JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الطريقة المعروضة هنا يصف قابلة للوالممارسات التصنيعية الجيدة (GMP) -ready نظام المفاضلة لتوليد مثل الكبدية الخلايا البشرية من الخلايا الجذعية المحفزة. وهو بمثابة نظام فعالة من حيث التكلفة وموحدة لتوليد مثل الكبدية الخلايا البشرية للبحث كبد الإنسان الأساسية والتطبيقية.

Abstract

الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) تمتلك قيمة كبيرة لبحوث الطب الحيوي. hPSCs يمكن تحجيمها ومتباينة لجميع أنواع الخلايا الموجودة في جسم الإنسان. وقد درس على نطاق واسع تمايز hPSCs إلى خلايا تشبه خلايا الكبد البشرية (ثوابت قانون هنري هي)، وأنشئت بروتوكولات التمايز فعالة. جعلت مجموعة من المصفوفة خارج الخلية والمحفزات البيولوجية، بما في ذلك عوامل النمو، السيتوكينات، والجزيئات الصغيرة، من الممكن لتوليد ثوابت قانون هنري هي التي تشبه خلايا الكبد البشرية الأساسية. ومع ذلك، فإن معظم الإجراءات لا تزال تستخدم مكونات غير محددة، مما أدى إلى تباين دفعة إلى دفعة. وهذا بمثابة عائقا كبيرا أمام تطبيق هذه التكنولوجيا. لمعالجة هذه القضية، قمنا بتطوير نظام محدد للتمايز الكبدية باستخدام laminins البشرية المؤتلفة كما مصفوفات خارج الخلية في توليفة مع عملية التمايز خالية من المصل. غاية وقد تحقق كفاءة مواصفات الكبدية، مع ديmonstrated إدخال تحسينات على كل وظيفة HLC والنمط الظاهري. الأهم من ذلك، هذا النظام سهل لزيادة استخدام البحث وGMP الصف خطوط hPSC التقدم واعدة في مجال النمذجة خلية القاعدة والعلاجات.

Introduction

وتستخدم الأنسجة البشرية الأساسية وأنواع الخلايا المشتقة بانتظام، سواء بالنسبة للفحص خلية القاعدة وفي العيادة. ومع ذلك، والحصول على هذه الخلايا ومحدودة للغاية بسبب عدم كفاية التبرع بالأعضاء وفقدان الظواهر الخلايا بعد العزلة 1. تمثل hPSCs بديلا واعدا للأنسجة الأساسية وتسهيل جيل من الخلايا الجسدية البشرية المحددة وراثيا والمتجددة. وقد أظهرت مثل الكبدية الخلايا (ثوابت قانون هنري هي) المستمدة من hPSCs بالفعل وعد في هذا المجال. ثوابت قانون هنري هي تشبه خلايا الكبد البشرية الأساسية في مختلف الجوانب، بما في ذلك شكل الخلية، التعبير الجيني الكبدية، وظيفة التمثيل الغذائي، والحساسية للأدوية والفيروسات 2، 3، 4، 5، 6، 7، 8. وبالإضافة إلى ذلك، وانتشار غير محدود وقدرة التجديد الذاتي لكلا hPSCs البحوث وGMP الصف يسهل تطبيقها 9 و 10.

وقد أنتجت أكثر من عشر سنوات من الأبحاث على عدد من الإجراءات تمايز الكبدية كفاءة 2، 3، 5، 11، 12، 13، 14، 15، 16، 17، 18، 19، 20. ومع ذلك، فإن معظم هذه النظم تستخدم مكونات غير محددة و / أو تنبيغ الفيروسية لدفع مواصفات الخلايا الكبدية. لتحسين موثوقية التكنولوجيا على نطاق واسع، فمن المهم وضع تمايز الكبدية قويالنظام الذي يعرف حقا، خالية من XENO، وبرنامج الرصد العالمي متوافق.

