АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем комбинаторный подход для классификации типов нейронных клеток до выделения и для последующей характеристики одноклеточных транскриптомов. Этот протокол оптимизирует подготовку образцов для успешного секвенирования РНК (РНК-Seq) и описывает методологию, разработанную специально для углубленного понимания клеточного разнообразия.

Аннотация

Открытие маркеров, специфичных для типа клеток, может дать представление о клеточной функции и происхождении клеточной гетерогенности. С недавним толчком для лучшего понимания нейронного разнообразия важно идентифицировать гены, экспрессия которых определяет различные субпопуляции клеток. Сетчатка служит отличной моделью для исследования разницы в центральной нервной системе, так как она состоит из нескольких основных типов клеток. Изучение каждого крупного класса клеток дало генетические маркеры, которые облегчают идентификацию этих популяций. Однако в каждом из этих основных классов клеток сетчатки существуют многочисленные подтипы клеток, и лишь немногие из этих подтипов имеют известные генетические маркеры, хотя многие из них характеризуются морфологией или функцией. Знание генетических маркеров для индивидуальных подтипов сетчатки позволило бы изучать и отображать мозговые мишени, связанные со специфическими визуальными функциями, и также может давать представление о генных сетях, которыеПоддерживать клеточное разнообразие. Существующие способы идентификации генетических маркеров подтипов имеют недостатки, такие как классификация типов клеток после секвенирования. Это создает проблему для анализа данных и требует строгих методов проверки, чтобы гарантировать, что кластеры содержат ячейки одной и той же функции. Мы предлагаем метод идентификации морфологии и функциональности клетки до выделения и секвенирования, что позволит более легко идентифицировать маркеры, специфичные для подтипов. Этот метод может быть распространен на не-нейронные типы клеток, а также на редкие популяции клеток с незначительными вариациями. Этот протокол обеспечивает отличное качество данных, так как многие библиотеки обеспечивают глубину чтения более 20 миллионов считываний для отдельных ячеек. Эта методология преодолевает многие из препятствий, представленных одноячеечной РНК-Seq, и может быть подходящей для исследователей, стремящихся к профилированию типов клеток простым и высокоэффективным способом.

Введение

Разнообразие нейронов наблюдается во всей центральной нервной системе, особенно в сетчатке позвоночных, высокоспециализированной ткани, состоящей из 1 глиального и 6 типов нейронов, которые возникают из одной популяции клеток-предшественников сетчатки 1 , 2 , 3 . Многие подтипы клеток могут быть классифицированы функционально, морфологически и генетически. Цель этого протокола - связать генетическую изменчивость типов клеток с их идентифицируемыми функциональными и / или морфологическими характеристиками. Для классификации клеток было идентифицировано несколько генов, но многие подтипы продолжают оставаться нехарактеризованными, так как они представляют небольшую часть общей популяции. Идентификация генов в этих специфических подтипах позволит лучше понять разнообразие нейронов в сетчатке и может также пролить свет на диверсификацию нервных клеток в других местах. марихуанаБолее того, одноклеточные исследования позволяют выявлять новые типы клеток, которые, возможно, были упущены из-за их низкой представленности среди всего населения 4 , 5 , 6 , 7 .

Одно из преимуществ одноклеточной транскриптомии заключается в том, что можно обнаружить уникальные маркеры или комбинации маркеров, которые определяют конкретный клеточный подтип. Затем они могут быть использованы для получения генетического доступа к этому типу клеток для различных манипуляций. Например, мы используем этот протокол, чтобы охарактеризовать гены определенного типа клеток подмножества клеток сетчатки ганглия, которые экспрессируют фотопигмент меланопсин. Использование флуоресцентного маркера в меланопсин-экспрессирующих ганглиозных клетках сетчатки позволяет исследовать эти клетки, поскольку они сгруппированы вместе из-за их экспрессии известного гена. Интересно, что существует пять известных подтипов этой ячейки popuВ сетчатке мыши 8 . Таким образом, для выделения РНК из клеток каждого типа мы использовали установленные морфологические классификации в трансгенной модели для идентификации каждого подтипа до выделения клеток. Этот метод позволяет характеризовать клетки, а также их выделение непосредственно из сетчатки, без необходимости диссоциации тканей, что может вызвать стресс-реакцию внутри клеток и загрязнение из-за разъединенных дендритов 9 .

За последние несколько лет появилось множество новых методов, поскольку метод РНК-Seq продолжает развиваться. Эти инструменты позволяют добиться максимальной мобильности клеток и большей эффективности затрат при приближении к вопросу 4 , 7 , 10 , 11 , 12 , 13 . Однако, хотяЭти методы были отличными ступенями, существует ряд препятствий, которые все еще встречаются, с которыми этот протокол способен справиться. Во-первых, многие из нынешних процедур изолируют клетки от диссоциированной ткани и пытаются использовать либо основной компонентный анализ, либо иерархическую кластеризацию post-hoc для определения классификации клеток. Опираясь на эти инструменты для классификации подтипов, может не дать надежных результатов и может заставить искать новые способы проверки этих данных для корреляции генетического маркера с функциональным типом клетки. Требование диссоциации в других протоколах может иногда приводить к повреждению тканей и может приводить к отделению нейрональных процессов, что приводит к потенциальной потере мРНК. Кроме того, в диссоциированных клеточных препаратах стрессовые реакции могут начинать влиять на транскриптомы этих клеток 14 . Этот протокол преодолевает эти трудности, определяя тип функциональных клеток до изоляции, и он лучше поддерживает hЗа счет сохранения целостности ткани сетчатки.

