الجسم الدهون نظام الثقافة الجهاز في بعوض الزاعجة المصرية، ناقل للفيروس Zika

Summary

الجسم الدهون هو الجهاز المركزي الأيضي في الحشرات. نقدم نظام جهاز يعيش ثقافة التي تمكن المستخدم من دراسة ردود أنسجة الجسم الدهون منعزلة للمنبهات المختلفة.

Abstract

الجسم الدهون الحشرات يلعب دوراً مركزياً في الأيض الحشرات وتخزين المواد الغذائية، النسخ المتطابق لوظائف الكبد والأنسجة الدهنية في الفقاريات. عادة ما يتم توزيع أنسجة الجسم الدهون الحشرات في جميع أنحاء الجسم الحشرات. ومع ذلك، غالباً ما تتركز في البطن وتعلق على هيئة جدار البطن.

الجسم الدهون البعوض هو المصدر الوحيد لصفار البيض والبروتينات، والتي تعتبر حاسمة بالنسبة لإنتاج البيض. ولذلك، يمثل ثقافة أنسجة الجسم الدهون البعوض في المختبر نظاما هاما لدراسة فسيولوجيا البعوض، التمثيل الغذائي، وفي نهاية المطاف، إنتاج البيض. وتبدأ عملية الثقافة الدهون الجسم بإعداد الحلول والمواد الكاشفة، بما في ذلك حلول الأسهم من الأحماض الأمينية و بعوض المحلول الملحي الفسيولوجي الملح حل الأسهم (الجزائرية) وحل مخزون الكالسيوم والجسم الدهون الثقافة المتوسطة. ما زالت العملية مع تشريح الجسم الدهون، متبوعاً علاج تجريبي. وبعد العلاج، ويمكن أن يؤديها مجموعة متنوعة من تحليلات مختلفة، بما في ذلك الحمض النووي الريبي التسلسل (الحمض النووي الريبي-Seq)، قبكر والبقع الغربية، البروتيوميات وجميع.

في تجربتنا مثال، نبدي البروتوكول عن طريق الختان والثقافة الهيئات الدهون من البعوض الحمى الصفراء، بعوض الزاعجة المصرية، ناقل الرئيسي من سيتناقش بما في ذلك حمى الضنك وداء شيكونغونيا وزكى. الجيش الملكي النيبالي من الهيئات الدهون مثقف تحت شرط فسيولوجية المعروفة لبروتينات صفار upregulate مقابل السيطرة تخضع لتحليل الحمض النووي الريبي Seq لإثبات الفائدة المحتملة لهذا الإجراء لإجراء تحقيقات تعبير الجيني.

Introduction

البعوض ناقلات الأمراض البشرية المدمرة، بما في ذلك الملاريا وحمى الضنك وداء شيكونغونيا و Zika^1،،من²³. وعلى الرغم من الجهود الدولية المكثفة للحد من هذه الأمراض ومراقبة السكان البعوض يحيل بها المرض، انتشار الأوبئة للأمراض التي ينقلها البعوض لا تزال شائعة، لا سيما في البلدان النامية. لقاحات فعالة ضد العديد من هذه الأمراض أما غير متوفرة أو لفعالية محدودة^4،5. الطريقة الأكثر فعالية للحيلولة دون تفشي السيطرة على البعوض السكان، أساسا من خلال استخدام المبيدات الحشرية العلاجات. ومع ذلك، وضعت في العديد من البعوض السكان مقاومة المبيدات الحشرية وأصبحت مشكلة شائعة في جميع أنحاء العالم^6،،من⁷⁸. دراسة علم وظائف الأعضاء البعوض أمر ضروري لتطوير أدوات جديدة واستراتيجيات السيطرة على المرض.

الجسم الدهون البعوض يلعب دوراً مركزياً في تخزين المواد الغذائية والتوازن الأيضي، والاستنساخ، وتقويض إكسينوبيوتيك^9،10،،من¹¹¹². هو جهاز التخزين الرئيسي للشحوم، والجليكوجين، والأحماض الأمينية في شكل بروتينات التخزين. وهو يعمل أيضا كموقع التوليف لمعظم البروتينات hemolymph ونواتج الأيض. في البعوض، والجسد الدهون هو المصدر الوحيد لإنتاج البروتين الصفار الذي يحدث في الإناث بعد أن تأخذ وجبة الدم^13،14.

