יחיד תא RNA-Seq של קבוצות מוגדרות של תאים גנגליון רשתית

Summary

כאן, אנו מציגים גישה קומבינטורית לסיווג סוגי תאים נוירונים לפני הבידוד ועל אפיון לאחר מכן של transcriptomes תא בודד. פרוטוקול זה מייעל את ההכנה של דגימות עבור רצף RNA מוצלח (RNA-Seq) ומתאר מתודולוגיה שתוכננה במיוחד עבור הבנה משופרת של מגוון הסלולר.

Abstract

גילוי של סמנים ספציפיים סוג תא יכול לספק תובנה לתפקוד הסלולר ואת מקורות ההטרוגניות הסלולרית. עם דחיפה לאחרונה לשיפור ההבנה של המגוון העצבתי, חשוב לזהות גנים אשר הביטוי שלהם מגדיר subpopulations שונים של תאים. הרשתית משמשת מודל מצוין לחקר המגוון של מערכת העצבים המרכזית, שכן היא מורכבת מסוגי תאים רבים. המחקר של כל סוג גדול של תאים הניב סמנים גנטיים המאפשרים זיהוי של אוכלוסיות אלה. עם זאת, תת סוגים מרובים של תאים קיימים בתוך כל אחד אלה הגדולות הכיתות תא הרשתית, ומעטים אלה subtypes יש ידוע סמנים גנטיים, אם כי רבים התאפיינו מורפולוגיה או פונקציה. ידע של סמנים גנטיים עבור תת סוגים ספציפיים ברשתית יאפשר מחקר ומיפוי של מטרות המוח הקשורות פונקציות ויזואליות ספציפיות עשוי גם להשאיל תובנה רשתות הגן כילשמור על מגוון הסלולר. אפיקים עכשוויים המשמשים לזיהוי סמנים גנטיים של תת סוגים יש חסרונות, כגון סיווג של סוגי תאים הבאים רצף. זה מציג אתגר לניתוח נתונים ודורש שיטות אימות קפדניות על מנת להבטיח אשכולות מכילים תאים של אותה פונקציה. אנו מציעים טכניקה לזיהוי מורפולוגיה ופונקציונליות של התא לפני בידוד ורצף, אשר יאפשר זיהוי קל של סמנים ספציפיים משנה. טכניקה זו עשויה להיות מורחבת סוגי תאים שאינם עצביים, כמו גם לאוכלוסיות נדירות של תאים עם וריאציות קלות. פרוטוקול זה מניב נתונים באיכות מעולה, כמו רבים של הספריות סיפקו לקרוא מעמקים גדולים יותר מ 20 מיליון קורא עבור תאים בודדים. מתודולוגיה זו מתגבר על רבים של המכשולים המוצגים על ידי תא יחיד RNA-Seq ועשויים להתאים לחוקרים שמטרתם פרופיל סוגי תאים בצורה פשוטה ויעילה.

Introduction

המגוון העצבתי הוא ציין בכל מערכת העצבים המרכזית, במיוחד הרשתית החולייתיים, רקמה מיוחדת מאוד המורכבת של 1 סוגי גלייה ו 6 תאים עצביים הנובעים מאוכלוסייה אחת של תאים אב רשתית ^{1 , 2 , 3} . תת סוגים רבים של תאים ניתן לסווג מבחינה תפקודית, מורפולוגית, גנטית. מטרת פרוטוקול זה היא לקשור את השונות הגנטית של סוגי תאים למאפיינים פונקציונליים ו / או מורפולוגיים הניתנים לזיהוי שלהם. מספר גנים זוהו עבור סיווג של תאים, אבל תת סוגים רבים ממשיכים ללכת uncharacterized, כפי שהם מייצגים חלק קטן מכלל האוכלוסייה. זיהוי הגנים בתוך תת-סוגים ספציפיים אלה יאפשר הבנה טובה יותר של המגוון העצבתי בתוך הרשתית ויכול גם לשפוך אור על גיוון של תאים עצביים במקומות אחרים. פוRthermore, תא בודד מאפשר לחשיפת סוגי תאים חדשים, אשר אולי היו overlooked בשל ייצוג נמוך שלהם בקרב האוכלוסייה הכוללת ^{4 , 5 , 6 , 7} .

אחד היתרונות של transcriptomics תא בודד הוא כי סמנים ייחודיים או שילובים של סמנים המגדירים תת סוג מסוים ניתן לגלות. אלה יכולים לשמש כדי לקבל גישה גנטית לסוג התא עבור מניפולציות שונות. לדוגמה, אנו משתמשים בפרוטוקול זה כדי לאפיין את סוג התא ספציפי גנים של קבוצת משנה של תאים גנגליון ברשתית המבטאים melanopsin photopigment. השימוש בסמן פלואורסצנטי בתאי גנגליון ברשתית מלנופסין מאפשר לחקור את התאים הללו, מכיוון שהם מקובצים יחד בשל הביטוי שלהם לגן ידוע. מעניין, ישנם חמישה subtypes ידוע של תא זה popuLation ברשתית העכבר ⁸ . לכן, על מנת לבודד RNA מתאי כל סוג, השתמשנו סיווגים מורפולוגיים הוקמה בתוך המודל המהונדס לזהות כל תת סוג לפני בידוד התא. טכניקה זו מאפשרת אפיון של תאים, כמו גם עבור בידוד שלהם ישירות הרשתית, ללא צורך רקמות דיסוציאציה, אשר עלול לגרום לתגובה מתח בתוך תאים זיהום עקב דנדריטים כרותים ⁹ .

שפע של טכניקות חדשות יש אור לאור בשנים האחרונות כמו שיטת RNA-Seq ממשיכה להתפתח. כלים אלה מאפשרים רכישת תאים מקסימלית ויעילות עלות גבוהה יותר כאשר מתקרבים לשאלה הנדונה ^{4 , 7 , 10 , 11 , 12 , 13} . עם זאת, בעודטכניקות אלה היו אבני דריכה מעולה, יש מספר משוכות עדיין נתקל כי פרוטוקול זה הוא מסוגל לטפל. ראשית, רבים מהנהלים הנוכחיים מבודדים תאים מרקמות מנותקות ומנסים להשתמש בניתוח רכיבים ראשי או באשכולות הירארכיים פוסט-הוק לקביעת סיווג התא. ההסתמכות על כלים אלה כדי לסווג תת-סוגים לא תניב תוצאות אמינות ותיאלץ למצוא דרכים חדשות לאימות נתונים אלה עבור המתאם של סמן גנטי לסוג פונקציונלי של תאים. הדרישה לדיסוציאציה בפרוטוקולים אחרים עלולה לעיתים לגרום לנזק לרקמות, ועלולה לגרום לנתק תהליכים עצביים, וכתוצאה מכך לאובדן פוטנציאלי של mRNA. יתר על כן, בהכנות התא ניתק, התגובות הלחץ עשוי להתחיל להשפיע על transcriptomes של תאים אלה ¹⁴ . פרוטוקול זה מתגבר על אתגרים אלה על ידי קביעת סוג התא פונקציונלי לפני הבידוד, וזה טוב יותר שומרת על חשל התאים על ידי שמירה על רקמת הרשתית ללא פגע.

טכניקה אחת הוצגה בשנת 2014 וכללה ניתוח in vivo של transcriptome של תאים חיים ¹⁵ . בעוד טכניקה זו מאפשרת בדיקה של transcriptome עם הפרעה מכנית מינימלית לרקמה, היא חסרה את היכולת לסווג סוגי תאים ספציפיים בתוך הרקמה לפני בחינת transcriptomes שלהם ללא שימוש בעכבר הספציפי מאוד. הפרוטוקול שלנו אינו דורש כתב ספציפי, כפי שאנו לנצל תא מילוי electrophysiology לאפיין תאים לפני הבידוד שלהם. הגבלה נוספת של פרוטוקול זה הקודם היא כי זה דורש אורך גל מסוים כדי לעורר את היסוד photoactivatable, בעוד פרוטוקול שלנו מאפשר שימוש של כתב ניאון וצבע ניאון, אשר זמינים או ניתן לבחור על ידי כל מעבדה בנפרד. עם זאת, מעבדות אחרות יש נשוי שתי שיטות של electrאופיסיולוגיה וטרנסריפטומיקס לחקר המגוון הסלולרי. השימוש של הקלטות מהדק תיקון לאפיין את הפונקציה של התא לפני בידוד שלה בוצעה על נוירונים מנותקים ¹⁶ , ובמקרים מסוימים, היא קדמה לשימוש של ניתוח microarray ¹⁷ עבור מחקרים אלה. סיבוכים אותו נתקלים גישות אלה, כפי שהם דורשים דיסוציאציה רקמות או שימוש בטכנולוגיה microarray, אשר מסתמך על הכלאה של דגימות בדיקות זמינות. אחד ההתקדמות האחרונה היתה פיתוח של תיקון- Seq, טכניקה המשלבת את השימוש של הקלטות מהדק תיקון וטכנולוגיה RNA-Seq כדי להבין תאים מכל פרוסות המוח כולו ¹⁸ . בעוד טכניקה זו יש דמיון שלה לפרוטוקול המוצג כאן, זה שוב חשוב לציין כי הגישה שלנו מאפשרת רקמה להישאר שלמים לבריאות התאים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול האופטימיזציהיון של הברית הזאת, אשר מייצר באיכות גבוהה, תא בודד ספריות לשימוש RNA-Seq להשיג עומק קריאה גבוהה כיסוי המיפוי.

Protocol

כל הנהלים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) באוניברסיטת נורת 'ווסטרן.

1. הכנת פתרונות אלקטרופיזיולוגיה (4 שעות)

1. בצע 0.1% DEPC שטופלו H ₂ O על ידי הוספת 1 מ"ל של diyyl pyrocarbonate (DEPC) ל 999 מ"ל של אוסמוזה הפוכה מטוהרים H ₂ O. מערבבים היטב ולתת את הדגירה תערובת במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר (RT). ואז, החיטוי DEPC מעורבב H ₂ O במשך 15 דקות על מחזור נוזלי. תן DEPC שטופלו H ₂ O מגניב ב RT.
2. הפוך את הפתרון תאיים על ידי ערבוב בקבוק אחד של בינוני אמס ו 1.9 גרם (23 מ"מ) של סודיום ביקרבונט לתוך 1 L של H ₂ O. בועה הפתרון תאיים
   95% O ₂ /5% CO ₂ ולשמור אותו ב pH של 7.3-7.4.
3. יצירת פתרון תאיים על ידי שילוב של 125 מ"מ K-gluconate, 2 מ"מ MgCl ₂ , 10 מ"מ EGTA, 10 מ"מ HEPES, 0.1% DEPC שטופלו H₂ O. לאחסן אותו 1 aliquots מ"ל ב -20 מעלות צלזיוס. הוסף 10 מיקרומטר של נותב ניאון בתחילת כל ניסוי.
4. הפוך פתרון האנזים על ידי הוספת 10,000 יחידות של collagenase ו 83 מ"ג של hyaluronidase ל 4.15 מ"ל של פתרון תאיים. הפתרון האנזים צריך להיות מאוחסן 50 aliquots μL ב -20 מעלות צלזיוס.

2. הכנת רקמת הרשתית (2 שעות)

הערה: יש לבצע את כל ההליכים בסעיף זה תחת תאורה אדומה עמומה

1. כהה להתאים חיות לפחות 1 שעות לפני לנתיחה. בצע את כל ההליכים תחת תאורה אדומה עמום.
2. להרדים את החיות על ידי CO ₂ asphyxiation ו enucleate את העין לתוך צלחת פטרי עם פתרון תאיים מחומצן בעבר.
3. לדחוף את הקרנית עם מחט לחתוך אותו על ידי חיתוך עם מספריים עיניים על גבול הקרנית ו sclera ¹⁹ .
4. הסר את העדשה באמצעות# 5 מלקחיים. בעדינות להפוך דמעה ב sclera עם מלקחיים לנתק את עצב הראייה שבו הרשתית ו sclera להיפגש. בזהירות לסיים את הסרת sclera מן הרשתית.
5. הסר את הזגוגית שקוף באמצעות # 5 מלקחיים; לאחר הסרת, זגוגית מופיע כחומר ג'לטין תקוע המלקחיים. פורסים את הרשתית לחצי (כך שיש 4 חתיכות / בעלי חיים) ולאחסן אותם בתמיסה חוץ-חמצונית מחוממת ב- RT עד לשימוש.
6. כאשר מוכן לעלות את הרקמה בתא ההקלטה, במקום פיסת רשתית לדגור בפתרון אנזים מדולל μL 500 של פתרון תאיים מחומצן. לדגור בצלחת פטרי עבור 2 דקות ב RT על שייקר.
   1. שטפו את פיסת הרשתית בתמיסה תאיים מחומצן ומניחים את הרקמה בתא הקלטה זכוכית התחתונה; השתמש פיפטה העברת פלסטיק עם קצה לחתוך כדי לאפשר הרשתית יועברו ללא גרימת נזק לרקמה.
7. לשימושCeps בזהירות לשטח את הרקמה עם שכבת photoreceptor כלפי מטה. הסר נוזל עודף באמצעות פיפטה. עוגן הרקמה באמצעות טבעת פלטינה עם רשת ניילון.
   הערה: שיטה זו יכולה לשמש גם כדי להכין את הרקמה לבידוד של רנ"א מ שכותרתו amacrine ותאים דו קוטבית.
8. ממלאים את החדר עם פתרון תאיים חמצון ולהעלות אותו על הבמה מיקרוסקופ. רקמות perfuse עם פתרון תאיים חמצון ב 2-4 מ"ל / דקות.

3. ויזואליזציה ומיקוד של GFP + תאים ברשתית גנגליון (10 דקות)

הערה: יש לבצע את כל ההליכים בסעיף זה תחת תאורה אדומה עמומה

1. לפני תחילת, למשוך micropipettes זכוכית (OD: 1.2 מ"מ, מזהה: 0.69 מ"מ) עבור הקלטות אלקטרו באמצעות משגר micropipette. השתמש בפרוטוקול הבא עבור האלקטרודות (שים לב כי הפרמטרים צריך להיות מותאם בהתאם להשיג את ההתנגדות הרצויה יהיהלהשתנות על פני משיכים עם זכוכית שונים): חום: כבש +10; משוך: 0; Vel: 23; עיכוב: 1; לחץ: 500; תוכנית לולאה: 5 פעמים. ודא כי הטיפים הם ~ 1 מיקרומטר בקוטר, עם ההתנגדות של 2-4 MΩ עבור מיקוד תאים גדולים של 5-7 MΩ למיקוד תאים קטנים יותר.
2. לבחון את שכבת התא גנגליון באמצעות הפרעות אינפרא אדום הפרעה ניגודיות (IR-DIC) אופטיקה ( איור 1 א ). זיהוי GFP + תאים גנגליון רשתית (RGCs) באמצעות epifluorescence (~ 480 ננומטר) ( איור 1 ב ).
3. אתר פיפטה מלא פתרון תאיים ב- DIC. החלת לחץ חיובי קל ואפס כל מתח קיזוז על מגבר.
4. לחץ על micropipette זכוכית כנגד תא GFP + וליישם לחץ שלילי כדי ליצור חותם GΩ בין פיפטה לבין קרום התא. החל בדיקה של שלבי המבחן ( למשל, 5 mV) כדי לפקח על עמידות החותם. לאחר יצירת חותמת יציבה, לקרוע את הממברנה על ידי הפעלת פעימות קצרות של nלחץ אקטיבי כדי לקבל גישה לתא שלם.
5. המתן 1-2 דקות עבור הדנדריטים של התא למלא נותב פלואורסצנטי.
   הערה: התא ניתן להקליד מורפולוגית על ידי בחינת מורפולוגיה ב epifluorescence ( איור 1C ). במקרה של melanopsin- ביטוי RGCs, ריבוד דנדריטי בשכבה plexiform הפנימי הוא דמיינו על ידי בחינת הדנדריטים מלאים נותב ניאון תחת תאורה epifluorescent וקביעת אם הם stratify רחוק סומה ב sublamina OFF (M1 ipRGCs), ליד הגנגליון (M2 & M4 ipRGCs), או שניהם (M3 ipRGCs). תצפית זו, בשילוב עם גודל soma (M4s יש somas גדול באופן מובהק לעומת כל תת סוגים אחרים ipRGC), מאפשרים זיהוי של סוג התא ^{20 , 21 , 22} . לכן, טכניקה זו מאפשרת זיהוי של סוג התא במבחנה לפני RNA ISOLation. שיטה זו יכולה להיות שונה עבור סוג אחר התא זיהוי פרוטוקולים מעורבים או מורפולוגיה dendritic או פיזיולוגיה הסלולר.

4. בידוד תא (2 דקות)

1. לפני תחילת, להגדיר את microcentrifuge השולחן עד 2,000 x גרם. הכן מדגם expelling על ידי חיבור צינור (OD: 3/32 ב, מזהה: 1/32 ב) עם מזרק 1 סמ"ק.
2. מקום 0.2 צינורות מ"ל PCR המכיל 10 μL של חיץ תמוגה ו 1% β-mercaptoethanol על הקרח. הכן מזרק 1 cc המכיל DEPC שטופלו H ₂ O לשטוף את טיפים פיפטה. הכן מכולה של קרח יבש להקפיא את המאגר תמוגה לאחר איסוף המדגם.
3. בזהירות לחלץ את התוכן cytoplasmic של פיפטה התא על ידי הפעלת לחץ שלילי באמצעות מזרק 10 מ"ל; כל תוכן cytoplasmic, כולל האברונים, יש לחלץ אם אפשר.
   1. לפקח על החילוץ ב- DIC ידי הדמיה של גוף התא יורדת בגודל. לאחר החילוץ את התוכן cytoplasmic, להרים את פיפטה בזהירות את הרקמה במהירות להסיר את פיפטה מהפתרון.
4. להסיר במהירות את פיפטה מן בעל הבמה הראש ולשטוף את קצה פיפטה בקצרה עם DEPC שטופלו H ₂ O באמצעות מזרק 1 מ"ל. חבר את פיפטה מזרק 1 מ"ל דרך צינורות מתאים להדק את המדגם.
5. מיד לגרש את התאים μL 10 של חיץ תמוגה 1 המכיל 1% β-mercaptoethanol ב 0.2 צינורות PCR מ"ל.
   הערה: לשאוב את כל התאים צריך להיות מגורש בעדינות כדי לא להכניס בועות.
   1. בקצרה צנטריפוגה הצינור בצנטריפוגה מיני השולחן ב 2000 xg במשך 10 שניות. מיד פלאש להקפיא את דגימות במשך 5 דקות על קרח יבש. לאחר הקפאה, לאחסן אותם ב -80 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים לקבלת התוצאות הטובות ביותר; הדגימות עשויות להימשך זמן רב יותר, אך מומלץ כי הן יעובדו במהירות האפשרית.

E "> 5. טיהור רנ"א (30 דקות)

1. לפני תחילת, להגדיר התקן מפריד מגנטי על ידי הדבקת החלק העליון של בעל קצה P20 או P200 קצה הפוך לעמוד 96 מגנטי גם ²³ .
2. הכן אתנול 70% טרי (EtOH) - כ 1 מ"ל לכל מדגם יספיק. הסר את חרוזי רנ"א מגנטי מ 4 ° C אחסון להפשיר אותם ב RT לפחות 30 דקות.
   הערה: לא יותר מ 8 דגימות צריך להיות מעובד בבת אחת, כמו צעדים רבים בפרוטוקול זה להסתמך על יעילות וטיפול מהיר.
3. לאחר חרוזים מגנטיים נמצאים ב RT, מערבולת במשך 30 s כדי להבטיח כי הפתרון מעורב היטב.
   הערה: חרוזים להשתמש RNA ספציפי למאגר כדי להיקשר באופן סלקטיבי RNA, והם מאפשרים הסרה של פסולת הסלולר אחרים כאשר מועסקים עם מעמד צלחת מגנטית.
4. להפשיר תאים RT במשך 1 דקות, ולאחר מכן להוסיף 5 μL של RNase חינם H ₂ O למדגם זה; פיפטה למעלה ולמטה. הוסף 22 μL של חרוזי RNA לכל צינור pipettלערבב היטב. דגירה דגימות ב RT במשך 5 דקות כדי לאפשר RNA לקיים אינטראקציה לאגד עם חרוזים מגנטיים.
5. מניחים את הצינורות על מכשיר מפריד מגנטי ולתת לשבת 8 דקות; לפני שתמשיך, להבטיח כי supernatant ברור. שימו לב החרוזים מתוך גלולה אחת ולוודא לא לנתק אותו במהלך pipetting.
6. הסר את supernatant מן דגימות ולהוסיף 150 μL של EtOH 70%. הסר את EtOH וחזור לשטוף פעמיים נוספות.
7. אפשר דגימות לאוויר יבש במשך 6 דקות. בדוק לסירוגין כדי לראות אם EtOH יותר אספה בתחתית הצינור. הסר אותו בהתאם.
8. בעוד הדגימות מתייבשים, להכין 10X חיץ התגובה על ידי שילוב של 19 μL של חיץ תמוגה 2 ו 1 μL של מעכב RNase (40 U / μL). סובב אותו בקצרה ושמור אותו על הקרח.
9. לאחר דגימות יבש את כדורי חרוז כבר לא נראה מבריק, להסיר את צינורות מפריד מגנטי ולהוסיף 9.5 μL של RNase ללא H ₂ Oכדי rehydrate דגימות. מניחים את הדגימות על הקרח ומוסיפים 1 μL של חיץ התגובה 10x למדגם זה.

6. שעתוק הפוך (10 דקות)

הערה: לפני תחילת, להפשיר את ריאגנטים הדרושים עבור שעתוק לאחור (RT, למעט האנזים) על הקרח. אלה כוללים: פריימר II, חיץ 1, oligonucleotide, ומעכב RNase.

1. לכל צינור, להוסיף 2 μL של תחל II (AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGAGTACT ₍₃₀₎ N _-1 N, אשר N _-1 יכול להיות A, C, או G ו- N יכול להיות, C, G, או T, 12 מיקרומטר). מניחים את צינורות thermocycler כי כבר שחומם ב 72 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות.
2. במהלך הדגירה, להכין את תערובת מאסטר RT. עבור כל תגובה, להוסיף 4 μL של חיץ 1 (250 מ"מ טריס HCl, pH 8.3, 375 מ"מ KCl, ו 30 מ"מ MgCl ₂ ), 1 μL של oligonucleotide (48 מיקרומטר), ו 0.5 μL של מעכב RNase (40 U / ΜL).
3. מיד לאחר הדגירה, במקום צינורותקרח 2 דקות.
4. הוסף 2 μL לכל תגובה של transcriptase הפוך (100 U / μL) לתערובת הורים פיפטה ביסודיות. הוסף 7.5 μL של תערובת אב לצינור כל ומערבבים על ידי pipetting בעדינות. בקצרה לסובב את הצינורות כדי לאסוף את התוכן בתחתית ומכניסים אותם thermocycler שחומם מראש עם התוכנית הבאה: 42 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות, 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, והחזק ב 4 מעלות צלזיוס.
5. אחסן את צינורות ב -20 ° CO / N לפני שתמשיך, אם כי מומלץ הדגימות להתבצע באמצעות צעד ההגברה לפני מאוחסן לתקופות זמן ארוכות; מקורות אחרים מציעים O / N אחסון ב 4 ° C יהיה גם מקובל בשלב זה ²⁴ .

7. הגברה cDNA (2.5 שעות)

הערה: לפני תחילת, להפשיר חיץ PCR ו PCR תחל על הקרח ספין צינורות למטה צנטריפוגה מיני השולחן לפני ביצוע התמהיל הראשי PCR.

1. עבור כל תגובה, עמ 'Repare תערובת הורים PCR המכיל 25 μL של חיץ PCR, 1 μL של תחל PCR (12 מיקרומטר), 1 μL של פולימראז דנ"א, ו 3 μL של Nuclease ללא H ₂ O. הוסף את הפולימרז DNA האחרון, רק לפני תוספת של תערובת הורים לדגימות.
2. הוסף 30 μL של תערובת אב צינור כל ספין ב 2000 xg במשך 10 שניות כדי לאסוף את התוכן בחלק התחתון של הצינורות.
3. מניחים את צינורות thermocycler שחומם מראש עם התוכנית הבאה: 95 מעלות צלזיוס למשך דקה 1; 34 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 65 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו- 68 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות; ו להחזיק ב 4 ° C.
   הערה: מספר המחזורים עבור PCR זה הוגדל ל -34, שונה מהוראות היצרן המוצעות. לאחר בדיקה חוזרת, מספר מחזור זה נמצא כדי לייצר תוצאות אמינות באופן עקבי.
4. חנות צינורות ב -20 מעלות צלזיוס למשך שנה אחת לפני שתמשיך.

8. טיהור של cDN מוגברA (30 דקות)

1. לפני תחילת טיהור, להביא את חרוזי DNA חיץ elution כדי RT לפחות 30 דקות. הכן 80% EtOH טרי; 1 מ"ל לכל מדגם צריך להספיק. הוסף 1 μL של חיץ תמוגה 10X למדגם זה.
2. וורטקס חרוזי ה- DNA עבור 30 s ולהוסיף 50 μL של חרוזי DNA לכל מדגם. מערבבים היטב על ידי pipetting, ולאחר מכן בקצרה ספין אותם ב 2000 xg במשך 10 שניות. דגירה צינורות ב RT במשך 8 דקות.
3. מניחים את הצינורות על המכשיר ההפרדה המגנטית במשך 5 דקות. בעדינות פיפטה supernatant מעלה ומטה פעמיים ולאפשר דגימות לשבת במשך 2 דקות. בעוד הדגימות הן על המכשיר המגנטי, להסיר את supernatant וזורקים.
4. הוסף 150 μL של EtOH 80% טריים למדגם זה ולאפשר להם לשבת ב RT במשך 30 שניות. הסר את EtOH וחזור על שטיפת EtOH פעם אחת.
5. בקצרה לסובב את דגימות ומניחים אותם בחזרה על מפריד מגנטי במשך 1 דקות. הסר כל EtOH הנותרים ולאפשר דגימות לאוויר יבש במשך 5 דקות.
6. בדוק את הדגימות לסירוגין כדי לראות אם EtOH כלשהו אספה ולהסיר אותו עם פיפטה.
7. לאחר גלולה חרוז כבר לא נראה מבריק, אבל לפני סדקים מתחילים להופיע, להסיר את הצינור מן מפריד מגנטי ולהוסיף 17 μL של חיץ elution. בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי resuspend את החרוזים לחלוטין.
8. דגירה דגימות resuspended ב RT במשך 2 דקות.
9. בקצרה לסובב את הדגימות כדי לאסוף את כל נוזל בתחתית ומניחים אותם על מפריד מגנטי במשך 2 דקות. העברת 15 μL של supernatant ברור לצינור 1.5 מ"ל RNase חינם ולאחסן אותו ב -20 מעלות צלזיוס.
10. לבחון את איכות וגודל הספריה cDNA עם שבב bioanalyzer רגישות גבוהה באמצעות 1 μL של cDNA. הגודל האידיאלי של ספריית cDNA הוא 0.3-2 Kb, עם ריכוז של לפחות 10 ng / μL ( איור 2 ).
    הערה: אתה יכול לבחור להעסיק PCR כדרך דגימות המסך כדי להבטיח את הביטוי של סמנים ידועים לפני שתמשיך עם מדגם PREparation.

9. קביעת ריכוזים ותגית cDNA (20 דקות)

1. לפני תחילת, להביא את מגיב assay, דילול חיץ, וסטנדרטים RT במשך 30 דקות. הכן תערובת אב המכיל 1 μL של מגיב assay ו 199 μL של חיץ דילול לכל תגובה. Aliquot 199 μL של תערובת זו לתוך 500 צינורות assay μL. הוסף 1 μL של המדגם ומערבבים היטב.
2. Aliquot 190 μL של תערובת הראשי צינור 1 & 2. הוסף 10 μL של תקן 1 כדי צינור 1 ו 10 μL של תקן 2 כדי צינור 2. וורטקס כל צינורות מדגם צינורות סטנדרטיים עבור 5 S; דגירה ב RT במשך 3 דקות.
3. קביעת ריכוז של דגימות עם fluorometer רגישות גבוהה. ודא את כמות המדגם הנכון כבר קלט על ידי בחירת "חישוב פתרון המניות" אפשרות הדגשת "1 μL". לדלל כל מדגם בצינור 1.5 מ"ל נפרד לריכוז סופי של 0.2 ng / μL ב RNase חינם H ₂ O.
   הערה:בעוד הוראות היצרן עולה כי אחד צריך להתחיל עם 1 ng / μL סך של DNA, השתמשנו כמות החל קטן יותר יש גם להתאים את הפרוטוקול כדי להסביר את התיקון הזה.
4. ב 0.2 צינורות מ"ל חדש PCR, פיפטה 2.5 μL של חיץ 2. הוסף 1.25 μL של cDNA לצינור המתאים עבור סכום כולל של 250 pg. לבסוף, להוסיף 1.25 μL של תמהיל tagmentation לכל צינור פיפטה ביסודיות לערבב; טרנספוזאז בתוך תערובת תיוג יהיה לשבור את ה- DNA לגדילים קצרים anneal המתאמים את הקצה של כל גדיל, לשימוש מאוחר יותר על ידי מכשיר רצף.
   הערה: אמצעי האחסון המשמשים לתיוג ולצימוד לאינדקס הם חלק מהכמות המוצעת בהוראות היצרן. זה לא רק מאפשר שימור של ריאגנטים, אבל זה גם מייצר בעקביות דוגמאות מתויגות מניסיוננו.
5. צנטריפוגה צינורות על microcentrifuge הדלפק במשך 1 דקות.
6. מניחים את הצינורותב thermocycler מראש עם התוכנית הבאה: 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות להחזיק ב 10 מעלות צלזיוס.
   הערה: אורך הדגירה הוא 10 דקות, לעומת 5 דקות המוצע מהוראות היצרן.
7. מיד לאחר תוכנית זו תושלם, להסיר את צינורות להוסיף 1.25 μL של תיוג לנטרל חיץ לכל. פיפטה היטב לערבב דגירה ב RT במשך 5 דקות. השלם שלב זה מיד, כמו transposase נשאר פעיל עד למאגר מנטרל את האנזים ועוצר את התגובה.

10. מדד צימוד וטיהור (1 h)

הערה: לפני תחילת, להביא את חרוזי DNA למאגר resuspension ל RT לפחות 30 דקות. להחליט אילו מדדים להשתמש עבור כל אחד הדגימות.

הערה: מדדים אלה יצורפו 5 "ו 3" הקצוות המתאימים של ה- DNA מקוטעת לזיהוי דגימות הבאים רצף. ודא כי לא שנייםזוגות זהים עבור דגימות שניתן רצף יחד. לדוגמה, אם המדגם 1 ישתמש במדדים לבנים 1 וכתום 1, מדגם שני צריך להשתמש לבן 1 וכתום 2 או לבן 2 ותפוז 2, אבל לא את אותו שילוב של מדדים. ערכה זו מכילה 4 מדדים לבנים ו -6 כתומים שונים. כל השילובים האפשריים שונים מאפשרים עד 24 דגימות להיות משולב במסלול אחד רצף. למרות שאנו בדרך כלל רק 10 דגימות בריכה בנתיב, אפשר גם להשתמש בערכה המכילה 24 מדדים, אשר יאפשר קיבוץ של 96 דגימות בנתיב אחד של רצף, אם תרצה בכך.

1. לכל צינור, להוסיף 1.25 μL של המדד השמאלי ו 1.25 μL של המדד הנכון למדגם מסוים. הוסף 3.75 μL של תערובת הורים PCR ו פיפטה גם לערבב.
2. צנטריפוגה microcentrifuge הדלפק במשך 1 דקות.
3. מניחים את צינורות thermocycler שחומם מראש עם התוכנית הבאה: 72 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; 12 מחזורים של 9576; C במשך 10 שניות, 50 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו 72 מעלות צלזיוס למשך דקה 1; 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; ו להחזיק ב 4 ° C.
   הערה: הראשון 95 ° C צעד שונה מ 98 מעלות צלזיוס, אשר הוצע על ידי הוראות היצרן. כמו כן, פרטי המחזור הותאמו כך שהטמפרטורות ואורכי הזמן המותרים לתג האופטימלי של הדגימות שלנו. הסופי הדגירה C 72 מעלות נוספה גם פרוטוקול שלנו לא נכלל בהוראות היצרן.
4. בקצרה לסובב את הצינורות כדי לאסוף את התוכן בתחתית. וורטקס חרוזי ה- DNA עבור 30 s, ולאחר מכן להוסיף 30 μL לצינור זה ומערבבים היטב על ידי pipetting.
5. דגירה דגימות ב RT במשך 5 דקות.
6. מניחים את הדגימות על מפריד מגנטי עבור 2 דקות. פיפטה supernatant למעלה ולמטה פעמיים דגירה דגימות במשך 1 דקות.
7. הסר וזורקים את supernatant ברור. הוסף 150 μL של EtOH 80% לכל מדגם ולהסיר. חזור על שטיפת EtOH פעם אחת.
8. לאפשר thדגימות אוויר לאוויר יבש במשך 10 דקות. בדוק לסירוגין כדי לראות אם EtOH כלשהו אספה בתחתית של צינורות להסיר לפי הצורך.
9. לאחר סדק מתחיל להופיע גלולה חרוז DNA, להסיר את המדגם מן מפריד מגנטי ולהוסיף 27.5 μL של חיץ resuspension כדי לייבש את גלולה. ודא כי גלולה הוא resuspended לחלוטין, ולאחר מכן דגירה ב RT במשך 2 דקות.
   הערה: נפח המשמש למאגר resuspension שונה כדי להסביר את כמות קטנה יותר של חומר המוצא בפרוטוקול שלנו שונה מהנפח הציע בהוראות היצרן.
10. מניחים את הצינורות על מפריד מגנטי במשך 2 דקות. העברת 25 μL של supernatant ברור לתוך צינור RNase חינם בחנות ב -20 מעלות צלזיוס.
    הערה: אל תמשיך בהוראות היצרן להשלמת נורמליזציה של הספרייה. הדגימות הוכנו בהצלחה לאחר שלב זה מוכנים מוכנים כמו רצף.
11. לנתח את tאגמנטציה של דגימות באמצעות שבב bioanalyzer ו 1 μL של כל מדגם.
    הערה: ניתוח של כתמים יתבצע מוקדם יותר; עם זאת, cDNA צריך להיות מזוהה כעת בטווח גודל של 0.2-1 Kb ( איור 3 ). ריחות מתחת לנקודה זו עשויים לייצג את השפלה של דגימות, בעוד מריחות גדולות יותר מציעות תיוג חלקי.

11. מאגר של דוגמאות (10 דקות)

1. השג ריכוזים של דגימות תיוג עם פלואורומטר רגישות גבוהה מ מוקדם יותר לקבוע את הריכוז ב- nm.
   הערה: חישוב זה יכול להיות מחושב עם השימוש בכלי ההמרה באינטרנט מסתמך על אורך השבר הממוצע מן ביואנליזה עקבות. כדי לקבוע את אורך השבר הממוצע, לבחון את עקבות עבור כל מדגם בנפרד ולקבוע את הגודל של קטע ה- DNA הממוצע. זה יכול להיות מחושב גם כאשר בוחנים את ביואנליזה עקבות על ידי הדגשת טווח של כתם ובדיקהE מולריות מחושב על ידי התוכנית.
2. שלב דוגמאות כאלה הבריכה מכילה ריכוז זהה של כל מדגם. אין לדלל דגימות; הבריכה צריכה להיות רק כמו לדלל כמו המדגם הנמוך ביותר מרוכז יהיה אידיאלי יש ריכוז כולל של לפחות 15 ננומטר.
3. אחסן את הדגימות שנאספו ב -20 מעלות צלזיוס לפני רצף; הוא הציע דגימות לעבור רצף בתוך שבוע 1 של איגום. בצע זוג בסוף, 100 רצף BP עם פלטפורמת HiSeq.

תוצאות

סוגי תאים מסווגים בקלות בעקבות הזרקת צבע

איור 1 מציג דוגמה של RGC GFP + לפני ואחרי מילוי נותב ניאון. תא זה זוהה על בסיס הביטוי שלו של ה- GFP בקו מהונדס ( איור 1 א ). אטימה הדוקה נוצרה עם א?...

Discussion

הפרוטוקול שלנו מדגים, באמצעות מדריך מהיר וקל לשימוש, שיטה להכין תאים בודדים של שיעורים מורפולוגיים מזוהה עבור רצף באיכות גבוהה, עם פגיעה קטנה המדגם. בכתב היד הנוכחי, תאי הגנגליון ברשתית רגישים מבחינה גופנית מאופיינים באופן מורפולוגי, מבודדים ומוכנים ל- RNA-Seq. מדדים סל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ames' Medium	Sigma Aldrich	A1420-10X1L
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S8875
K-gluconate	Spectrum Chemical	PO178
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758
Alexa Fluor 594 Hydrazide	Invitrogen	A10442
Collagenase	Worthington Biochemical	LS005273
Hyaluronidase	Worthington Biochemical	LS002592
Petri dish (35mm diameter)	Thermo Fisher Scientific	153066
Ophthalmologic scissors	Fine Science Tools	15000-00
#5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
Microplate Shaker	Fisher Scientific	13-687-708
Glass Micropipette	Sutter	BF120-69-10
Micropipette Puller	Sutter		P-1000 horizontal pipette puller
1mL syringe	Fisher Scientific	14-823-2F
Flexible tubing	Fisher Scientific	14-171
TCL lysis buffer	Qiagen	1031576	Lysis Buffer 1
β-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
RNase-Free Water	Qiagen	129112
0.2 ml PCR tubes	Eppendorf	30124359
Ethyl Alcohol, Pure	Sigma Aldrich	E7023	Ethanol
Analog Vortex Mixer	Thermo Fisher Scientific	02215365	Vortex
Mini Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	05-090-100
Agencourt RNAClean XP Beads	Beckman Coulter	A63987	RNA magnetic beads
MagnaBlot II Magnetic Separator	Promega	V8351	Magnetic stand
1.5 ml MCT Graduated Tubes	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit	Clontech	634888	Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification
10X Lysis Buffer			Lysis Buffer 2
5X Ultra Low First-Strand Buffer			Buffer 1
3' SMART-Seq CDS Primer II A			Primer II
SMART-Seq v4 Oligonucleotide			Oligonucleotide
SMARTScribe Rverse Transcriptase			Reverse Transcriptase
2X SeqAmp PCR Buffer			PCR Buffer
PCR Primer II A			PCR Primer
SeqAmp DNA Polymerase			DNA Polymerase
Mastercycler pro S	Eppendorf	950030020	Thermocycler
Agencourt AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63881	DNA magnetic beads
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939AA
HS Bioanalyzer Chips & Reagents	Agilent Technologies	5067-4626
Qubit HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	For the calculation of sample concentrations
Qubit Assay Tubes	Thermo Fisher Scientific	Q32856
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q32866
Nextera XT DNA Sample Preparation Kit	Illumina	FC-131-1024	Reagents for Tagmentation and Index Coupling
TD Buffer			Buffer 2
ATM			Tagmentation Mix
NT Buffer			Tagmentation Neutralizing Buffer
NPM			PCR Master Mix
Nextera XT Index Kit	Illumina	FC-131-1001	Indices for Tagmentation
N501			White 1
N502			White 2
N701			Orange 1
N702			Orange 2
HiSeq 2500	Illumina	SY-401-2501	For completing sequencing of samples