Один метод был введен в 2014 году и состоял из анализа in vivo транскриптома живых клеток 15 . Хотя этот метод позволяет исследовать транскриптом с минимальным механическим разрушением ткани, ему не хватает способности классифицировать определенные типы клеток в ткани до исследования их транскриптомов без использования очень специфической мыши-репортера. Наш протокол не требует специального репортера, так как мы используем заполнение клеток и электрофизиологию для характеристики клеток перед их изоляцией. Другим ограничением этого предыдущего протокола является то, что он требует определенной длины волны для возбуждения фотоактивируемого элемента, тогда как наш протокол позволяет использовать флуоресцентный репортер и флуоресцентный краситель, которые легко доступны или могут быть выбраны каждой лабораторией индивидуально. Тем не менее, другие лаборатории вышли замуж заOphysiology и transcriptomics для изучения клеточного разнообразия. Использование патч-зажимных записей для характеристики функции клетки до ее изоляции было выполнено на диссоциированных нейронах 16, а в некоторых случаях предшествовало использование анализа микрочипов 17 для этих исследований. Этими подходами сталкиваются те же самые осложнения, поскольку они требуют диссоциации тканей или использования технологии микрочипов, которая основана на гибридизации образцов с доступными зондами. Одним из последних достижений является разработка Patch-Seq, метода, который сочетает использование патч-зажимных записей и технологию RNA-Seq для понимания клеток из цельных мозговых срезов 18 . Хотя этот метод имеет сходство с протоколом, представленным здесь, снова важно отметить, что наш подход позволяет ткани оставаться неповрежденным для здоровья клеток. Здесь мы представляем протокол для optimizatКоторый создает высококачественные одноячеечные библиотеки для использования РНК-Seq для получения высокой глубины считывания и покрытия карт.

протокол

Все процедуры были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованием (IACUC) в Северо-западном университете.

1. Подготовка растворов для электрофизиологии (4 ч)

  1. Сделайте 0,1% DEPC-обработанной H 2 O добавлением 1 мл диэтилпирокарбоната (DEPC) к 999 мл очищенного обратным осмосом H 2 O. Тщательно перемешайте и дайте смеси инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре (RT). Затем автоклавируют DEPC-смешанную H 2 O в течение 15 мин в жидком цикле. Дайте обработанному DEPC H 2 O охладиться при комнатной температуре.
  2. Сделайте внеклеточный раствор, смешав одну бутылку среды Эймса и 1,9 г (23 мМ) бикарбоната натрия в 1 л H 2 O. Пузырьком внеклеточный раствор с
    95% O 2 /5% CO 2 и поддерживать его при рН 7,3-7,4.
  3. Сформируйте внутриклеточный раствор, объединив 125 мМ K-глюконат, 2 мМ MgCl 2 , 10 мМ EGTA, 10 мМ HEPES и 0,1% DEPC-обработанный H2 О. Хранить в 1 мл аликвоты при -20 ° C. Добавьте 10 мкМ флуоресцентного индикатора в начале каждого эксперимента.
  4. Сделать раствор фермента, добавив 10000 единиц коллагеназы и 83 мг гиалуронидазы до 4,15 мл внеклеточного раствора. Раствор фермента следует хранить в 50 мкл аликвотах при -20 ° C.

2. Приготовление сетчатой ​​ткани (2 ч)

ПРИМЕЧАНИЕ. Все процедуры в этом разделе должны выполняться при тусклом освещении

  1. Адаптированные к темноте животные в течение, по крайней мере, 1 часа до вскрытия. Выполняйте все процедуры при тусклом освещении.
  2. Усыпите животных за счет угасания СО 2 и заклейте глазные яблоки в чашку Петри с предварительно обогащенным кислородом внеклеточным раствором.
  3. Проткните роговицу иглой и обрежьте ее, разрезая офтальмологическими ножницами на границе роговицы и склеры. 19 .
  4. Удалите объектив, используя# 5 щипцы. Аккуратно сделайте разрыв в склере с помощью щипцов и разъедините зрительный нерв, где встречаются сетчатка и склера. Тщательно закончите удаление склеры с сетчатки.
  5. Удалите прозрачную стекловидную камеру с помощью щипцов № 5; После удаления стекловидное тело появляется в виде студенистого вещества, прилипшего к щипцам. Разделите сетчатки пополам (так, чтобы было 4 части / животное) и сохраните их в насыщенном кислородом внеклеточном растворе при комнатной температуре до использования.
  6. Когда будете готовы к установке ткани в записывающей камере, поместите кусочек сетчатки для инкубации в растворе фермента, разведенном в 500 мкл насыщенного кислородом внеклеточного раствора. Инкубируйте в чашке Петри в течение 2 минут при комнатной температуре на шейкере.
    1. Вымойте кусочек сетчатки в насыщенном кислородом внеклеточном растворе и поместите ткань в камеру для записи со стеклянным дном; Используйте пластиковую пипетку для переноски с отрезанным наконечником, чтобы можно было переносить сетчатку без повреждения ткани.
  7. Использовать дляБелые грибы тщательно размять ткань слоем фоторецептора вниз. Удалите лишнюю жидкость с помощью пипетки. Закрепите ткань с помощью платинового кольца с нейлоновой сеткой.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Этот метод можно также использовать для получения ткани для выделения РНК из меченых амакриновых и биполярных клеток.
  8. Заполните камеру насыщенным кислородом внеклеточным раствором и установите его на подставку для микроскопа. Перфуза ткань с насыщенным кислородом внеклеточного раствора при 2-4 мл / мин.

