视网膜神经节细胞定义子集的单细胞RNA-Seq

摘要

在这里，我们提出了一种组合方法，用于在分离之前对神经元细胞类型进行分类，以及随后对单细胞转录组进行表征。该协议优化了用于成功的RNA测序（RNA-Seq）的样品的制备，并描述了专门为增强细胞多样性的理解而设计的方法。

摘要

细胞类型特异性标记的发现可以提供对细胞功能的了解和细胞异质性的起源。随着对神经元多样性的更好理解的推动，识别表达定义各种细胞亚群的基因是重要的。视网膜作为中枢神经系统多样性研究的优秀模式，由多种主要细胞类型组成。每个主要类别细胞的研究已经产生了便于识别这些群体的遗传标记。然而，在这些主要视网膜细胞类别的每一个中存在多种细胞亚型，并且这些亚型中很少有已知的遗传标记，尽管许多已经通过形态或功能表征。对于个别视网膜亚型的遗传标记的知识将允许与特定视觉功能相关的脑靶标的研究和绘图，并且还可以洞察基因网络维持细胞多样性。用于鉴定亚型遗传标记的现有途径具有缺点，例如测序后细胞类型的分类。这为数据分析提出了挑战，需要严格的验证方法来确保集群包含相同功能的单元格。我们提出了一种用于在分离和测序之前鉴定细胞的形态和功能的技术，这将允许更容易鉴定亚型特异性标记。这种技术可以扩展到非神经元细胞类型，以及稀有的具有微小变异的细胞群体。该协议产生优质的数据，因为许多库为单个单元提供了大于2000万次读取的读取深度。该方法克服了单细胞RNA-Seq提出的许多障碍，并且可能适用于以直接和高效的方式分析细胞类型的研究人员。

引言

在整个中枢神经系统中观察到神经元多样性，特别是在脊椎动物视网膜中，这是一种由1个神经胶质细胞和6个神经元细胞类型组成的高度专门化的组织，其由视网膜祖细胞^{1,2,3组产生} 。细胞的许多亚型可以在功能上，形态上和遗传上分类。该方案的目标是将细胞类型的遗传变异性与其可识别的功能和/或形态特征相结合。已经鉴定了许多基因用于细胞分类，但是许多亚型仍然没有表征，因为它们代表总体群体的一小部分。这些特定亚型中的基因的鉴定将允许更好地了解视网膜内的神经元多样性，并且还可以揭示其他地方的神经细胞的多样化。福此外，单细胞研究允许揭示新细胞类型，这可能被忽略，因为它们在总体4,5,6,7中的代表性很低。

单细胞转录组学的优点之一是可以发现定义特定细胞亚型的独特标记或标记组合。然后，这些可用于获得对该细胞类型的遗传接触以进行不同的操作。例如，我们正在使用该协议来表征视网膜神经节细胞亚类的细胞类型特异性基因，其表达色素黑素素。荧光标记物在表达黑色素的视网膜神经节细胞中的使用使得能够研究这些细胞，因为它们由于其已知基因的表达而聚集在一起。有趣的是，这种细胞群有五种已知的亚型老鼠视网膜中的信号⁸ 。因此，为了从每种类型的细胞中分离RNA，我们在转基因模型中已经使用确定的形态学分类，以在细胞分离之前鉴定每种亚型。这种技术允许表征细胞以及直接从视网膜分离，而不需要组织解离，这可能导致细胞内的应激反应和由于切断的树突引起的污染⁹ 。

随着RNA-Seq方法的不断发展，过去几年中已经有了许多新技术。这些工具允许最大化的细胞获取和更高的成本效率，同时接近手头4，7，10，11，12，13的问题。但是，虽然这些技术一直是优秀的踏脚石，还有一些障碍仍然遇到这个协议能够解决。首先，许多目前的程序将细胞与解离的组织分离，并尝试使用主成分分析或事后分层聚类来确定细胞分类。依靠这些工具来分类亚型可能不会产生可靠的结果，并且可能迫使人们找到新的方法来验证这一数据，以便将遗传标记与功能性细胞类型相关联。其他方案中解离的要求有时会导致组织损伤，并可能导致神经元过程被切断，导致mRNA潜在的丧失。此外，在解离的细胞制剂中，应激反应可能开始影响这些细胞的转录组¹⁴ 。该协议通过确定隔离前的功能细胞类型来克服这些挑战，并且更好地维持h通过保持视网膜组织完整而保持细胞。

2014年引入了一种技术，其中包括活细胞转录组的体内分析。虽然这种技术允许以对组织的最小的机械破坏来检查转录组，但是在检查其转录组之前没有使用非常特异性的记录小鼠，其缺乏对组织内的特定细胞类型进行分类的能力。我们的方案不需要特定的记者，因为我们利用细胞填充和电生理学在细胞分离前表征细胞。此前协议的另一个限制是需要特定的波长来激发可光活化的元件，而我们的方案允许使用荧光报告物和荧光染料，这些荧光染料可以容易地获得，也可以由每个实验室单独选择。然而，其他实验室却结婚了两种电话生物学和转录组学研究细胞多样性。已经在分离的神经元¹⁶上进行使用膜片钳记录来表征细胞在其分离之前的功能，并且在某些情况下，已经使用微阵列分析¹⁷进行这些研究。这些方法遇到相同的并发症，因为它们需要组织解离或使用微阵列技术，其依赖于样品与可用探针的杂交。最近的进展之一是Patch-Seq的发展，Patch-Seq是一种结合使用膜片钳记录和RNA-Seq技术来了解全脑切片细胞的技术。虽然这种技术与本文提出的方案有相似之处，但重要的是要注意，我们的方法允许组织保持完整，以保持细胞的健康。在这里，我们提出了一个优化协议该联盟产生高质量的单细胞文库以使用RNA-Seq获得高读取深度和测绘覆盖率。

研究方案

所有程序均获得西北大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

1.电生理解决方案的准备（4小时）

1. 通过向999mL反渗透纯化的H ₂ O中加入1mL焦碳酸二乙酯（DEPC），使0.1％DEPC处理的H ₂ O充分混合，使混合物在室温（RT）下孵育1小时。然后，将DEPC混合的H ₂ O在液体循环下高压灭菌15分钟。让DEPC处理的H ₂ O在室温下冷却。
2. 通过将一瓶Ames培养基和1.9g（23mM）碳酸氢钠混合到1L H ₂ O中来制备细胞外溶液。将细胞外溶液与
   95％O ₂ /5％CO ₂ ，并保持在7.3-7.4的pH。
3. 通过将125mM的葡萄糖酸钾，2mM MgCl 2，10mM EGTA，10mM HEPES和0.1％DEPC处理的H₂ O.将其在-20℃下保存在1mL等分试样中。在每个实验开始时加入10μM的荧光示踪剂。
4. 通过向4.15mL细胞外溶液中加入10,000单位胶原酶和83mg透明质酸酶制成酶溶液。酶溶液应在-20°C下保存在50μL等分试样中。

2.制备视网膜组织（2 h）

注意:本节中的所有步骤都应在昏暗的红色照明下进行

1. 在解剖前至少1小时将动物进行黑暗适应。在昏暗的红色照明下执行所有程序。
2. 通过CO ₂窒息将动物安乐死，并将眼球摘除成具有先前含氧的细胞外溶液的培养皿。
3. 用针刺角膜，并用眼科剪刀在角膜和巩膜边缘切割切开。
4. 取下镜头＃5镊子。用镊子轻轻敲打巩膜，切断视网膜和巩膜视网膜。小心地从视网膜上清除巩膜。
5. 使用＃5镊子去除透明玻璃体;一旦去除，玻璃体就像凝胶状物质粘在镊子上。切片视网膜一半（以便有4件/动物），并将其储存在含氧细胞外溶液中，直至使用。
6. 准备将组织装入记录室时，放置一片视网膜，在500μL含氧细胞外溶液中稀释的酶溶液中孵育。在培养皿中用振荡器在室温下孵育2分钟。
   1. 在含氧细胞外溶液中洗涤视网膜，并将组织放置在玻璃底部记录室中;使用塑料转移移液管切断切口以允许视网膜转移而不会损坏组织。
7. 用于哔哔哔哔哔哔哔咕咕咕。。。。。。。。。。使用移液器去除多余的液体。使用带有尼龙网的铂金环将组织固定。
   注意:该方法也可用于制备用于从标记的无远端和双极细胞分离RNA的组织。
8. 向室内注入含氧细胞外溶液，并将其安装在显微镜载物台上。用2-4mL / min的氧合细胞外溶液灌注组织。

GFP +视网膜神经节细胞的可视化和靶向（10分钟）

注意:本节中的所有步骤都应在昏暗的红色照明下进行

1. 在开始之前，使用微量移液管拉拔器拉动玻璃微量移液器（OD:1.2 mm，ID:0.69 mm）进行电生理记录。对于电极使用以下协议（请注意，参数应相应调整以达到所需的电阻和要求拉杆和玻璃不同）:热量:斜坡+10;拉:0; Vel:23;延迟:1;压力:500;程序循环:5次。确保尖端直径约为1μm，针对大电池的电阻为2-4MΩ，针对较小电池的电阻为5-7MΩ。
2. 使用红外差分干涉对比（IR-DIC）光学观察神经节细胞层（ 图1A ）。使用落射荧光（〜480nm）鉴定GFP +视网膜神经节细胞（RGC）（ 图1B ）。
3. 找到在DIC中充满细胞内溶液的移液管。在放大器上施加轻微的正压和零电压偏移。
4. 将玻璃微量移液管压靠GFP +细胞并施加负压，以在移液管和细胞膜之间形成GΩ密封。应用测试电压指令步骤（ 例如 5 mV）来监测密封电阻。形成稳定的密封后，通过施加n的短脉冲使膜破裂获得全细胞接入的特殊压力。
5. 等待1-2分钟，细胞的树突填充荧光示踪剂。
   注意:可以通过检查落射荧光中的形态来形成细胞（ 图1C ）。在表达黑素素的RGCs的情况下，通过在荧光照射下检查充满荧光示踪剂的树突并确定它们是否远离离子腺体（M1 ipRGCs），神经节附近的肌瘤分层，来显现内丛状层中的树突状分层（M2＆M4 ipRGCs）或两者（M3 ipRGCs）中的细胞层。这一观察结果与soma大小（M4s与所有其他ipRGC亚型相比具有明显的大体积），允许识别细胞类型^20,21,22 。因此，该技术允许在 RNA异构体之前在体外鉴定细胞类型特征研。对于涉及树突形态或细胞生理学的其他细胞类型鉴定方案，可以修饰该方法。

细胞分离（2分钟）

1. 开始之前，将台式微量离心机设置为2,000 x g。通过连接管（OD:3/32 in，ID:1/32 in）与1cc注射器制备样品排出装置。
2. 将含有10μL裂解缓冲液和1％β-巯基乙醇的0.2mL PCR管置于冰上。准备一个含有DEPC处理的H ₂ O的1cc注射器，以冲洗移液器吸头。准备一个干冰容器，以收集样品后冻结裂解缓冲液。
3. 通过使用10mL注射器施加负压，小心地提取细胞移液管的细胞质含量;如果可能，应提取所有细胞质含量，包括细胞器。
   1. 通过可视化细胞体尺寸减小来监测DIC中的提取。提取后细胞质内容物，将移液器小心地从组织上提起，并迅速从溶液中移出移液管。
4. 使用1 mL注射器，用DEPC处理过的H ₂ O，从头架上快速移除移液器，然后冲洗移液器末端。通过紧密的管道将移液器连接到1 mL注射器以排出样品。
5. 立即将细胞排出到在0.2mL PCR管中的含有1％β-巯基乙醇的10μL裂解缓冲液1中。
   注意:细胞的全部吸出物应轻轻排出，以免引起气泡。
   1. 在2,000 xg的桌面微型离心机中将管子简单地离心10秒。立即在干冰上将样品快速冷冻5分钟。冷冻后，将其储存在-80°C最长达两周，以获得最佳效果;样品可能会持续更长时间，但建议尽可能快地进行处理。

e。> 5。RNA纯化（30分钟）

1. 在开始之前，通过将倒置的P20或P200尖端保持器的顶部贴在96孔磁性支架²³上来设置磁选机。
2. 准备新鲜的70％乙醇（EtOH） - 每个样品约1 mL即可。从4°C存储中取出RNA磁珠，并在室温下解冻至少30分钟。
   注意:一次应该处理不超过8个样品，本协议中的多个步骤依赖于效率和快速处理。
3. 一旦磁珠在室温下，旋转30秒，以确保溶液充分混合。
   注意:珠使用RNA特异性缓冲液选择性结合RNA，并且当使用磁性支架时，它们允许除去其他细胞废物。
4. 在室温下解冻细胞1分钟，然后向每个样品中加入5μL无RNA酶的H ₂ O;移液器上下移动。向每个管和移液管中加入22μLRNA珠e彻底混合在室温下孵育样品5分钟，使RNA与磁珠相互作用并结合。
5. 将管放在磁选机上放置8分钟;在进行前，确保上清液清澈。从一个颗粒观察珠粒，并确保在移液时不要将其分离。
6. 从样品中取出上清液，加入150μL70％EtOH。取出乙醇并重复洗涤两次。
7. 让样品风干6分钟。间歇检查，看看是否有更多的乙醇已经收集在管的底部。相应地删除它。
8. 当样品干燥时，通过将19μL裂解缓冲液2和1μLRNA酶抑制剂（40U /μL）组合，制备10X反应缓冲液。简单地旋转下来，保持在冰上。
9. 一旦样品干燥，珠粒不再具有光泽，从磁选机中取出管，并加入9.5μL无RNase的H ₂ O以再次水化样品。将样品放在冰上，并加入1μL10x反应缓冲液至每个样品。

反转录（10分钟）

注意:开始之前，在冰上解冻所需的逆转录试剂（RT，除了酶）。这些包括:引物II，缓冲液1，寡核苷酸和核糖核酸酶抑制剂。

1. 加入2μL引物II（AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT _（30） N _- N，其中N _-1可以是A，C或G，N可以是A，C，G或T;12μM）。将管放置在已经在72℃预热3分钟的热循环仪中。
2. 孵育期间，准备RT主混合物。对于每个反应，加入4μL缓冲液1（250mM Tris-HCl，pH 8.3; 375mM KCl;和30mM MgCl ₂ ），1μL寡核苷酸（48μM）和0.5μLRNA酶抑制剂（40U / μL）。
3. 孵化后立即放置管子冰2分钟
4. 每次反相转录酶（100 U /μL）每次反应加入主混合液中，并彻底移液。向每个管中加入7.5μL主混合物，轻轻移液混匀。简单旋转管子收集底部的内容物，并将它们放入预热的热循环仪中，其程序如下:42℃90分钟，70℃10分钟，保持在4℃。
5. 在继续操作之前，将管保存在-20°CO / N，尽管建议在长时间储存​​之前将样品放入放大步骤;其他来源表明在4°C的O / N储存也将在本步²⁴获得接受。

7. cDNA扩增（2.5h）

注意:开始之前，将PCR缓冲液和PCR引物在冰上融化，然后将其放入台式微型离心机中，然后再进行PCR主混合。

1. 对于每个反应，p重复PCR反应混合物，其中含有25μLPCR缓冲液，1μLPCR引物（12μM），1μLDNA聚合酶和3μL无核酸酶的H ₂ O.加入DNA聚合酶，最后加入的主混合样品。
2. 向每个管中加入30μL的主混合物，并以2,000 x g的速度旋转10秒，以收集管底部的物质。
3. 将管放置在预热的热循环仪中，程序如下:95℃1分钟; 34个循环，98℃10秒，65℃30秒，68℃3分钟; 72℃10分钟;并保持在4°C。
   注意:该PCR的循环次数已增加到34，与建议的制造商的说明不同。经过重复测试，发现这个循环次数一直是可靠的结果。
4. 将管子保存在-20°C长达一年，然后继续。

8.扩增cDN的纯化A（30分钟）

1. 开始纯化之前，将DNA珠和洗脱缓冲液置于室温至少30分钟。准备新鲜的80％乙醇;每个样品1 mL就足够了。向每个样品中加入1μL10X裂解缓冲液。
2. 涡旋DNA珠30秒，并添加50μLDNA珠每个样品。通过移液彻底混合，然后短暂地将它们以2,000xg旋转10秒。在室温下孵育管8分钟。
3. 将管置于磁选机上5分钟。将上清液上下移动两次，使样品静置2分钟。当样品在磁性设备上时，取出上清液并丢弃。
4. 向每个样品中加入新鲜制备的80％EtOH150μL，使其在室温下静置30秒。取出乙醇并重复EtOH洗涤一次。
5. 简单旋转样品并将其放回磁选机1分钟。取出任何剩余的EtOH，并让样品风干5分钟。
6. 间歇检查样品，查看是否已经收集了EtOH，并用移液器将其取出。
7. 一旦珠粒不再有光泽，但在裂纹开始出现之前，从磁选机中取出管，并加入17μL洗脱缓冲液。轻轻移液上下重新悬挂珠子。
8. 将再悬浮样品在室温下孵育2分钟。
9. 简单旋转样品以收集底部的所有液体并将其放在磁选机上2分钟。将15μL澄清的上清液转移到1.5 mL无RNA酶的管中，并将其储存在-20°C。
10. 使用1μLcDNA检测具有高灵敏度生物分析仪芯片的cDNA文库的质量和大小。 cDNA文库的理想尺寸为0.3-2K​​b，浓度至少为10ng /μL（ 图2 ）。
    注意:您可以选择使用PCR作为筛选样品的方法，以确保在进行样品前进行已知标记的表达eparation。

9.确定浓度和标记cDNA（20分钟）

1. 开始之前，将测定试剂，稀释缓冲液和标准品置于室温下30分钟。每次反应准备含有1μL测定试剂和199μL稀释缓冲液的主混合物。将等分试样将199μL该混合物加入到500μL测定管中。加入1μL样品并彻底混匀。
2. 将190μL主混合物等分至管1和2。将10μL标准品1加入管1和10μL标准品2加入管2中。将所有样品管和标准管旋转5秒;在室温下孵育3分钟。
3. 用高灵敏度荧光计测定样品的浓度。通过选择"计算库存解决方案"选项并突出显示"1μL"，确保已输入正确的样品量。将每个样品在不含RNase的H ₂ O中稀释到单独的1.5 mL管中，最终浓度为0.2 ng /μL。
   注意:而制造商的指示表明，应该以1 ng /μL的DNA总量开始，我们使用较小的起始量，并且还调整了该修订的议定书。
4. 在新的0.2 mL PCR管中，移液2.5μL缓冲液2.将1.25μLcDNA加入合适的管中，总共250 pg。最后，加入每个管中加入1.25μL的标签混合液，移液管彻底混匀;标记混合物内的转座酶将将DNA分成短链，并将衔接子退火至每条链的任一末端，供随后由测序仪使用。
   注意:用于标签和索引耦合的卷是制造商说明建议的量的一小部分。这不仅可以保护试剂，而且还可以在我们的经验中一直生产标签样品。
5. 将对照离心机上的管子离心1分钟。
6. 放管在具有以下程序的预热式热循环仪中:55℃10分钟并保持在10℃。
   注意:该孵育的时间为10分钟，而不是从制造商的说明书提出的5分钟。
7. 程序完成后立即取出试管，每个加入1.25μL标记中和缓冲液。移液好，混合并在室温下孵育5分钟。立即完成此步骤，因为转座酶保持活性，直到缓冲液中和酶并停止反应。

指数偶联和纯化（1小时）

注意:开始之前，将DNA珠和再悬浮缓冲液置于室温下至少30分钟。决定每个样品使用哪些指标。

注意:这些指数将附加到碎片DNA的相应5'和3'端，以便在测序后鉴定样品。确保没有两个对于可能一起排序的样品，配对是相同的。例如，如果样本1将使用指数白色1和橙色1，样本2应使用白色1和橙色2或白色2和橙色2，但从不相同的索引组合。该套件包含4个不同的白色和6个不同的橙色指数。所有不同的可能组合允许在一个测序通道中集合多达24个样品。虽然我们通常只在泳道中集合10个样品，但也可以使用包含24个指数的试剂盒，如果需要，可以在单个测序通道中汇集96个样品。

1. 对于每个管，添加1.25μL左侧索引和1.25μL正确的索引为该特定样品。加入3.75μLPCR主混合物和移液管，以进行混合。
2. 在台面微量离心机中离心1分钟。
3. 将管放置在预热的热循环仪中，程序如下:72℃3分钟; 95℃30秒; 95个循环76℃，10秒钟，50℃30秒，72℃1分钟; 72℃5分钟;并保持在4°C。
   注意:第95°C的步骤从98°C改变，这是制造商的指示。此外，调整循环细节，使得允许我们样品的最佳标记的温度和时间长度。最后的72℃孵育也被添加到我们的方案中，并不包括在制造商的说明书中。
4. 简单旋转管子收集底部的内容物。涡旋DNA珠30秒，然后向每个管中加入30μL，并通过移液彻底混合。
5. 在室温下孵育样品5分钟。
6. 将样品放在磁选机上2分钟。将上清液上下移动两次，孵育样品1分钟。
7. 取出并丢弃澄清的上清液。向每个样品中加入150μL的80％EtOH并除去。重复EtOH洗涤一次。
8. 允许the样品空气干燥10分钟。间歇检查以查看是否有任何乙醇已经收集在管的底部，并根据需要去除。
9. 一旦裂纹开始出现在DNA珠粒中，则从磁选机中取出样品，加入27.5μL的再悬浮缓冲液以使沉淀物再水化。确保沉淀完全重悬，然后在室温下孵育2分钟。
   注意:用于再悬浮缓冲液的体积进行了修改，以解释我们协议中起始材料的数量较少，并且与制造商说明书中的建议体积不同。
10. 将管放在磁选机上2分钟。将25μL澄清的上清液转移到无RNA酶的管中，并在-20°C储存。
    注意:不要继续遵循制造商的说明来完成库规范化。在该步骤后成功制备样品，并按原样进行测序。
11. 分析t使用生物分析仪对样品进行破坏，每个样品1μL。
    注意:涂抹分析将会像以前一样进行;然而，现在应该在0.2-1Kb的尺寸范围内检测cDNA（ 图3 ）。低于此点的涂片可能代表样品的降解，而较大的涂片表明不完整的标签。

11.样品汇集（10分钟）

1. 用早期的高灵敏度荧光计获得标记样品的浓度，并以nM计确定浓度。
   注意:该计算可以使用互联网转换工具计算，并且依赖于生物分析仪跟踪的平均片段长度。为了确定平均片段长度，分别观察每个样品的痕量，并确定平均DNA片段的大小。通过突出显示涂片的范围并检查生物分析仪的痕迹，也可以计算出这一点e程序计算的摩尔浓度。
2. 组合样品使得池中每个样品含有相同的浓度。不要稀释样品;该池应仅与最低浓度样品一样稀释，理想地具有至少15nM的总浓度。
3. 测序前将储存的样品储存在-20°C;建议样品在汇集后1周内进行测序。使用HiSeq平台进行配对末端，100 bp测序。

结果

细胞类型在染料注射后容易分类

图1显示荧光示踪剂填充之前和之后的GFP + RGC的实例。基于其在转基因品系中GFP的表达鉴定该细胞（ 图1A ）。在细胞的细胞上形成细小的拉丝玻璃电极的密封。为了表征亚型，将荧光染料注入到血浆中并允许填充所有相关的过程（ 图1B ）。通过观察，该细胞?...

讨论

我们的协议通过一个快速易用的指南，证明了一种方法，用于准备用于高质量测序的识别形态学类别的单个细胞，对样品几乎没有损伤。在本手稿中，本征感光性视网膜神经节细胞形态学表征，分离并制备用于RNA-Seq。细胞应激可能发生在视网膜处理过程中;因此，在使用不超过4小时之后，我们更换每块纸巾。我们可以通过使用电生理学装置从这些细胞记录并监测其反应来评估细胞的状态，这使得?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ames' Medium	Sigma Aldrich	A1420-10X1L
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S8875
K-gluconate	Spectrum Chemical	PO178
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758
Alexa Fluor 594 Hydrazide	Invitrogen	A10442
Collagenase	Worthington Biochemical	LS005273
Hyaluronidase	Worthington Biochemical	LS002592
Petri dish (35mm diameter)	Thermo Fisher Scientific	153066
Ophthalmologic scissors	Fine Science Tools	15000-00
#5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
Microplate Shaker	Fisher Scientific	13-687-708
Glass Micropipette	Sutter	BF120-69-10
Micropipette Puller	Sutter		P-1000 horizontal pipette puller
1mL syringe	Fisher Scientific	14-823-2F
Flexible tubing	Fisher Scientific	14-171
TCL lysis buffer	Qiagen	1031576	Lysis Buffer 1
β-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
RNase-Free Water	Qiagen	129112
0.2 ml PCR tubes	Eppendorf	30124359
Ethyl Alcohol, Pure	Sigma Aldrich	E7023	Ethanol
Analog Vortex Mixer	Thermo Fisher Scientific	02215365	Vortex
Mini Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	05-090-100
Agencourt RNAClean XP Beads	Beckman Coulter	A63987	RNA magnetic beads
MagnaBlot II Magnetic Separator	Promega	V8351	Magnetic stand
1.5 ml MCT Graduated Tubes	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit	Clontech	634888	Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification
10X Lysis Buffer			Lysis Buffer 2
5X Ultra Low First-Strand Buffer			Buffer 1
3' SMART-Seq CDS Primer II A			Primer II
SMART-Seq v4 Oligonucleotide			Oligonucleotide
SMARTScribe Rverse Transcriptase			Reverse Transcriptase
2X SeqAmp PCR Buffer			PCR Buffer
PCR Primer II A			PCR Primer
SeqAmp DNA Polymerase			DNA Polymerase
Mastercycler pro S	Eppendorf	950030020	Thermocycler
Agencourt AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63881	DNA magnetic beads
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939AA
HS Bioanalyzer Chips & Reagents	Agilent Technologies	5067-4626
Qubit HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	For the calculation of sample concentrations
Qubit Assay Tubes	Thermo Fisher Scientific	Q32856
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q32866
Nextera XT DNA Sample Preparation Kit	Illumina	FC-131-1024	Reagents for Tagmentation and Index Coupling
TD Buffer			Buffer 2
ATM			Tagmentation Mix
NT Buffer			Tagmentation Neutralizing Buffer
NPM			PCR Master Mix
Nextera XT Index Kit	Illumina	FC-131-1001	Indices for Tagmentation
N501			White 1
N502			White 2
N701			Orange 1
N702			Orange 2
HiSeq 2500	Illumina	SY-401-2501	For completing sequencing of samples