نوع الخلايا الرئيسية للجسم الدهون هو تروفوسيتي كبير، الكروموزومية أو adipocyte^3،9،،من¹⁰¹². ينقسم إلى الفصوص أو مانعات أنسجة الجسم الدهون ويمكن العثور عليها في جميع أجزاء الجسم من البعوض، مع الجزء الأكبر يقع في البطن، حيث يتم إرفاق الفصوص كبيرة من الدهون في الجسم على هيئة جدار البطن.

النظام ثقافة الجسم الدهون البعوض المعروضة هنا وضعت في السبعينات وما زالت أداة قوية لدراسة الجسم الدهون علم وظائف الأعضاء¹⁰، لا سيما في تركيبة مع تحليل التكنولوجيات الحالية. ويستند أساسا لهذا الأسلوب عزل جدران الجسم البطن والأنسجة المرتبطة بها الدهون في الجسم. طبيعة بشرة البطن مسعور يتسبب في أن تطفو على سطح متوسط الثقافة، مع الفصوص المرفقة من البطن الدهون الجسم مغمورة. يتم الحفاظ على سبيراكليس وهيكل تراتشيولار، تأمين الأوكسجين للأنسجة المستزرعة. من الآن فصاعدا، سوف نشير إلى هذه الأعمال التحضيرية باعتبارها "هيئات الدهون." الهيئات الدهون منعزلة البقاء لأكثر من 12 ح عند المحتضنة في الوسيلة المناسبة (نتائج غير منشورة). الثقافة الدهون في الجسم هو أداة قيمة وقد تناول مجموعة متنوعة من الأسئلة المتعلقة بالدهون الجسم الغدد الصماء وعلم وظائف الأعضاء^9،10،،من^{1215،16، 17}.

مثقف الدهون الهيئات يمكن أن تخضع لمختلف التجارب والتحكم في العلاجات، توقيت التي يمكن أن يقررها المحقق. في نهاية فترة الحضانة، يمكن جمع الهيئات الدهون ومعالجته لتحليلات المتلقين للمعلومات، بما في ذلك قبكر^16،17،،من¹⁸¹⁹، الغربية النشاف^{18 ،20}، البروتيوميات²¹أو²²من جميع. يمكن إجراء تجارب على نطاقات مختلفة، من الهيئات الدهون الفردية لمجموعات من مئات التي يمكن أن تكون مثقف معا.

نتائج تمثيلية شملت هنا مستمدة من الدهون الهيئات مثقف حضور الأحماض الأمينية و ecdysone 20-هيدروكسي هرمون الستيرويد لمحاكاة التنشيط وجبة الدم من^{، فيتيلوجينيسيس،من1617 ،}من ²³²⁴. يمكننا تحليل ومقارنة التعبير الجيني التفاضلي لعدم تنشيط مقابل تنشيط الهيئات الدهون عن طريق تحليل تسلسل الجيل القادم.

Protocol

1-إعداد الحلول والمواد الكاشفة

1. حل الأسهم من الأحماض الأمينية
   1. تحضير 4 X الأحماض الأمينية حل الأسهم ^{23 ، 24} بوزنها و إضافة الأحماض الأمينية مختلفة 20 قارورة Erlenmeyer وفقا للتركيزات الواردة في الجدول 1-
      ملاحظة: في بعض الحالات، amino acid(s) يمكن استبعادها من الحل والاستعاضة عنها بكميات متساوية المولى من المانيتول الاحتفاظ بتركيز متساو من أوسموليتيس-
   2. إضافة مبلغ ddH ₂ س لإنتاج وحدة التخزين المطلوبة للحل المناسب-
   3. لضمان أن يكون تماما حل الأحماض الأمينية، الحرارة بلطف مع التحريك باستمرار حتى السائل واضح تماما؛ وسوف يستغرق على لوناً أصفر طفيف.
      ملاحظة: قد تكون ضرورية لخفض درجة الحموضة إلى 6 بإضافة HCl للسماح لبعض من الأحماض الأمينية مسعور أكثر بحل.
   4. قاسمة الحل والعقيمة عامل تصفية باستخدام عامل تصفية المحاقن مع 0.2-ميكرومتر المسامية الحجم.
   5. تخزين في حاوية محكمة الإغلاق في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
2. وكالة الأنباء الجزائرية
   ملاحظة: انظر ²⁵.
   1. ل 20 X الملح حل الأسهم، والجمع بين الأملاح المدرجة في الجدول 2 في 50 مل الماء. يقلب حتى يذوب تماما.
      ملاحظة: قد يكون من الضروري على الحرارة قليلاً الحل لإذابة الأملاح تماما.
   2. ستيريلي-تصفية باستخدام عامل تصفية المحاقن مع 0.2-ميكرومتر المسامية الحجم وتخزين الحل في أنبوب 50 مل في-20 درجة مئوية.
3. الكالسيوم المخزون الحل
   1. 50 س الحل مخزون الكالسيوم، أضف ز 0.90 من كلوريد الكالسيوم إلى 100 مل الماء (الجدول 3)؛ ويحرك حتى يذوب تماما.
   2. ستيريل-تصفية باستخدام المحاقن تصفية مع حجم مسام 0.2 ميكرومتر، الكوة الحل في أنابيب 50 مل، وتخزينها في-20 درجة مئوية.
4. تريس المخزن المؤقت (درجة الحموضة 7.4)
   1. تريس المخزن المؤقت، والجمع بين الملح والحلول المدرجة في الجدول 4 وإضافة ddH ₂ س يصل إلى 100 مل.
   2. ستيريل-تصفية باستخدام المحاقن تصفية مع حجم المسام 0.2 ميكرون وقاسمه الحل في أنابيب 50 مل؛ وتخزين في درجة حرارة الغرفة-
5. الجسم الدهون الثقافة المتوسطة
   1. بإعداد متوسطة الثقافة الجسم الدهون، إعداد جميع الحلول المذكورة أعلاه-
   2. الجمع بينهما وفقا لوحدات التخزين في الجدول 5 جعل 200 مل من الجسم الدهون الثقافة المتوسطة.
   3. ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم أو HCl.
   4. ستيريل-تصفية الحل باستخدام عامل تصفية المحاقن مع حجم مسام 0.2 ميكرون.
   5. تقسيم الحل إلى مختبرين 15 مل وتخزينها في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.

2. إعداد لتشريح

1. إعداد ستيريوميكروسكوبي (10-20 x التكبير) مع الإضاءة ووضع ملاقط فائقة غرامة اثنين ومقص التشريح الصغير-
2. إعداد كافة الحلول اللازمة للتجربة. ذوبان الجليد المتوسط الثقافة الدهون في الجسم إلى درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: يمكن حل بريسيبيتانتس بلطف تدفئة حل لا تزيد عن 30 درجة مئوية.
3. مع المضخة، جمع البعوض الإناث البالغات (3-7 أيام بعد ظهور) وتخدير لهم باستخدام ثاني أكسيد الكربون أو مدت
   ملاحظة: مرة تخديره، البعوض ينبغي أن يظل قيد CO ₂ لأقصر وقت ممكن، لا تتجاوز 20 دقيقة بدلاً من ذلك، يمكن تخديره على الجليد البعوض والاحتفاظ بها لما يقرب من 30 دقيقة
4. إعداد لوحة 6-جيدا مع 3 مل من وكالة الأنباء الجزائرية في بئر-

3. تشريح جثة الدهون

1. التركيز ستيريوميكروسكوبي تشريح وضبط الرئاسة إلى ارتفاع مريحة.
2. وضع شريحة مجهر مقعر على سطح مجهر وإضافة نقطتين من وكالة الأنباء الجزائرية إلى المركز-
3. التقاط البعوض بساق باستخدام ملقط وأنه نقل إلى السطح الجزائرية على الشريحة المجهر.
4. بعناية قبضة البعوض بالصدر، مع الملقط في اليد اليسرى، وتدوير البعوض حيث يكون الجانب البطني صعودا.
5. بينما يمسك الجسم ثابت بالصدر، فهم أجزاء البطن الأخيرين، مع الملقط في اليد اليمنى، واجذب.
   ملاحظة: فصل آخر جزئين البطن من البطن والمبايض المرفقة، Malpighian الأنابيب، والمعي الخلفي والامامي؛ في بعض الأحيان سوف الشريحة المحصول من البطن. إذا كانوا قد لا أزيلت، إدراج نصائح مغلقة الملقط في حفرة صغيرة تم إنشاؤها وإزالة الأنسجة المتبقية.
6. جانبا الملقط حق وتلتقط المقص الربيع. شريحة شفرة واحد في الحفرة في البطن حتى الجزء أسفل الصدر. بلطف وسرعة قطع البطن طوليا.
   ملاحظة: بمجرد القص، البطن ينبغي البدء في التوسع إلى الخارج، على الرغم من أن هذا قد لا يحدث فورا.
7. المضي قدما لجعل خفض الثاني، الذي سوف يكون قطع أفقي أسفل الصدر، وأقل قليلاً من حيث انتهى أول خطوة من نوعها-
   ملاحظة: البطن ينبغي ثم فتح وتنأى عن الصدر، مع بشرة أعلى والهيئات الدهون الجانب مغمورة داخل وكالة الأنباء الجزائرية. هذا الجدار الجسم البطن وهو إعداد الجسم الدهون للثقافة في المختبر.
8. رفع الجثث الدهون من وكالة الأنباء الجزائرية الحل باستخدام التلميح لزوج من الملقط ونقلها من الحل إلى لوحة 6-كذلك يتضمن وكالة الأنباء الجزائرية في درجة حرارة الغرفة. تسمح الأنسجة إلى الراحة لحوالي 0.5 ح قبل الانتقال إلى ثقافة الجسم الدهون.

4. ثقافة الجسم الدهون

1. احتضان الهيئات الدهون في وكالة الأنباء الجزائرية في درجة حرارة الغرفة لمالا يقل عن 0.5 ح حجته لهم.
2. نقل الهيئات الدهون باستخدام تلميح الملقط وانتشالهم بلطف الحل وكالة الأنباء الجزائرية. أدنى التلميح إلى المتوسطة ثقافة الجسم الدهون.
   ملاحظة: يجب فتح على سطح المتوسط الجسم الدهون والتعويم الحر. ثقافة الجسم الدهون تتم عادة في لوحات 96-جيدا، مع 150-200 ميليلتر من المتوسط في كل بئر. أحد جيدا يمكن أن يصلح يصل إلى ثلاث هيئات الدهون الفردية، وأنها قابلة للتطبيق لأكثر من 12 ح (نتائج شخصية غير منشورة).
3. بعد فترة الحضانة، نقل جثث الدهون من المتوسط إلى أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل يحتوي على الكواشف الملائمة للتجهيز النهائي.
   ملاحظة: تشمل تحليلات نموذجية قبكر ^{16 ، 17 ، ،} من ^{18 19}، الغربية النشاف ^{18 ، 20} ترانسكريبتوميكس ²⁶، البروتيوميات ²¹ أو ²² من جميع.

النتائج

على سبيل مثال، إجراء تجربة ثقافة جسم الدهون وتحفيز الهيئات الدهون منعزلة من حضانة لهم في محلول يحتوي على مزيج متوازن من جميع الأحماض الأمينية العشرين التي تحدث بشكل طبيعي وهرمون الستيرويد الحشرات 20-هيدروكسي اكديسوني (10 ميكرون) ح 6 . كعنصر تحكم، كانت الهيئات الدهون المحتضنة في وكالة الأنباء الجزائرية لمبلغ مساو من الوقت.

بعد الحضانة، كان مجموع الجيش الملكي النيبالي المعزولة باستخدام كاشف ثلاثي²⁷ اتباع إرشادات الشركة المصنعة. تم تقييم نوعية وكمية من عينات الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام جهاز المطياف الضوئي، كوانتيتيشن فلوروميتريك، والتفريد [اغروس] هلام. مكتبات تسلسل الحمض النووي الريبي تم إنشاؤها باستخدام 4 ميكروغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي، وتم تحديده كمياً باستخدام تقنيات مختلفة اثنين. في وقت لاحق، أرسلت المكتبات إلى موفر خدمة تجارية للتسلسل نهاية الاقتران.

وترد نتائج هذه التجربة في الجدول 6. وكانت الجينات تظهر الاستجابة النسخي أقوى من الأحماض الأمينية و 20-هيدروكسيكديسوني أساسا صفار البروتين الجينات، وما يتفق مع النتائج السابقة¹¹.

ويبين الشكل 1 حرارة خريطة تبين مستويات التعبير الجيني 1,256 خلطات أعرب الجينات من مثقف الدهون الهيئات بعد اثنين من العلاجات المختلفة.