3. Визуализация и нацеливание клеток GFP + сетчатки ганглия (10 мин)

ПРИМЕЧАНИЕ. Все процедуры в этом разделе должны выполняться при тусклом освещении

  1. Перед началом вытащите стеклянные микропипетки (OD: 1,2 мм, ID: 0,69 мм) для электрофизиологических записей с помощью съемника микропипетки. Используйте следующий протокол для электродов (обратите внимание, что параметры должны быть соответственно отрегулированы для достижения желаемого сопротивления и будутВарьируются между съемниками и с различным стеклом): Heat: Ramp +10; Pull: 0; Vel: 23; Задержка: 1; Давление: 500; Программный цикл: 5 раз. Убедитесь, что наконечники диаметром ~ 1 мкм, с сопротивлением 2-4 MОм для ориентации больших ячеек и 5-7 МОм для ориентации меньших ячеек.
  2. Наблюдайте за слоем ганглиозной ячейки с помощью инфракрасной дифференциальной контрастной интерференционной контрастности (IR-DIC) ( рис. 1A ). Определите GFP + клетки сетчатки сетчатки (RGCs), используя эпифлуоресценцию (~ 480 нм) ( Рисунок 1B ).
  3. Найдите пипетку, заполненную внутриклеточным раствором в DIC. Приложите небольшое положительное давление и обнулите любые смещения напряжения на усилителе.
  4. Надавите стеклянную микропипетку на ячейку GFP + и нанесите отрицательное давление, чтобы сформировать уплотнение GΩ между пипеткой и клеточной мембраной. Примените шаги команды испытательного напряжения ( например, 5 мВ), чтобы контролировать сопротивление уплотнения. После формирования устойчивого уплотнения разрывайте мембрану, применяя кратковременные импульсы nЧтобы получить доступ к целым клеткам.
  5. Подождите 1-2 мин, чтобы дендриты клетки заполнились флуоресцентным индикатором.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Клетку можно морфологически набрать, изучив морфологию эпифлуоресценции ( рис. 1С ). В случае РГК, экспрессирующих меланопсин, дендритная стратификация во внутреннем плексиформном слое визуализируется путем исследования дендритов, заполненных флуоресцентным индикатором при эпифлуоресцентном освещении, и определения того, насколько они стратифицируются вдали от сомы в ОТС-субламинах (M1 ipRGCs), вблизи ганглия Клеточного слоя в субшаминах ON (M2 и M4 ipRGCs) или обоих (M3 ipRGCs). Это наблюдение в сочетании с размером сомы (M4s имеют отчетливо большие сомы по сравнению со всеми другими подтипами ipRGC), позволяют идентифицировать тип клеток 20 , 21 , 22 . Таким образом, эта методика позволяет идентифицировать тип клеток in vitro перед изоамином РНКляционной. Этот метод может быть модифицирован для других протоколов идентификации типа клеток, включающих либо дендритную морфологию, либо клеточную физиологию.

4. Выделение клеток (2 мин)

  1. Перед началом установите настольную микроцентрифугу на 2000 г. Подготовьте аппарат для вытаскивания образца, подсоединив трубку (OD: 3/32 дюйма, ID: 1/32 дюйма) шприцем 1 см3.
  2. Поместите 0,2 мл пробирки для ПЦР, содержащие 10 мкл буфера для лизиса и 1% β-меркаптоэтанола на льду. Подготовьте 1 см3 шприц, содержащий DEPC-обработанный H 2 O, для ополаскивания наконечников пипеток. Подготовьте контейнер с сухим льдом для замораживания лизисного буфера после взятия пробы.
  3. Тщательно извлекайте содержание цитоплазмы в пипетке клеток, применяя отрицательное давление, используя шприц 10 мл; Все цитоплазматическое содержимое, включая органеллы, должно быть извлечено, если возможно.
    1. Контролируйте извлечение в DIC, визуализируя тело клетки, уменьшающееся в размере. После извлечения Содержимое цитоплазмы аккуратно вынимают пипетку из ткани и быстро удаляют пипетку из раствора.
  4. Быстро вытащите пипетку из держателя для головы и быстро промойте наконечник пипетки обработанным DEPC H 2 O, используя шприц 1 мл. Подключите пипетку к шприцу объемом 1 мл через герметичную трубку, чтобы удалить образец.
  5. Немедленно удалите клетки в 10 мкл буфера для лизиса 1, содержащего 1% β-меркаптоэтанола в 0,2 мл пробирках для ПЦР.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Весь аспират с клетками следует осторожно удалять, чтобы не вводить пузырьки.
    1. Кратко центрифугируют пробирку в настольной мини-центрифуге при 2000 xg в течение 10 с. Немедленно замораживать образцы в течение 5 мин на сухом льду. После замораживания храните их при -80 ° C в течение двух недель для достижения наилучших результатов; Образцы могут длиться дольше, но рекомендуется, чтобы они обрабатывались как можно быстрее.
E "> 5. Очистка РНК (30 мин)