Laminins (LNS) هي مهمة البروتينات المصفوفة خارج الخلية التي يمكن أن تؤثر على التصاق الخلايا وانتشار، والهجرة، والتمايز. Laminins هي بروتينات سكرية heterotrimeric تتألف من α واحد، β واحدة، وسلسلة γ واحد. في الآونة الأخيرة، وقد تم إنتاج laminins الإنسان المؤتلف واستخدامها في بيولوجيا الخلية. وقد تبين LN-511 لدعم صيانة hPSCs 21، في حين خليط من LN-521 و E-كادهيرين يسمح الاشتقاق نسيلي وتوسيع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية 22. LN-111، من ناحية أخرى، ويدعم الحفاظ على خلايا تشبه أرومة كبدية المستمدة من hPSCs 23. ومع ذلك، قبل تقريرنا، laminins 521 و 111 لم تستخدم لتوليد ثوابت قانون هنري هي ذات الخصائص ناضجة من hPSCs 10.

هنا، نحن الإجراءات التفاصيل لزراعة hPSCs على LN-521والتفريق بينها على أي LN-521 أو مزيج من LN-521 و LN-111 (LN-521 / LN-111). نحن الأمثل بروتوكول التمايز باستخدام البذر وحيدة الخلية لتوليد أحادي الطبقة استنساخه للغاية ومتجانسة من ثوابت قانون هنري هي في العديد من الأشكال (14). ونحن نعتقد أن لدينا نظام المفاضلة المحددة يمثل طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لتصنيع ثوابت قانون هنري هي النشطة للتطبيق، وهو ما يمثل خطوة هامة إلى الأمام في هذا المجال.

Protocol

وقد ادرج معلومات المورد لجميع الكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول في الجدول رقم 1: ملاحظة. يجب أن تكون جميع وسائل الإعلام / لوحات معقم، وعلى الأقل في درجة حرارة الغرفة عندما الخلايا لديها اتصال مباشر معهم.

1. الخلايا الجذعية متعددة القدرات الركض الإنسان (hPSCs) على Laminin 521

ملاحظة: ويستند هذا الإجراء خلية الركض هو موضح أدناه على الخلايا وحيدة، ويعتبر مثاليا لاشتقاق من السكان متجانسة من الخلايا مثل خلايا الكبد من hPSCs. مستعمرة الطلاء ينطبق أيضا وصفت سابقا 24.

  1. إعداد لوحات المغلفة laminin حسب الحاجة.
    1. ذوبان الجليد في 100 ميكروغرام الأسهم / مل من laminin المؤتلف 521 (LN-521) في 4 درجات مئوية.
    2. تمييع إذابة LN-521 في الجليد الباردة 1X DPBS (مع الكالسيوم 2+ / المغنيسيوم 2+) لجعل / مل من محلول 5 ميكروغرام.
    3. إضافة 1 مل من 5 ميكروغرام / مل LN-521 حل لمعطف بئر واحدة من لوحة 6 جيداوالصخور تنتشر بشكل متساو في البئر.
    4. احتضان لوحات في 37 ° C / 5٪ CO 2 خلية حاضنة للثقافة 2-4 ساعة للاستخدام العاجل أو في 4 درجات مئوية الثلاجة بين عشية وضحاها.
    5. تخزين لوحات المغلفة laminin في 4 درجات مئوية الثلاجة كما هو مطلوب. حافظ على لوحات على سطح مستو وختم لهم لتجنب التبخر وتلوث.
      ملاحظة: لا تدع الآبار المغلفة تجف. أعلى لهم حتى مع إضافية 1X DPBS (مع الكالسيوم 2+ / المغنيسيوم 2+) إذا لزم الأمر. استخدام لوحات في حدود 2 أسابيع.
  2. السماح للعدد المطلوب من لوحات قبل المغلفة للوصول إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام أو احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة 0،5-1 ساعة.
  3. نضح بعناية طلاء LN-521 حل دون الإضرار السطح المطلي. ملاحظة: فمن الأهمية بمكان عدم تلف السطح المطلي قبل البذر الخلايا على ذلك.
  4. على الفور إضافة 1 مل من قبل تحسنت mTeSR1 المتوسطة تستكمل مع كيناز المرتبطة رو 10 ميكرومتر (ROCK) المانع Y27632 إلى بئر واحدة من لوحة 6 جيدا. ترك لوحة في حاضنة الثقافة خلية لاستقبال الخلايا.
    ملاحظة: لا تسمح أبدا الآبار المغلفة laminin لتجف.
  5. نضح في المتوسط ​​من hPSCs الواقعات في حوالي 75٪ إلى 85٪ confluency. غسل الخلايا من بئر واحدة من لوحة 6 جيدا مرة واحدة مع 1 مل من درجة حرارة الغرفة 1X DPBS (لا كا 2+ / المغنيسيوم 2+).
  6. إضافة 0.5 مل من 1X Accutase إلى الخلايا واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 6-8 دقيقة لفصل الخلايا.
    ملاحظة: للتحقق ما إذا كانت عملية الهضم طويل بما فيه الكفاية أم لا، اضغط بلطف لوحة وتحقق ما إذا كانت الخلايا يمكن فصل بسهولة. إذا كانت الإجابة بنعم، ثم حان الوقت لوقف التفاعل الأنزيمي. إذا لم يكن كذلك، تمديد عملية الهضم لالاضافي 1-2 دقيقة.
  7. إنهاء التفكك بإضافة 2 مل من المتوسط ​​mTeSR1 جديدة تستكمل مع 10 ميكرومتر Y27632 إلى الخلايا. ماصة صعودا وهبوطا باستخدام طرف P1000 عدة مرات لجعل التعليق وحيدة الخلية.
  8. عد خلايا قابلة للحياة باستخدام عدادة الكريات.استخدام التريبان الأزرق إلى وصمة عار واستبعاد الخلايا الميتة 14
  9. حساب عدد الخلايا اللازمة. لالروتيني الركض hPSC، البذور 4 × 5-5 أكتوبر × 10 5 خلايا لكل بئر من لوحة 6 جيدا (أي 4.21 × 10 4 حتي 5،26 × 10 4 لكل سم 2). لالركض hPSCs للتمايز الكبدية، البذور 6.5 × 10 5-7،5 × 10 5 (أي 6.84 × 10 4 حتي 7،89 × 10 4 لكل سم 2) خلايا لكل بئر من لوحة 6 جيدا.
    ملاحظة: كثافة البذر لكل خط الخلية قد تحتاج الأمثل طفيفة على أساس كثافة التجريبية المعطاة هنا للتمايز الكبدية.
  10. نقل تعليق خلية يحتاج إلى العقيمة 15 مل أو 50 مل أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 115 x ج لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  11. نضح طاف ببطء ثم resuspend الكرية خلية في الطازجة والمتوسطة mTeSR1 الدافئة تستكمل مع كيناز المرتبطة رو 10 ميكرومتر (ROCK) inhibitoص Y27632، وذلك باستخدام متوسطة كافية لجعل كثافة الخلايا المطلوبة.
    ملاحظة: استخدام مثبط ROCK ينصح بشدة من أجل تعزيز مرفق الخلية ومعدل البقاء على قيد الحياة.
  12. البذور الخلايا إلى لوحات مستعدة والصخور لهم ذهابا وإيابا، وجنبا إلى جنب لتوزيعها بالتساوي الخلايا.
    ملاحظة: فمن الأهمية بمكان لضمان أن يتم توزيعها بالتساوي الخلايا في الآبار ما إذا كانت لوحة هي لزراعة الخلايا الروتينية أو التجريب الكبدية التمايز.
  13. وضع لوحات في الحاضنة الخلايا والحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة للسماح لهم نعلق والتعافي.
  14. فحص الخلايا في اليوم التالي وسحب ROCK المانع إذا تم إنشاء خلية خلية الاتصال. الحفاظ على الخلايا في mTeSR1 المتوسطة للثقافة الروتينية أو التبديل إلى متوسطة التمايز حسب الحاجة.
    ملاحظة: إذا كان المصنف الخلايا مع كثافة المذكورة، ينبغي أن يكون confluency المثالي للصيانة الروتينية أو التمايز الكبديةن.

2. التفريق hPSCs إلى خلايا تشبه الكبدية على المؤتلف Laminins

  1. إعداد المتوسطة التمايز.
    1. جعل Activin حل الأسهم البشري: حل Activin البشري مسحوق لجعل / مل محلول المخزون 100 ميكروغرام في معقم 0.2٪ زلال المصل البقري (BSA) / DPBS. جعل قسامات الصغيرة وتخزينها في -20 درجة مئوية. استخدام في 1: 1000.
    2. جعل الماوس WNT حل الأسهم 3A: حل الماوس WNT مسحوق 3A لجعل / مل محلول المخزون 10 ميكروغرام في معقم 0.2٪ BSA / DPBS. جعل قسامات الصغيرة وتخزينها في -20 درجة مئوية. استخدام في 1: 200.
    3. جعل عامل النمو الكبدية البشرية (HGF) حل الأسهم: حل مسحوق HGF البشري لجعل / مل محلول المخزون 10 ميكروغرام في معقم 0.2٪ BSA / DPBS. جعل قسامات الصغيرة وتخزينها في -20 درجة مئوية. استخدام في 1: 1000.
    4. جعل Oncostatin M (OSM) حل الأسهم: حل Oncostatin M (OSM) مسحوق لجعل / مل محلول المخزون 20 ميكروغرام في معقم 0.2٪ BSA / DPBS. جعل قسامات الصغيرة والصورةمزق لهم في -20 درجة مئوية. استخدام في 1: 1000.
    5. جعل 500 مل من فتيلة الأديم الأسهم المتوسطة: 2٪ ملحق B27 (50X، ناقص فيتامين (أ)) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (تركيزات النهائي في 100 وحدة دولية / مل و 100 ميكروغرام / مل على التوالي). أعلى ما يصل الى 500 مل باستخدام روزويل معهد الحديقة التذكارية 1640 (RPMI 1640) متوسطة القاعدية. ملاحظة: تخزين المخزون في 4 درجات مئوية وتستخدم في غضون أسبوعين. متوسطة قسامة من المخزون وإضافة Activin ألف وWNT 3A (تركيزات النهائي في 100 نانوغرام / مل و 50 نانوغرام / مل، على التوالي) جديدة عند كل تغيير المتوسط.
    6. جعل 500 مل من KSR / DMSO التمايز المتوسطة: 80٪ خروج المغلوب DMEM (KO-DMEM)، و 20٪ استبدال خروج المغلوب المصل (KSR)، 0.5٪ GlutaMAX، 1٪ الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA)، 0.1 ملي بيتا المركابتويثانول، 1٪ DMSO، و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (تركيزات النهائي في 100 وحدة دولية / مل و 100 ميكروغرام / مل على التوالي). ابحث في ظل فراغ. تخزينها في 4 درجة مئوية وتستخدم في غضون أسبوعين.
    7. جعل 500 مل من HepatoZYME نضوج المتوسطة: 1٪ جليليutaMAX، 10 ميكرومتر الهيدروكورتيزون 21 hemisuccinate ملح الصوديوم (HCC)، و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (تركيزات النهائي في 100 وحدة دولية / مل و 100 ميكروغرام / مل على التوالي). أعلى ما يصل الى 500 مل باستخدام HepatoZYME المتوسطة القاعدية. ملاحظة: تخزين المخزون في 4 درجات مئوية وتستخدم في غضون أسبوعين. متوسطة قسامة من المخزون وإضافة HGF الطازجة وOSM (تركيزات النهائي في 10 نانوغرام / مل و 20 نانوغرام / مل، على التوالي) لكل تغيير المتوسطة.
  2. hPSCs البذور للتمايز الكبدية على LN-521، كما هو موضح في القسم 1. إذا LN-521 / LN-111 هو لاستخدامها الركيزة، ومعطف لوحات مع LN-521 و LN-111 (بنسبة 1: 3) في تركيز laminin النهائي من 5 ميكروغرام / مل. يجب أن يكون العلاج بقية نفس وحات مغلفة LN-521-نقية.
    ملاحظة: LN-521 / LN-111 ليست مثالية للثقافة الروتينية للhPSCs. يتم استخدامه فقط للتجارب التمايز.
  3. تحقق من confluency الخلية بعد 24 ساعة من البذر. الشروع في تمايز الخلايا مرة واحدة تصل إلى confluency خلية حوالي 40٪. Remove المتوسط ​​mTeSR1 المستهلك وإضافة جديدة المتوسطة فتيلة الأديم تستكمل مع 100 نانوغرام / مل Activin ألف و50 نانوغرام / مل WNT 3A. نسمي هذا التمايز يوم 1.
    ملاحظة: من المستحسن بشدة للشروع في التمايز اليوم بعد البذر الخلايا.
  4. تغيير المتوسطة فتيلة الأديم كل 24 ساعة لمدة 3 أيام للخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs). أما بالنسبة لفعل الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs)، تمديد هذه المرحلة لمدة 2 ايام اخرى لرئيس الوزراء الخلايا إلى خلايا تشبه الأديم نهائية، ولكن استخدام المتوسطة فتيلة الأديم تستكمل فقط مع 100 نانوغرام / مل Activin ألف لهذين اليومين 12 .
    ملاحظة: لضمان مواصفات الأديم ناجحة، يمكن للمرء أن دراسة التعبير عن علامات الأديم الباطن، مثل FOXA2 وSOX17. وفقا لتلطيخ المناعي، أكثر من 80٪ من الخلايا المشتقة إيجابية لكلا علامات في مختبرنا.
  5. التبديل إلى KSR / DMSO المتوسطة التمايز في يوم 4 (لhESCs) / اليوم 6 (لhiPSCs). تغيير متوسطة دaily لأول 3 أيام وبعد ذلك في اليوم الخامس من هذه مرحلة التمايز.
    ملاحظة: لا حاجة لتغذية في اليوم الرابع من هذه مرحلة التمايز. استخدام unsupplemented KO-DMEM لغسل خلايا مرة واحدة قبل تغيير المتوسطة إذا كان هناك العديد من الخلايا الميتة. للتحقق ما إذا كان التمايز لهذه المرحلة هو ناجح أم لا، يمكن للمرء أن اختبار التعبير عن علامات خلية سلفية الكبدية، مثل لوكالة فرانس برس، CK19، وHNF4A. فإن ما يقرب من 90٪ من الخلايا تكون إيجابية لهذه العلامات بناء على خبرتنا.
  6. بعد 5 أيام من مرحلة التمايز KSR / DMSO، والتحول إلى مرحلة النضج HepatoZYME. غسل خلايا مرة واحدة مع عادي HepatoZYME المتوسطة القاعدية بعد إزالة المتوسطة KSR / DMSO. إضافة HepatoZYME نضوج تستكمل المتوسطة مع 10 نانوغرام / مل HGF و 20 نانوغرام / مل OSM.
  7. تغيير المتوسط ​​كل 48 ساعة لمدة 7 - 10 أيام، وعند هذه النقطة الخلايا جاهزة للتوصيف المعياري أو استخدامها مرة أخرى.
    ملاحظة: الكبدية الامتحانات التعبير علامة، التمثيل الغذائياختبارات وظائف (مثل النشاط السيتوكروم P450) واليوريا والاختبارات إفراز الزلال، اختبارات تخزين الجليكوجين، والإندوسيانين الأخضر (ICG) اختبارات امتصاص وطرق توصيف نموذجية.
    ملاحظة: الجدول الزمني للبروتوكول التمايز هو مبين في الشكل (5). في المختبر، ونحن بشكل روتيني تحقق مستويات ثوابت قانون هنري هي مشتقة '-الكبدية محددة التعبير علامة، إفراز الألبومين، والسيتوكروم P450 (CYP) 3A و1A2 النشاط.

النتائج

تمايز الخلايا الكبدية من hPSCs

استخدمت سطر واحد البشري الجنينية الخلايا الجذعية، H9، وخط المحفزة الخلايا الجذعية البشرية التي يسببها واحد، 33D6، للتمايز الكبدية. النتائج في الأرقام 1-3 هي من خلايا H9، في حين أن أولئك في الشكل (4) هم من خلايا 33D6. أنشأت خلايا مفردة المصنف على laminins خلية خلية الاتصال بعد 24 ساعة. بعد أن وصلت الخلايا حوالي 40٪ confluency، وبدأ عملية التمايز (الشكل 1A) والشكل (4A). على laminins (سواء LN-521 و LN-521 / LN-111)، ذهبت هذه الخلايا من خلال التغيرات المورفولوجية متتابعة، وأدت إلى ثوابت قانون هنري هي الاستقطاب (الشكل 1) والشكل (4A).

مثل الكبدية توصيف خلية

داتم جمع ص 18 ثوابت قانون هنري هي وتقييمها للتعبير عن علامات الكبدية التمثيلية، HNF4A وALB (الشكل 2A). أظهر المناعية من يوم 18 ثوابت قانون هنري هي أن ما يقرب من 90٪ من الخلايا أعربت HNF4α (الشكل 2B). هذه الخلايا الاستقطاب على laminins وأظهرت مظهر المضلع، كما تميزت E-كادهيرين وF-الأكتين التعبير (الشكل 2B).

تم تقييم أيضا السيتوكروم P450 (CYP) النشاط. وCYP450s إجراء ظيفة التمثيل الغذائي الهامة لخلايا الكبد. تم اختبار يوم 18 ثوابت قانون هنري هي مشتقة على خليط من البروتين هلامي، مثل Matrigel، LN-521، أو LN-521 / LN-111، للنشاط CYP3A. أظهرت ثوابت قانون هنري هي أعلى بكثير النشاط CYP3A على ركائز laminin من على matrigel (الشكل 3). الأهم من ذلك، بالمقارنة مع خلايا الكبد الأولية الإنسان التجارية مطلي إعادة (HU1339) على هذه ركائز، وثوابت قانون هنري هي لديها ما يقرب من 10 مرات أعلى المستوياتالنشاط CYP3A 10.

كان التفريق بين hiPSCs مماثلة لتلك التي من hESCs. الخلايا أظهرت تغيرات متتابعة في ظهور الشكل (4A). أعربت ثوابت قانون هنري هي مشتقة رئيسيا عاملا الكبدية النسخ، HNF4α (الشكل 4B)، وتمتلك النشاط CYP3A والزلال يفرز (الشكل 4C و D). والجدير بالذكر، المعروضة ثوابت قانون هنري هي مشتقة من 33D6 تخفيض CYP3A بالمقارنة مع خلايا H9 المستمدة ثوابت قانون هنري هي (الشكل 3)، ولكن كان لا يزال مماثلة لخلايا الكبد الأولية الإنسان 10. ومع ذلك، كان إفراز الزلال من هذه ثوابت قانون هنري هي أقل بكثير مما كانت عليه في خلايا الكبد الأولية 10.

figure-results-2998
الشكل 1: التغيرات المورفولوجية متسلسل خلال كبدي التمايز. </ المصنفة قوية> (A) hESCs غير متمايزة حيث بلغت الخلايا واحد حوالي 40٪ confluency 24 ساعة بعد البذر. (ب) بعد فتيلة، أظهرت خلايا مورفولوجيا الأديم الباطن نموذجي في يوم 4. (C) عند الوصول إلى مرحلة شبيهة أرومة كبدية، أظهروا شكل متعدد الأضلاع واضحة في يوم 9. (D) بعد مرحلة النضج، وكانت ثوابت قانون هنري هي الاستقطاب جاهزة لل مزيد من التوصيف هو موضح هنا في يوم 18. مقياس بار = 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3837
الشكل 2: توصيف ثوابت قانون هنري هي. (أ) التعبير الجيني من علامات-الكبدية محددة، HNF4A (يسار) وALB (يمين). تم تحليل مستوى التعبير عن الرأي يوم 18 ثوابت قانون هنري هي مشتقة من hESCs على حد سواء LN-521 و LN-521 / LN-111، وكان تطبيع للGAPDH التدبير المنزلي الجينات وأعرب بالنسبة إلى hESCs. وتمثل نتائج ثلاث مكررات البيولوجية، وأشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري (SD). * ف <0.05، ** ف <0.01. أونبايريد اختبار (ت). التعبير (B) البروتين من علامة رئيسية الكبدية، HNF4α، وعلامات الاستقطاب، E-كادهيرين وF-الأكتين. وقد أجريت يوم 18 ثوابت قانون هنري هي على LN-521 و LN-521-111 LN كانت ملطخة / للعلامات المذكورة أعلاه و counterstained مع هويشت 33342. والسيطرة السلبية مع الغلوبولين المناعي المقابلة G (مفتش). وأظهرت النسبة المئوية للخلايا HNF4α إيجابية والتنمية المستدامة. تم احتساب هذا من أربعة حقول عشوائية نظر. أخذت الصور في 20X التكبير. شريط مقياس = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

. في غضون الصفحات = "1"> figure-results-5104
الرقم 3: التمثيل الغذائي وظيفة توصيف ثوابت قانون هنري هي. تم اختبار السيتوكروم P450 النشاط من CYP3A من الخلايا المستزرعة على Matrigel (MG)، LN-521، أو LN-521 / LN-111. تمثل البيانات ثلاثة مكررات البيولوجية، وأشرطة الخطأ تمثل SD. ** ف <0.01. واحد طريقة أنوفا مع اختبار ما بعد خاصة توكي و. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5726
الشكل 4: توصيف قياسي من ثوابت قانون هنري هي. وتختلف hiPSCs مثقف على LN-521 إلى ثوابت قانون هنري هي. أجريت اختبارات توصيف القياسية في يوم 17 ثوابت قانون هنري هي. (أ) التشكل متتابعة من الخلايا خلال التمايز كبدي. ص نقاط الوقت هو موضح خلايا EPRESENT في أيام 1 و 4 و 9 و 17. (ب) المناعية التعبير HNF4α. يظهر النسبة المئوية للخلايا إيجابية والتنمية المستدامة القائمة على أربعة حقول عشوائية نظر. أخذت الصور في 20X التكبير. شريط مقياس = 100 ميكرون. (ج) النشاط CYP3A يوم 17 ثوابت قانون هنري هي. تمثل البيانات ستة مكررات البيولوجية، ويمثل شريط الخطأ SD. إفراز (D) الزلال من ثوابت قانون هنري هي مشتقة أكثر من 24 ساعة في الثقافة. تمثل البيانات أربعة مكررات البيولوجية، ويمثل شريط خطأ SD. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6810
الرقم 5: الجدول الزمني تخطيطي للبروتوكول التمايز.ر = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

لتعزيز البحوث الإنسان المحفزة الخلايا الجذعية والطب متعدية، نظم خالية من XENO التي تتوافق مع مطلوبة المبادئ التوجيهية الحالية الممارسات التصنيعية الجيدة. مفتاح أي عملية التمايز هو المصفوفة خارج الخلية (ECM). إدارة المحتوى في المؤسسة ليس فقط يدعم مرفق الخلية، ولكنها توفر أيضا إمكانية الوصول إلى عوامل الإشارات الرئيسية، والتأثير على تحديد الخلايا والنمط الظاهري 25، 26.

Laminins هي متعددة الوظائف البروتينات المصفوفة خارج الخلية في الجسم الحي. في الكبد، وإفراز Laminin الحالي هو الحاسم لتجديد الكبد بعد استئصال الكبد الجزئي 27 ومطلوب لالسلف الكبدي صيانة خلية 28. كانت أهمية laminins في صيانة الكبد وتجديد أساس لاختبار المتاحة تجاريا laminins الإنسان المؤتلف في نظام الكبدية التمايز لدينا.

متفوقة انهوقد تحقق patocyte التمايز على LN-521 و LN-521 / LN-111 ركائز بالمقارنة ل Matrigel. تم الاستقطاب ثوابت قانون هنري هي مشتقة بشكل واضح ومنظم في الطبق، وتحسين وظيفة الخلوية بشكل كبير بالمقارنة مع نظرائهم هلامية البروتين الخليط. الكامنة وراء هذه التحسينات كانت downregulation من تلويث colon-، fibroblast- ووقف جينات الخلايا المرتبطة على laminins، وكذلك انخفاض في تكاثر الخلايا والجينات الهجرة المرتبطة 10.

في الختام، بروتوكول صفها هنا يولد خلايا تشبه خلايا الكبد التي هي أقرب في طبيعتها إلى خلايا الكبد البشرية الكبار. هذه العملية هي قابلة للتكرار، قابلة للأتمتة، ويمكن زيادتها لتطبيق فعالية من حيث التكلفة. الأهم من ذلك، تم خفض التباين دفعة إلى دفعة بشكل ملحوظ بالمقارنة مع التقنيات التي تستخدم Matrigel، مما نتج عنه نظام التمايز محسن للباحثين في هذا المجال.

Disclosures

الدكتور ديفيد سي هاي هو المؤسس المشارك ومدير Stemnovate المحدودة.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل مع جوائز من الطب التجديدي منصة المملكة المتحدة (MRC MR / L022974 / 1 و MR / K026666 / 1) ومنحة الصين.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Human Recombinant Laminin 521BioLaminaLN521-02
Human Recombinant Laminin 111BioLaminaLN111-02
Recombinant mouse Wnt3aR&D Systems1324-WN-500/CF
Human Activin APeprotech120-14E
Human Hepatocyte Growth FactorPeprotech100-39
Human Oncostatin MPeprotech300-10
Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y27632 Sigma-AldrichY0503-1MG
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium saltSigma-AldrichH4881
DMSOSigma-AldrichD5879
mTeSR1 mediumSTEMCELL Technologies05850
RPMI 1640Life Technologies21875
Knockout DMEMLife Technologies10829
HepatoZYMELife Technologies17705
B27 supplementLife Technologies12587-010
Knockout Serum ReplacementLife Technologies10828
GlutaMaxLife Technologies35050
Non-essential amino acidsLife Technologies11140
2-mercaptoethanolLife Technologies31350
AccutaseMilliporeSCR005
DPBS with Calcium and MagnesiumThermoFisher14040133

References

  1. Forbes, S. J., Gupta, S., Dhawan, A. Cell therapy for liver disease: From liver transplantation to cell factory. J Hepatol. 62 (1 Suppl), S157-S169 (2015).
  2. Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12301-12306 (2008).
  3. Hay, D. C., et al. Direct differentiation of human embryonic stem cells to hepatocyte-like cells exhibiting functional activities. Cloning Stem Cells. 9 (1), 51-62 (2007).
  4. Medine, C. N., et al. Developing high-fidelity hepatotoxicity models from pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2 (7), 505-509 (2013).
  5. Szkolnicka, D., et al. Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 141-148 (2014).
  6. Zhou, X., et al. Modulating innate immunity improves hepatitis C virus infection and replication in stem cell-derived hepatocytes. Stem Cell Reports. 3 (1), 204-214 (2014).
  7. Rashidi, H., Alhaque, S., Szkolnicka, D., Flint, O., Hay, D. C. Fluid shear stress modulation of hepatocyte-like cell function. Arch Toxicol. 90 (7), 1757-1761 (2016).
  8. Szkolnicka, D., et al. Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs. Stem Cells Transl Med. 5 (6), 764-772 (2016).
  9. Wang, Y., Hay, D. C. Mass production of stem cell derived human hepatocytes for experimental medicine. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 769-771 (2016).
  10. Cameron, K., et al. Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1250-1262 (2015).
  11. Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
  12. Sullivan, G. J., et al. Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 329-335 (2010).
  13. Duan, Y., et al. Differentiation and enrichment of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells in vitro and in vivo. Stem Cells. 25 (12), 3058-3068 (2007).
  14. Szkolnicka, D., Farnworth, S. L., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Deriving functional hepatocytes from pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 30, 1-12 (2014).
  15. Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
  16. Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
  17. Touboul, T., et al. Generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells under chemically defined conditions that recapitulate liver development. Hepatology. 51 (5), 1754-1765 (2010).
  18. Touboul, T., et al. Stage-specific regulation of the WNT/beta-catenin pathway enhances differentiation of hESCs into hepatocytes. J Hepatol. 64 (6), 1315-1326 (2016).
  19. Mathapati, S., et al. Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 38, 1-1 (2016).
  20. Takayama, K., et al. Efficient generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells by HNF4alpha transduction. Mol Ther. 20 (1), 127-137 (2012).
  21. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotechnol. 28 (6), 611-615 (2010).
  22. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nat Commun. 5, 3195 (2014).
  23. Takayama, K., et al. Long-term self-renewal of human ES/iPS-derived hepatoblast-like cells on human laminin 111-coated dishes. Stem Cell Reports. 1 (4), 322-335 (2013).
  24. Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. Robust generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cell populations. J Vis Exp. (56), e2969 (2011).
  25. Sales, V. L., et al. Transforming growth factor-beta1 modulates extracellular matrix production, proliferation, and apoptosis of endothelial progenitor cells in tissue-engineering scaffolds. Circulation. 114 (1 Suppl), I193-I199 (2006).
  26. Taylor-Weiner, H., Schwarzbauer, J. E., Engler, A. J. Defined extracellular matrix components are necessary for definitive endoderm induction. Stem Cells. 31 (10), 2084-2094 (2013).
  27. Martinez-Hernandez, A., Delgado, F. M., Amenta, P. S. The extracellular matrix in hepatic regeneration. Localization of collagen types I, III, IV, laminin, and fibronectin. Lab Invest. 64 (2), 157-166 (1991).
  28. Lorenzini, S., et al. Characterisation of a stereotypical cellular and extracellular adult liver progenitor cell niche in rodents and diseased human liver. Gut. 59 (5), 645-654 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

121 laminins GMP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved