريبونوكلياز H ₂ O.
   ملحوظة:في حين أن تعليمات الشركة المصنعة تشير إلى أنه ينبغي للمرء أن يبدأ مع 1 نانوغرام / ميكرولتر من الحمض النووي، وقد استخدمنا مبلغ البدء أصغر وقمت أيضا بتعديل بروتوكول لحساب هذا التعديل.
4. في أنابيب 0.2 مل ير جديدة، ماصة 2.5 ميكرولتر من العازلة 2. إضافة 1.25 ميكرولتر من [كدنا] إلى الأنبوب المناسب لما مجموعه 250 صفحة في الدقيقة. وأخيرا، إضافة 1.25 ميكرولتر من تسمنتاتيون مزيج لكل أنبوب وماصة بدقة لخلط. فإن ترانسبوسيز داخل مزيج تسمنتاتيون شظية الحمض النووي إلى خيوط قصيرة وتخفيف محولات إلى أي طرف من كل حبلا، لاستخدامها لاحقا من قبل أداة التسلسل.
   ملاحظة: وحدات التخزين المستخدمة للتوسيم واقتران الفهرس هي جزء من الكمية المقترحة من قبل تعليمات الشركة الصانعة. وهذا لا يسمح فقط للحفاظ على الكواشف، ولكن أيضا أنتجت باستمرار عينات تاغماتد في تجربتنا.
5. الطرد المركزي أنابيب على ميكروسنتريفوج كونترتوب لمدة 1 دقيقة.
6. ضع الأنابيبفي ثيرمويكلر مسخن مع البرنامج التالي: 55 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة وعقد في 10 درجة مئوية.
   ملاحظة: طول هذه الحضانة هو 10 دقيقة، في مقابل 5 دقائق المقترحة من تعليمات الشركة الصانعة.
7. مباشرة بعد اكتمال هذا البرنامج، وإزالة أنابيب وإضافة 1.25 ميكرولتر من تاجمنتاتيون تحييد العازلة لكل منهما. ماصة جيدا لخلط واحتضان في رت لمدة 5 دقائق. إكمال هذه الخطوة على الفور، كما يبقى ترانزبوسيس نشطة حتى العازلة تحييد الانزيم ويوقف رد فعل.

10. اقتران الفهرس وتنقية (1 ساعة)

ملاحظة: قبل البدء، وجلب الخرز الحمض النووي و ريسوسبنسيون العازلة ل رت لمدة 30 دقيقة على الأقل. تحديد أي مؤشرات لاستخدامها لكل من العينات.

ملاحظة: سيتم إرفاق هذه المؤشرات إلى 5 'و 3' ينتهي من الحمض النووي مجزأة لتحديد العينات بعد التسلسل. تأكد من عدم وجود اثنينالاقتران هي نفسها للعينات التي قد تكون متسلسلة معا. على سبيل المثال، إذا كانت العينة 1 ستستخدم الفهرسين الأبيض 1 والبرتقالي 1، فيجب أن تستخدم العينة الثانية الأبيض 1 والبرتقالي 2 أو الأبيض 2 والبرتقالي 2، ولكن لا توجد نفس المجموعة من الأرقام القياسية. تحتوي هذه المجموعة على 4 أرقام بيضاء مميزة و 6 مؤشرات برتقالية متميزة. جميع التركيبات الممكنة المختلفة تسمح بحد أقصى 24 عينة لتجميعها في مسار واحد التسلسل. على الرغم من أننا عادة تجمع فقط 10 عينات في حارة، يمكن للمرء أيضا استخدام مجموعة تحتوي على 24 فهرس، والتي من شأنها أن تسمح لتجميع 96 عينة في حارة واحدة من التسلسل، إذا رغبت في ذلك.

1. لكل أنبوب، إضافة 1.25 ميكرولتر من المؤشر الأيسر و 1.25 ميكرولتر من المؤشر الصحيح لتلك العينة محددة. إضافة 3.75 ميكرولتر من ير مزيج الرئيسي وماصة جيدا لخلط.
2. أجهزة الطرد المركزي في ميكروسنتريفوج كونترتوب لمدة 1 دقيقة.
3. وضع أنابيب في ثيرمويكلر مسخن مع البرنامج التالي: 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ 12 دورة من 9576؛ C لمدة 10 ثانية، 50 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. وعقد في 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: تم تغيير أول خطوة 95 درجة مئوية من 98 درجة مئوية، والتي اقترحتها تعليمات الشركة الصانعة. أيضا، تم تعديل تفاصيل دورة بحيث درجات الحرارة والوقت أطوال يسمح للوسم الأمثل لعينات لدينا. أضيفت أيضا حضانة 72 درجة مئوية النهائية إلى بروتوكول لدينا ولم تكن مدرجة في تعليمات الشركة الصانعة.
4. تدور لفترة وجيزة الأنابيب لجمع محتويات في الجزء السفلي. دوامة حبات الحمض النووي لمدة 30 ثانية، ومن ثم إضافة 30 ميكرولتر إلى كل أنبوب وتخلط جيدا عن طريق بيبتينغ.
5. احتضان العينات في رت لمدة 5 دقائق.
6. وضع العينات على فاصل مغناطيسي لمدة 2 دقيقة. ماصة طاف صعودا وهبوطا مرتين واحتضان عينات لمدة 1 دقيقة.
7. إزالة وتجاهل طاف واضح. إضافة 150 ميكرولتر من إتوه 80٪ إلى كل عينة وإزالة. كرر إتوه يغسل مرة واحدة.
8. اسمحه عينات للهواء الجاف لمدة 10 دقيقة. تحقق بشكل متقطع لمعرفة ما إذا كان أي إتوه قد جمعت في الجزء السفلي من الأنابيب وإزالة حسب الضرورة.
9. مرة واحدة الكراك يبدأ في الظهور في بيليه حبة بيليه، وإزالة العينة من فاصل المغناطيسي وإضافة 27.5 ميكرولتر من العازلة إعادة تعليق لإعادة ترطيب بيليه. تأكد من أن بيليه معلق تماما، ومن ثم احتضان في رت لمدة 2 دقيقة.
   ملاحظة: تم تعديل وحدة التخزين المستخدمة في المخزن المؤقت ريسوسبنسيون لحساب كمية أصغر من المواد انطلاق في بروتوكول لدينا ويختلف عن الحجم المقترح في تعليمات الشركة الصانعة.
10. وضع أنابيب على فاصل المغناطيسي لمدة 2 دقيقة. نقل 25 ميكرولتر من طاف واضح في أنبوب خالية من ريبونوكلياز ومخزن في -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: لا تتابع تعليمات الشركة المصنعة لاستكمال تطبيع المكتبة. تم إعداد العينات بنجاح بعد هذه الخطوة ويتم إعدادها للتسلسل كما هو.
11. تحليل tتسمين العينات باستخدام رقاقة بيواناليزر و 1 ميكرولتر من كل عينة.
    ملاحظة: وسيتم إجراء تحليل المسحات كما في وقت سابق. ومع ذلك، ينبغي الآن أن يتم الكشف عن [كدنا] في حجم مجموعة من 0.2-1 كب ( الشكل 3 ). ومن المحتمل أن تمثل المسحات تحت هذه النقطة تحلل العينات، في حين تشير المسحات الأكبر إلى وجود علامات غير كاملة.

11. تجميع العينات (10 دقيقة)

1. الحصول على تركيزات من عينات تسمنتاتيون مع فلوريتر حساسية عالية من وقت سابق وتحديد تركيز في نم.
   ملاحظة: يمكن حساب هذا الحساب باستخدام أداة تحويل الإنترنت ويعتمد على متوسط ​​طول الشظية من أثر بيواناليزر. لتحديد متوسط ​​طول الشظية، ومراقبة أثر لكل عينة على حدة وتحديد حجم شظية الحمض النووي المتوسط. ويمكن أيضا أن يتم حساب هذا عند فحص أثر بيواناليزر من خلال تسليط الضوء على مجموعة من تشويه وفحص ثe مولاريتي تحسب من قبل البرنامج.
2. الجمع بين العينات بحيث تجمع يحتوي على نفس تركيز كل عينة. لا تمييع العينات؛ ينبغي أن يكون التجمع فقط كما تمييع كما العينة الأقل تركيزا، ومن الناحية المثالية لديها تركيز الكلي لا يقل عن 15 نانومتر.
3. تخزين العينات المجمعة في -20 درجة مئوية قبل التسلسل؛ يقترح أن العينات تخضع للتسلسل خلال أسبوع واحد من التجميع. أداء المقترنة نهاية، 100 بب التسلسل مع منصة هيسق.

النتائج

يتم تصنيف أنواع الخلايا بسهولة بعد حقن الصبغة

ويبين الشكل 1 مثالا على غفب + رغك قبل وبعد الفلورسنت التتبع ملء. تم تحديد هذه الخلية على أساس التعبير عن غفب في خط المعدلة وراثيا ( الشكل ...

Discussion

بروتوكولنا يوضح، من خلال دليل سريع وسهل الاستخدام، وسيلة لإعداد خلايا واحدة من الطبقات المورفولوجية المحددة للتسلسل ذات جودة عالية، مع إصابة ضئيلة للعينة. في المخطوطة الحالية، وتتميز الخلايا العصبية في شبكية العين حساس في جوهرها بشكل مورفولوجيا، معزولة، وعلى استع...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ames' Medium	Sigma Aldrich	A1420-10X1L
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S8875
K-gluconate	Spectrum Chemical	PO178
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758
Alexa Fluor 594 Hydrazide	Invitrogen	A10442
Collagenase	Worthington Biochemical	LS005273
Hyaluronidase	Worthington Biochemical	LS002592
Petri dish (35mm diameter)	Thermo Fisher Scientific	153066
Ophthalmologic scissors	Fine Science Tools	15000-00
#5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
Microplate Shaker	Fisher Scientific	13-687-708
Glass Micropipette	Sutter	BF120-69-10
Micropipette Puller	Sutter		P-1000 horizontal pipette puller
1mL syringe	Fisher Scientific	14-823-2F
Flexible tubing	Fisher Scientific	14-171
TCL lysis buffer	Qiagen	1031576	Lysis Buffer 1
β-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
RNase-Free Water	Qiagen	129112
0.2 ml PCR tubes	Eppendorf	30124359
Ethyl Alcohol, Pure	Sigma Aldrich	E7023	Ethanol
Analog Vortex Mixer	Thermo Fisher Scientific	02215365	Vortex
Mini Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	05-090-100
Agencourt RNAClean XP Beads	Beckman Coulter	A63987	RNA magnetic beads
MagnaBlot II Magnetic Separator	Promega	V8351	Magnetic stand
1.5 ml MCT Graduated Tubes	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit	Clontech	634888	Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification
10X Lysis Buffer			Lysis Buffer 2
5X Ultra Low First-Strand Buffer			Buffer 1
3' SMART-Seq CDS Primer II A			Primer II
SMART-Seq v4 Oligonucleotide			Oligonucleotide
SMARTScribe Rverse Transcriptase			Reverse Transcriptase
2X SeqAmp PCR Buffer			PCR Buffer
PCR Primer II A			PCR Primer
SeqAmp DNA Polymerase			DNA Polymerase
Mastercycler pro S	Eppendorf	950030020	Thermocycler
Agencourt AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63881	DNA magnetic beads
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939AA
HS Bioanalyzer Chips & Reagents	Agilent Technologies	5067-4626
Qubit HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	For the calculation of sample concentrations
Qubit Assay Tubes	Thermo Fisher Scientific	Q32856
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q32866
Nextera XT DNA Sample Preparation Kit	Illumina	FC-131-1024	Reagents for Tagmentation and Index Coupling
TD Buffer			Buffer 2
ATM			Tagmentation Mix
NT Buffer			Tagmentation Neutralizing Buffer
NPM			PCR Master Mix
Nextera XT Index Kit	Illumina	FC-131-1001	Indices for Tagmentation
N501			White 1
N502			White 2
N701			Orange 1
N702			Orange 2
HiSeq 2500	Illumina	SY-401-2501	For completing sequencing of samples