  1. Прежде чем начать, установите магнитное сепараторное устройство, прикрепив верхнюю часть перевернутого держателя наконечника P20 или P200 к 96-луночному магнитному стенду 23 .
  2. Подготовьте свежий 70% этанол (EtOH) - приблизительно 1 мл на образец будет достаточным. Удалите магнитные шарики РНК из хранилища 4 ° C и оттаивайте их при комнатной температуре в течение как минимум 30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Одновременно должно обрабатываться не более 8 образцов, так как многие шаги в этом протоколе зависят от эффективности и быстрой обработки.
  3. Когда магнитные шарики находятся при комнатной температуре, встряхивают в течение 30 секунд, чтобы раствор хорошо перемешивался.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Бусины используют специфичный для РНК буфер для избирательного связывания РНК и позволяют удалять другие клеточные отходы при использовании с подставкой для магнитных пластин.
  4. Оттаивают клетки при комнатной температуре в течение 1 мин, а затем добавляют к каждому образцу 5 мкл Н 2 О без РНКазы; Пипеткой вверх и вниз. Добавьте 22 мкл РНК-гранул в каждую пробирку и пипеттE тщательно перемешать. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 5 мин, чтобы позволить РНК взаимодействовать и связываться с магнитными шариками.
  5. Поместите трубки на магнитный сепаратор и дайте им посидеть 8 минут; Перед тем как продолжить, убедитесь, что надосадочная жидкость чиста. Наблюдайте за шариками из одной гранулы и убедитесь, что не отсоединяете ее во время пипетирования.
  6. Удалите супернатант из образцов и добавьте 150 мкл 70% EtOH. Удалите EtOH и повторите промывку еще два раза.
  7. Дайте пробам высохнуть на воздухе в течение 6 мин. Периодически проверяйте, не собирается ли больше EtOH на дне пробирки. Удалите его соответствующим образом.
  8. Пока образцы сушат, готовят 10X реакционный буфер, объединяя 19 мкл буфера для лизиса 2 и 1 мкл ингибитора РНКазы (40 Ед / мкл). Кратко поверните его и держите на льду.
  9. После того как образцы сухие и гранулы шариков больше не выглядят глянцевыми, удалите пробирки из магнитного сепаратора и добавьте 9,5 мкл H 2 O, не содержащего РНКазыДля регидратации образцов. Поместите пробы на лед и добавьте 1 мкл 10-кратного реакционного буфера к каждому образцу.

6. Обратная транскрипция (10 мин)

ПРИМЕЧАНИЕ. Перед началом оттаивания необходимо использовать необходимые реагенты для обратной транскрипции (RT, за исключением фермента) на льду. К ним относятся: праймер II, буфер 1, олигонуклеотид и ингибитор РНКазы.

  1. В каждую пробирку добавить 2 мкл праймера II (AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT (30) N- 1 N, для которого N- 1 может быть A, C или G и N может быть A, C, G или T; 12 мкМ). Поместите пробирки в термоциклер, который был предварительно нагрет до 72 ° С в течение 3 мин.
  2. Во время инкубации подготовьте RT-мастер-микс. Для каждой реакции добавляют 4 мкл буфера 1 (250 мМ Трис-HCl, pH 8,3, 375 мМ KCl и 30 мМ MgCl 2 ), 1 мкл олигонуклеотида (48 мкМ) и 0,5 мкл ингибитора РНКазы (40 ед / мкл).
  3. Сразу же после инкубации установите трубки наЛед в течение 2 мин.
  4. Добавьте 2 мкл на каждую реакцию обратной транскриптазы (100 ЕД / мкл) в основную смесь и пипетку тщательно. Добавить 7,5 мкл мастер-смеси в каждую пробирку и перемешать путем осторожного пипетирования. Кратко прокрутите пробирки, чтобы собрать содержимое на дне и поместите их в предварительно нагретый термоциклер со следующей программой: 42 ° C в течение 90 минут, 70 ° C в течение 10 минут и трюм при 4 ° C.
  5. Перед тем, как продолжить, храните пробирки при температуре -20 ° СO / N, хотя рекомендуется хранить образцы на этапе амплификации перед хранением в течение длительных периодов времени; Другие источники предполагают, что хранение на складе при 4 ° С также будет приемлемым на этом этапе 24 .

7. Амплификация кДНК (2,5 ч)

ПРИМЕЧАНИЕ. Перед началом разморозки ПЦР-буфера и ПЦР-праймера на льду и откручивания пробирок на мини-центрифуге перед тем, как сделать основную смесь ПЦР.

  1. Для каждой реакции pПовторить основную смесь ПЦР, содержащую 25 мкл ПЦР-буфера, 1 мкл ПЦР-праймера (12 мкМ), 1 мкл ДНК-полимеразы и 3 мкл Н 2 О без нуклеазы. Добавить ДНК-полимеразу последним, непосредственно перед добавлением Мастер-микса к образцам.
  2. Добавить 30 мкл мастер-микса в каждую пробирку и вращать при 2000 х g в течение 10 с для сбора содержимого в нижней части пробирок.
  3. Поместите трубки в предварительно нагретый термоциклер со следующей программой: 95 ° C в течение 1 минуты; 34 цикла при 98 ° С в течение 10 с, 65 ° С в течение 30 с и 68 ° С в течение 3 мин; 72 ° С в течение 10 мин; И трюм при 4 ° C.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Число циклов для этой PCR было увеличено до 34, что отличается от инструкций, предложенных изготовителем. После повторного тестирования было обнаружено, что этот номер цикла дает стабильно надежные результаты.
  4. Перед продолжением храните пробирки при температуре -20 ° C в течение года.

8. Очистка амплифицированного cDNA (30 мин)

  1. Перед началом очистки доведите гранулы ДНК и элюирующий буфер до комнатной температуры в течение по крайней мере 30 мин. Подготовьте свежий 80% EtOH; 1 мл на образец должно быть достаточным. Добавьте 1 мкл буфера для лизиса 10Х к каждому образцу.
  2. Вихревой ДНК гранулы в течение 30 с и добавить 50 мкл ДНК-гранул для каждого образца. Тщательно перемешать с помощью пипетки, а затем кратко открутить их до 2000 xg в течение 10 с. Инкубируйте пробирки при комнатной температуре в течение 8 мин.
  3. Поместите трубки на магнитное разделительное устройство на 5 мин. Осторожно пипеткой супернатант вверх и вниз дважды и позволяют образцы сидеть в течение 2 мин. Пока образцы находятся на магнитном устройстве, удалите супернатант и выбросите.
  4. Добавьте к каждому образцу 150 мкл свежеприготовленного 80% EtOH и дайте им посидеть при комнатной температуре в течение 30 секунд. Удалите EtOH и повторите промывку EtOH один раз.
  5. Кратко открутите образцы и поместите их обратно на магнитный сепаратор на 1 мин. Удалите оставшийся EtOH и дайте пробы высохнуть на воздухе в течение 5 мин.
  6. Периодически проверяйте образцы, чтобы увидеть, собрался ли какой-либо EtOH, и удалите его с помощью пипетки.
  7. После того, как шарик гранул больше не выглядит глянцевым, но до появления трещин, снимите трубку с магнитного сепаратора и добавьте 17 мкл буфера для элюции. Мягко пипеткой вверх и вниз, чтобы ресуспендировать бисер полностью.
  8. Инкубируйте ресуспендированные образцы при комнатной температуре в течение 2 мин.
  9. Кратко поверните образцы, чтобы собрать всю жидкость на дне и поместите их на магнитный сепаратор на 2 мин. Перенесите 15 мкл прозрачного супернатанта в 1,5 мл пробирку без РНКазы и сохраните ее при -20 ° C.
  10. Изучите качество и размер библиотеки кДНК с помощью высокочувствительного чипа биоанализатора, используя 1 мкл кДНК. Идеальный размер библиотеки кДНК составляет 0,3-2 КБ, с концентрацией не менее 10 нг / мкл ( фиг. 2 ).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Вы можете использовать PCR в качестве способа отбора проб для обеспечения выражения известных маркеров, прежде чем приступать к тестированию preparation.

9. Определить концентрации и кДНК-метки (20 мин)