الشكل 1 . الحرارة خريطة الجينات التي أعرب عنها في ثقافة الجسم الدهون. وكان حساب الحرارة خريطة استناداً إلى عدد النصوص المحددة لكل الجينات في مكتبات مختلفة باستخدام حزمة heatmap²⁸ الذي يعد جزءا من بيئة البرامج R. يمثل أغمق التعبير الجيني أعلى. جينات 1,256 مع اختلاف يعتد به إحصائيا في التعبير (قيم س-< 0.05) وترد. يتم ترتيب الجينات وفقا لمستويات التعبير المتوسط، أشارت إلى جانب ديندروجرام على اليسار (لا وفقا لعلاقاتهم النشوء والتطور). لاحظ العدد الكبير من الجينات مع التعبير أعلى أو أسفل ينظم بعد التحفيز بالأحماض الأمينية (أإ) و 20-هيدروكسيكديسوني (20E). وكالة الأنباء الجزائرية = المحلول الملحي الفسيولوجي بعوض . انظر تكميلية الملف 1 للحصول على قائمة من الجينات، ومستويات التعبير النسبي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

حمض أميني	الوزن الجزيئي غ/مول	مم تركيز	ملغم للتر الواحد	مغ لحجم 300 مل
ألانين	89.1	26.68	2377.19	713.16
ارجينين	174.2	26.68	4647.66	1394.3
أسباراجين	150.1	26.68	4004.67	1201.4
حمض الأسبارتيك	133	26.68	3548.44	1064.53
سيستين	121.16	10.68	1293.99	388.2
حمض الغلوتاميك	147.1	26.68	3924.63	1177.39
الجلوتامين	146	26.68	3895.28	1168.58
جليكاين	75	53.32	3999	1199.7
الحامض الأميني	155.16	80	12412.8	3723.84
آيسولوسين	131	10.68	1399.08	419.72
ليسين	183	26.68	4882.44	1464.73
ليوسيني	131	26.68	3495.08	1048.52
فينيلألانين	165	10.68	1762.2	528.66
برولين	115	26.68	3068.2	920.46
سيرين	105	53.32	5598.6	1679.58
ثريونين	119	10.68	1270.92	381.28
التربتوفان	204	10.68	2178.72	653.62
تيروزين	181	5.32	962.92	288.88
فالين	117	10.68	1249.56	374.87
الميثيونين	149	10.68	1591.32	477.4

الجدول 1. 4 X حل الأسهم من الأحماض الأمينية.

المكون	الوزن بالجرام إضافة إلى 50 مل ddH2س
كلوريد الصوديوم	ز 8.0
بوكل	ز 0.074
مجكل2-6 ح2س	ز 0.120
ناكو3	ز 0.0250

الجدول 2- 20 X الملح حل الأسهم.

المكون	الوزن بالجرام إضافة إلى 100 مل ddH2O
كاكل2-2 ح2س	ز 0.90

ز > الجدول 3. 50 س الحل مخزون الكالسيوم.

المكون	تركيز حل الأسهم	تقييم حجم المخزن المؤقت 100 مل
تريس pH8.0	م 1	5 مل
يدتا	0.25 M	2 مل
كلوريد الصوديوم	نا	ز 0.3
ddH2س	نا	إلى 100 مل (~ 93 مل)

الجدول 4- العازلة تريس.

المكون	تقييم حجم 200 مل
حل الأسهم من الأحماض الأمينية	150 مل
حل الأسهم الملح	10 مل
حل مخزون الكالسيوم	4 مل
المخزن المؤقت لقسم التدريب والامتحانات	10 مل
ddH2O	مل 26

الجدول 5- هيئة الدهون الثقافة المتوسطة.

تعليق توضيحي	وصف الجينات	أمثال التغيير	قيمة P
AAEL006138	ب-تغيرات	3443	2.52E--112
AAEL006126	ج-تغيرات	2795	8.64E-91
AAEL006563	كاربوكسيبيبتيداسي فيتيلوجينيك	1002	2.17E--119
AAEL010434	تغيرات-أ	220	1.14E-27
AAEL006542	كاربوكسيبيبتيداسي فيتيلوجينيك	185	2.14E--65
AAEL012678	AAEL003006-السلطة الفلسطينية [بعوضة aegypti](65%)	96	4.00E-70
AAEL000080	البروتين افتراضية	82	6.69E-188
AAEL015312	كاثيبسين فيتيلوجينيك ب	77	1.27E-15
AAEL009588	مستقبلات النووية 3	75	4.58E--56
AAEL010529	البروتين افتراضية	66	1.32E--29

الجدول 6- النتائج التجريبية.

الملف الإضافي 1- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

الثقافة الحشرات الجهاز كان يستخدم على نطاق واسع دراسة الحشرات علم الغدد الصماء، والتنمية، والايض، فضلا عن التحقيق في التفاعل بين أجهزة محددة والبكتيرية سيمبيونتس^29،،من^{3031، 32،،}من³³³⁴. واستخدمت في المختبر الجسم الدهون جهاز الثقافة تحديداً لدراسة النقل من الأحماض الأمينية وتنظيم إنتاج البروتين صفار في البعوض وغيرها^17،16، ديبتيرا^{35 , 36}-أثناء عملية فيتيلوجينيسيس، يستخدم الجسم الدهون البعوض صفيف الناقلين الأحماض الأمينية خصوصية عالية لاستيراد الأحماض الأمينية المستمدة من وجبة الدم من هيموليمف لتجميع كميات كبيرة من بروتينات صفار^{12 ،19،،}من³⁵³⁶. ثقافة الجسم الدهون كانت مفيدة لتحديد المتطلبات الغذائية الجسم الدهون في هذا السياق¹⁸.

نوعية المواد البداية، أنثى البعوض، أمر حاسم لنجاح هذه التجارب. يرقات البعوض التي أثيرت في ظروف مزدحمة تحت وتتغذى على الوجبات الغذائية العالية في المغذيات وعادة ما ينتج أفضل النتائج. وهناك بعض المتغيرات الهامة في الاعتبار عند وضع شروط ثقافة الجسم الدهون البعوض في المختبر من حيث التصميم التجريبي. أظهرنا في دراسات سابقة أن التعبير الجيني الجسم الدهون تتفاوت تفاوتاً كبيرا تبعاً لتاريخ حياة الفرد والحالة التغذوية ل البعوض^11،22. يجب أن تكون شروط الثقافة البعوض موحدة للحد من التفاوت في الحجم والاحتياطيات الغذائية للبعوض التجريبية. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي تدريب الموظفين يؤدون تشريح لضمان تشريح سريعة ودقيقة مع نتائج متسقة. يمكن التحقق من صلاحية خلية في هيئات الدهون منعزلة باستخدام مختلف الأساليب المصبوغة^37،38.

تصميم تجريبي لتجربة ثقافة الجسم الدهون ينبغي أن تأخذ في الاعتبار عدد تشريح ممكن في فترة زمنية معينة. عندما يتطلب الأمر كميات كبيرة من الدهون في الهيئات، دورات تشريح متعددة أو dissectors متعددة قد يكون ضروريا. وهناك طائفة واسعة من التطبيقات المستقبلية للثقافة في المختبر الجسم الدهون في البعوض وغيرها من الحشرات. أنه سوف يكون مفيداً بشكل خاص لاختبار المرشحين المحتملين من المخدرات لمكافحة الحشرات. استخدام التقنيات المعدلة وراثيا في الحشرات للتعبير عن البروتينات مراسل محددة في الجسم الدهون تروفوسيتيس سوف تفتح طرق جديدة لتطوير المقايسة قوية لدراسة فسيولوجيا الجسم الدهون.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scissors	Fiskars	83872
Fly pad	Genesee Scientific	789060
Battery-powered aspirator w/ collection vial	Hausherrs Machine Works, Inc.	3740-01-210-2368
Fine tip forceps	World Precision Instruments, Inc.	500085
Light microscope	Leica Microsystems
96 well plate	Sigma	CL S3383
Sucrose	Sigma	S9378
Alanine	Sigma	A7627
Arginine	Sigma	A5006
Asparagine	Sigma	A0884
Aspartic Acid	Sigma	A9256
Cysteine	Sigma	W326305
Glutamic Acid	Sigma	G1251
Glutamine	Sigma	G3126
Glycine	Sigma	G2879
Histidine	Sigma	H6034
Isoleucine	Sigma	I2752
Lysine	Sigma	L5501
Leucine	Sigma	L8000
Phenylalanine	Sigma	P2126
Proline	Sigma	P0380
Serine	Sigma	S4500
Threonine	Sigma	T8625
Tryptophan	Sigma	T0254
Tyrosine	Sigma	T3754
Valine	Sigma	V0500
Methionine	Sigma	M9625
NaCl	Sigma	S7653
KCl	Sigma	P9333
MgCl2-6H2O	Sigma	M2670
NaHCO3	Sigma	S5761
CaCl2-2H2O	Sigma	C8106
Tris pH8.0	Sigma	T1503
EDTA	Sigma	E6758
ddH2O	Sigma	W4502