  1. Перед началом доведите аналитический реагент, буфер разбавления и стандарты до комнатной температуры в течение 30 мин. Подготовьте мастер-микс, содержащий 1 мкл реагента для анализа и 199 мкл буфера для разбавления на реакцию. Алиготе 199 мкл этой смеси в 500 мкл пробирки для анализа. Добавьте 1 мкл образца и тщательно перемешайте.
  2. Алиготе 190 мкл мастер-смеси к пробирке 1 и 2. Добавить 10 мкл стандарта 1 в пробирку 1 и 10 мкл стандарта 2 в пробирку 2. Встряхивать все пробирки и стандартные пробирки в течение 5 с; Инкубировать при комнатной температуре в течение 3 мин.
  3. Определить концентрацию образцов с помощью высокочувствительного флуорометра. Убедитесь, что введено правильное количество образца, выбрав опцию «Рассчитать исходное решение» и выделив «1 мкл». Разбавляют каждый образец в отдельной 1,5-миллилитровой пробирке до конечной концентрации 0,2 нг / мкл в H 2 O без РНКазы.
    ЗАМЕТКА:Принимая во внимание, что инструкции изготовителя предполагают, что следует начинать с 1 нг / мкл общего количества ДНК, мы использовали меньшую начальную сумму и также скорректировали протокол для учета этой поправки.
  4. В новых 0,2 мл пробирках для ПЦР пипеткой 2,5 мкл буфера 2. Добавьте 1,25 мкл кДНК в соответствующую пробирку в общей сложности 250 пг. Наконец, добавьте 1,25 мкл меченой смеси к каждой пробирке и пипеткой, тщательно перемешайте; Транспозаза внутри смеси меченых фрагментов ДНК в короткие нити и отжига адаптеров к любому концу каждой нити, для последующего использования инструментом секвенирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Объемы, используемые для связывания меток и индексов, составляют часть суммы, предложенной инструкциями изготовителя. Это не только позволяет сохранить реагенты, но также последовательно производит пробы с маркировкой в ​​нашем опыте.
  5. Центрифуга пробирки на столешнице микроцентрифуге в течение 1 мин.
  6. Поместите трубыВ предварительно нагретом термоциклере со следующей программой: 55 ° C в течение 10 минут и удержание при 10 ° C.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Длительность этой инкубации составляет 10 мин, в отличие от предложенных 5 мин. От инструкций изготовителя.
  7. Сразу после завершения этой программы удалите пробирки и добавьте по 1.25 мкл нейтрализующего буфера для мечения. Пипетку хорошо перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. Незамедлительно выполните этот шаг, так как транспозаза остается активной до тех пор, пока буфер не нейтрализует фермент и не прекратит реакцию.

10. Индексная связь и очистка (1 час)

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом, принесите бусы ДНК и буфер ресуспендирования к RT в течение как минимум 30 мин. Определите, какие индексы использовать для каждого из образцов.

ПРИМЕЧАНИЕ. Эти индексы будут прикреплены к соответствующим 5 'и 3' концам фрагментированной ДНК для идентификации образцов после секвенирования. Убедитесь, что нет двухСпаривание одинаково для образцов, которые могут быть секвенированы вместе. Например, если образец 1 будет использовать индексы белый 1 и оранжевый 1, образец 2 должен использовать белый 1 и оранжевый 2 или белый 2 и оранжевый 2, но никогда не ту же комбинацию индексов. Этот набор содержит 4 различных белых и 6 различных оранжевых индексов. Все различные возможные комбинации позволяют объединять до 24 выборок в одной последовательности последовательности. Хотя обычно мы собираем только 10 выборок на полосе, можно было бы также использовать набор, содержащий 24 индекса, что позволило бы при желании объединить 96 выборок в одну полосу секвенирования.

  1. В каждую пробирку добавить 1,25 мкл левого индекса и 1,25 мкл правого индекса для этого конкретного образца. Добавить 3,75 мкл ПЦР-смеси и пипетки хорошо перемешать.
  2. Центрифуга в настольной микроцентрифуге в течение 1 мин.
  3. Поместите пробирки в предварительно нагретый термоциклер со следующей программой: 72 ° C в течение 3 минут; 95 ° С в течение 30 с; 12 циклов по 9576 ° С в течение 10 с, 50 ​​° С в течение 30 с и 72 ° С в течение 1 мин; 72 ° С в течение 5 мин; И трюм при 4 ° C.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Первый шаг 95 ° C был изменен с 98 ° C, что было предложено инструкциями изготовителя. Кроме того, детали цикла были скорректированы таким образом, что температуры и длительности времени позволяли оптимальную маркировку наших образцов. Окончательная инкубация при 72 ° C была также добавлена ​​к нашему протоколу и не была включена в инструкции изготовителя.
  4. Кратко вращайте трубы, чтобы собрать содержимое снизу. Вихревой ДНК гранулы в течение 30 с, а затем добавить 30 мкл в каждую пробирку и тщательно перемешать с помощью пипетки.
  5. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 5 мин.
  6. Поместите образцы на магнитный сепаратор в течение 2 мин. Внесите супернатант дважды вверх и вниз и инкубируйте образцы в течение 1 мин.
  7. Удалите и выбросьте прозрачный супернатант. Добавить 150 мкл 80% EtOH к каждому образцу и удалить. Повторите промывку EtOH один раз.
  8. Разрешить thЕ образцы для сушки на воздухе в течение 10 мин. Периодически проверяйте, не собрался ли какой-либо EtOH в нижней части пробирок и при необходимости удалите.
  9. Как только трещина начинает появляться в грануле ДНК-шарика, удалите пробу из магнитного сепаратора и добавьте 27,5 мкл буфера для суспендирования суспензии для регидратации осадка. Убедитесь, что таблетка полностью ресуспендирована, а затем инкубируйте при комнатной температуре в течение 2 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Громкость, используемая для буфера ресуспендирования, была изменена с учетом меньшего количества исходного материала в нашем протоколе и отличается от предложенного объема в инструкциях производителя.
  10. Поместите трубки на магнитный сепаратор на 2 мин. Передайте 25 мкл прозрачного супернатанта в пробирку без РНКазы и храните при -20 ° C.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Не выполняйте инструкции производителя, чтобы завершить нормализацию библиотеки. Образцы успешно готовятся после этого шага и готовятся к секвенированию как есть.
  11. Проанализируйте tАгментация образцов с использованием чипа биоанализатора и 1 мкл каждого образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: анализ мазков будет проводиться как раньше; Однако, кДНК должна теперь обнаруживаться в диапазоне размеров 0,2-1 Кб ( рис. 3 ). Мазки ниже этой точки, вероятно, представляют собой деградацию образцов, в то время как большие мазки указывают на неполную маркировку.

11. Объединение образцов (10 мин)

  1. Получить концентрации образцов мечения с помощью высокочувствительного флюорометра из ранее и определить концентрацию в нМ.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Этот расчет может быть рассчитан с использованием инструмента интернет-конверсии и зависит от средней длины фрагмента от трассировки биоанализатора. Чтобы определить среднюю длину фрагмента, наблюдайте трассу для каждого образца в отдельности и определите размер среднего фрагмента ДНК. Это также можно рассчитать при анализе следа биоанализатора, выделив диапазон мазка и исследуяРассчитанная по программе.
  2. Объединяйте образцы таким образом, чтобы в пуле содержалась одинаковая концентрация каждого образца. Не разбавлять образцы; Пул должен быть только разбавленным, как образец с наименьшей концентрацией, и в идеале должен иметь общую концентрацию по меньшей мере 15 нМ.
  3. Храните собранные образцы при -20 ° C перед секвенированием; Предполагается, что образцы подвергаются секвенированию в течение 1 недели после объединения. Выполнение парного конца, 100 bp sequencing с помощью платформы HiSeq.

Результаты

Типы клеток легко классифицируются после введения красителя

На рисунке 1 показан пример GFP + RGC до и после заполнения флуоресцентными индикаторами. Эта клетка была идентифицирована на основе ее экспрессии GFP в трансгенной линии...

Обсуждение

Наш протокол демонстрирует с помощью быстрого и простого в использовании руководства метод подготовки отдельных клеток определенных морфологических классов для высококачественного секвенирования с небольшим ущербом для образца. В настоящей рукописи, собственно фоточувствительны?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы выразить благодарность Дженнифер Баир и Эйнату Снир, а также Институту Генетики Университета Айовы за их помощь в подготовке и обработке образцов.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Ames' MediumSigma AldrichA1420-10X1L
Sodium BicarbonateSigma AldrichS8875
K-gluconateSpectrum ChemicalPO178
EGTASigma AldrichE4378
HEPESSigma AldrichH3375
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)Sigma AldrichD5758
Alexa Fluor 594 HydrazideInvitrogenA10442
CollagenaseWorthington Biochemical LS005273
HyaluronidaseWorthington Biochemical LS002592
Petri dish (35mm diameter)Thermo Fisher Scientific153066
Ophthalmologic scissorsFine Science Tools15000-00
#5 ForcepsFine Science Tools11252-30
Microplate ShakerFisher Scientific13-687-708
Glass MicropipetteSutterBF120-69-10
Micropipette PullerSutterP-1000 horizontal pipette puller
1mL syringeFisher Scientific14-823-2F
Flexible tubingFisher Scientific14-171
TCL lysis bufferQiagen1031576Lysis Buffer 1
β-mercaptoethanolSigma AldrichM3148
RNase-Free WaterQiagen129112
0.2 ml PCR tubesEppendorf30124359
Ethyl Alcohol, PureSigma AldrichE7023Ethanol
Analog Vortex MixerThermo Fisher Scientific02215365Vortex
Mini CentrifugeThermo Fisher Scientific05-090-100
Agencourt RNAClean XP BeadsBeckman CoulterA63987RNA magnetic beads
MagnaBlot II Magnetic SeparatorPromegaV8351Magnetic stand
1.5 ml MCT Graduated TubesThermo Fisher Scientific05-408-129
Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA KitClontech634888Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification
10X Lysis BufferLysis Buffer 2
5X Ultra Low First-Strand BufferBuffer 1
3' SMART-Seq CDS Primer II APrimer II
SMART-Seq v4 OligonucleotideOligonucleotide
SMARTScribe Rverse TranscriptaseReverse Transcriptase
2X SeqAmp PCR BufferPCR Buffer
PCR Primer II APCR Primer
SeqAmp DNA PolymeraseDNA Polymerase
Mastercycler pro SEppendorf950030020Thermocycler
Agencourt AMPure XP BeadsBeckman CoulterA63881DNA magnetic beads
2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939AA
HS Bioanalyzer Chips & ReagentsAgilent Technologies5067-4626
Qubit HS Assay KitThermo Fisher ScientificQ32851For the calculation of sample concentrations
Qubit Assay TubesThermo Fisher ScientificQ32856
Qubit 2.0 FluorometerThermo Fisher ScientificQ32866
Nextera XT DNA Sample Preparation KitIlluminaFC-131-1024Reagents for Tagmentation and Index Coupling
TD BufferBuffer 2
ATMTagmentation Mix
NT BufferTagmentation Neutralizing Buffer
NPMPCR Master Mix
Nextera XT Index KitIlluminaFC-131-1001Indices for Tagmentation
N501White 1
N502White 2
N701Orange 1
N702Orange 2
HiSeq 2500IlluminaSY-401-2501For completing sequencing of samples

Ссылки

  1. Austin, C., Cepko, C. L. Specification of Cell Fate in the Vertebrate Retina. Neural Cell Specif. 3, 139-143 (1995).
  2. Masland, R. H. The Neuronal Organization of the Retina. Neuron. 76 (2), 266-280 (2012).
  3. Rodieck, R. . The First Steps in Seeing. , (1998).
  4. Chiu, I. M., et al. Transcriptional profiling at whole population and single cell levels reveals somatosensory neuron molecular diversity. Elife. 3, e04660 (2014).
  5. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nat. Neurosci. 19 (2), 335-346 (2016).
  6. Trapnell, C. Defining cell types and states with single-cell genomics. Genome Res. 25 (10), 1491-1498 (2015).
  7. Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
  8. Schmidt, T. M., Do, M. T. H., Dacey, D., Lucas, R., Hattar, S., Matynia, A. Melanopsin-Positive Intrinsically Photosensitive Retinal Ganglion Cells: From Form to Function. J. Neurosci. 31 (45), 16094-16101 (2011).
  9. Eberwine, J., Miyashiro, K., Kacharmina, J. E., Job, C. Local translation of classes of mRNAs that are targeted to neuronal dendrites. Proc. Natl. Acad. Sci. 98 (13), 7080-7085 (2001).
  10. Darmanis, S., et al. A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level. Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (23), 7285-7290 (2015).
  11. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  12. Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat. Neurosci. 18 (1), 145-153 (2015).
  13. Poulin, J. F., Zou, J., Drouin-Ouellet, J., Kim, K. Y. A., Cicchetti, F., Awatramani, R. B. Defining midbrain dopaminergic neuron diversity by single-cell gene expression profiling. Cell. Rep. 9 (3), 930-943 (2014).
  14. Gross, A., Schoendube, J., Zimmermann, S., Steeb, M., Zengerle, R., Koltay, P. Technologies for Single-Cell Isolation. Int. J. Mol. Sci. 16, 16897-16919 (2015).
  15. Lovatt, D., et al. Transcriptome in vivo analysis (TIVA) of spatially defined single cells in live tissue. Nat Methods. 11 (2), 190-196 (2014).
  16. Qiu, S., et al. Single-neuron RNA-Seq: Technical feasibility and reproducibility. Front. Genet. 3 (124), 1-8 (2012).
  17. Subkhankulova, T., Yano, K., Robinson, H. P. C., Livesey, F. J. Grouping and classifying electrophysiologically-defined classes of neocortical neurons by single cell, whole-genome expression profiling. Front. Mol. Neurosci. 3 (10), 1-11 (2010).
  18. Fuzik, J., et al. Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes. Nat. Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).
  19. Schmidt, T. M., Kofuji, P. An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells. J. Vis. Exp. (47), e2367 (2011).
  20. Schmidt, T. M., Kofuji, P. Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells. J Neurosci. 29 (2), 476-482 (2009).
  21. Schmidt, T. M., Kofuji, P. Structure and Function of Bistratified Intrinsically Photosensitive Retinal Ganglion Cells in the Mouse. J Comp Neurol. 519 (8), 1492-1504 (2011).
  22. Schmidt, T. M., Kofuji, P. Differential cone pathway influence on intrinsically photosensitive retinal ganglion cell subtypes. J Neurosci. 30 (48), 16262-16271 (2010).
  23. Clontech Laboratories I. . SMARTerTM Ultra Low RNA Kit for Illumina® Sequencing. , (2013).
  24. Trombetta, J. J., Gennert, D., Lu, D., Satija, R., Shalek, A. K., Regev, A. Preparation of single-cell RNA-Seq libraries for next generation sequencing. Curr. Protoc. Mol. Biol. 4 (22), 1-17 (2014).
  25. Ecker, J. L., et al. Melanopsin-expressing retinal ganglion-cell photoreceptors: Cellular diversity and role in pattern vision. Neuron. 67 (1), 49-60 (2010).
  26. Schmidt, T. M., et al. A Role for Melanopsin in Alpha Retinal Ganglion Cells and Contrast Detection. Neuron. 82 (4), 781-788 (2014).
  27. Sanes, J. R., Masland, R. H. The Types of Retinal Ganglion Cells: Current Status and Implications for Neuronal Classification. Annu. Rev. Neurosci. 38, 221-246 (2014).
  28. Goetz, J. J., Trimarchi, J. M. Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons. J. Vis. Exp. , e3824 (2012).
  29. Trimarchi, J. M., et al. Molecular Heterogeneity of Developing Retinal Ganglion and Amacrine Cells Revealed through Single Cell Gene Expression Profiling. J. Comp. Neurol. 502, 1047-1065 (2007).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Neuroscience

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены