Sistema de cultivo de órganos de grasa corporal en Aedes Aegypti, Vector del Virus Zika

Resumen

La grasa corporal es el órgano metabólico central en insectos. Presentamos un sistema de cultivo de órgano vivo que permite al usuario estudiar las respuestas del tejido corporal de grasa aislados a varios estímulos.

Resumen

El insecto grasa corporal desempeña un papel central en el metabolismo de insectos y almacenamiento de nutrientes, reflejo de las funciones del hígado y del tejido graso en los vertebrados. Insectos cuerpo grasa tejido generalmente se distribuye en todo el cuerpo del insecto. Sin embargo, a menudo es concentrada en el abdomen y atado a la pared abdominal del cuerpo.

El mosquito grasa corporal es la única fuente de proteínas de la yema de huevo, que son críticos para la producción de huevo. Por lo tanto, el cultivo en vitro de los tejidos de grasa corporal de mosquito representa un sistema importante para el estudio de la fisiología del mosquito, metabolismo y, en última instancia, la producción de huevos. El proceso de cultura de la grasa corporal comienza con la preparación de soluciones y reactivos, incluyendo soluciones del aminoácido, Aedes suero fisiológico solución stock (APS), solución madre de calcio y grasa corporal medio de cultivo. El proceso continúa con la disección de la grasa corporal, seguida de un tratamiento experimental. Después del tratamiento, puede realizarse una variedad de diferentes análisis, incluyendo RNA (RNA-Seq) de la secuencia, qPCR, Western Blot, proteómica y metabolómica.

En nuestro experimento ejemplo, demostramos el protocolo a través de la supresión y la cultura de cuerpos grasos del mosquito de la fiebre amarilla, Aedes aegypti, principal vector de arbovirus incluyendo Zika, dengue y chikungunya. ARN de cuerpos grasos cultivadas bajo una condición fisiológica conocida a proteínas de yema de huevo alza versus el control fueron sometidos a análisis de RNA-Seq para demostrar la potencial utilidad de este procedimiento para las investigaciones de la expresión génica.

Introducción

Los mosquitos son vectores de enfermedades humanas devastadoras, incluyendo la malaria, dengue, Fiebre chikungunya y Zika^1,2,3. A pesar de intensos esfuerzos internacionales para frenar estas enfermedades y para controlar las poblaciones de mosquitos transmisores de enfermedades, brotes epidémicos de enfermedades transmitidas por el mosquito son aún campo común, especialmente en los países en desarrollo. Vacunas efectivas contra muchas de estas enfermedades son de carácter o de eficacia limitada^4,5. La forma más efectiva para prevenir brotes es controlar las poblaciones de mosquitos, principalmente mediante el uso de tratamientos insecticidas. Sin embargo, la resistencia a los insecticidas ha desarrollado en muchas poblaciones de mosquitos y convertido en un problema común en el mundo^6,7,8. El estudio de la fisiología del mosquito es esencial para el desarrollo de nuevas herramientas y estrategias para el control de la enfermedad.

El mosquito grasa corporal desempeña un papel central en el almacenamiento de nutrientes, la homeostasis metabólica, reproducción y xenobióticos catabolismo^9,10,11,12. Es el órgano de almacenamiento principal para triglicéridos, glucógeno y aminoácidos en forma de proteínas de almacenamiento de información. También funciona como lugar de síntesis para la mayoría de las proteínas de la hemolinfa y metabolitos. En los mosquitos, la grasa corporal es la única fuente de producción de proteínas de yema de huevo que se produce en las mujeres después de que una comida de sangre^13,14.

El tipo de célula principal de la grasa corporal es la trophocyte grande, poliploide o adipocito^3,9,10,12. Tejido de la grasa corporal se organiza en lóbulos o vainas y puede encontrarse en todas partes del cuerpo del mosquito, con la porción más grande situada en el abdomen, donde grandes lóbulos de grasa corporal se adhieren a la pared abdominal del cuerpo.

El sistema de cultivo de mosquitos grasa corporal presentado aquí fue desarrollado en los años 70 y sigue siendo una poderosa herramienta para el estudio de grasa corporal fisiología¹⁰, especialmente en combinación con las tecnologías actuales de análisis. El fundamento de esta técnica se basa en el aislamiento de las paredes abdominales del cuerpo y el tejido de grasa corporal asociada. La naturaleza hidrofóbica de la cutícula abdominal hace que flote en la superficie del medio de cultivo, con los lóbulos conectados de abdominal grasa corporal sumergido. Los espiráculos y la estructura tracheolar se mantienen, asegurando la oxigenación de los tejidos cultivados. En adelante, nos referiremos a estas preparaciones como "cuerpos grasos". Cuerpos aislados de grasa permanecen viables durante más de 12 horas cuando se incuban en medio apropiado (resultados no publicados). Cultura de la grasa corporal es una herramienta valiosa que ha abordado una variedad de preguntas sobre grasa corporal Endocrinología y fisiología^{9,10,12,15,16, 17}.

Cuerpos grasos cultivados puede someterse a varios experimentales y control de tratamientos, el momento en que puede ser decidido por el investigador. Al final de la incubación, los órganos de grasa puede recabados y tratados para los análisis posteriores, incluyendo qPCR^16,17,18,19, Western Blot^{18 ,20},²¹de la proteómica o metabolómica²². Experimentos pueden realizarse en diferentes escalas, desde cuerpos de grasa individuales a grupos de cientos que pueden ser cultivadas juntas.

Los resultados representativos incluidos aquí fueron derivados de cuerpos grasos, cultivados en presencia de los aminoácidos y la ecdisona 20-hidroxi de la hormona esteroide para simular la activación de la harina de sangre de vitelogénesis^{16,17, 23,24}. Había analizado y había comparado la expresión génica diferencial de no activado versus activados cuerpos grasos mediante análisis de secuenciación de próxima generación.

Protocolo

1. preparación de las soluciones y reactivos

1. solución madre de ácido Amino
   1. preparar 4 X aminoácidos solución ^{23 , 24} por peso y agregar los 20 aminoácidos diferentes a un matraz de Erlenmeyer según las concentraciones dadas en la tabla 1.
      Nota: En algunos casos, amino acid(s) puede ser excluido de la solución y sustituido por cantidades molares iguales de manitol para mantener una concentración igual de osmolitos.
   2. Añadir la cantidad apropiada de ddH ₂ O para producir el volumen deseado de solución.
   3. Para asegurarse de que los aminoácidos han disuelto completamente, calentar suavemente agitando continuamente hasta que el líquido quede totalmente claro, tendrá un leve tono amarillo.
      Nota: Puede ser necesario reducir el pH a 6 mediante la adición de ácido clorhídrico para permitir que algunos de los aminoácidos más hidrofóbicos para disolver.
   4. Alicuotar la solución y filtro estéril usando un filtro de jeringa con un 0.2 μm tamaño de poro.
   5. Almacén en un envase sellado a-20 ° C hasta por 6 meses.
2. APS
   Nota: ver ²⁵.
   1. Para el 20 X sal solución, combinar las sales enumeradas en la tabla 2 en 50 mL de agua. Mezclar hasta que se haya disuelto por completo.
      Nota: Puede ser necesario calentar ligeramente la solución para disolver completamente las sales.
   2. Filtro estéril usando un filtro de jeringa con un 0.2 μm tamaño de poro y guarde la solución en un tubo de 50 mL a -20 ° C.
3. Solución calcio
   1. para 50 X solución calcio, añadir a 100 mL de agua (tabla 3) 0,90 g de cloruro de calcio, mezclar hasta que se disuelva completamente.
   2. Utilizando una jeringa estéril-filtro filtro con un tamaño de poro de 0.2 μm, alícuota de la solución en tubos de 50 mL y almacenar a -20 ° C.
4. Buffer Tris (pH 7.4)
   1. para el Tris almacenador intermediario, combinar las soluciones enumeradas en la tabla 4 y sal y añadir ddH ₂ O hasta 100 mL.
   2. Utilizando una jeringa estéril-filtro filtro con un tamaño de poro de 0,2 μm y una parte alícuota de la solución en tubos de 50 mL, almacenar a temperatura ambiente.
5. Grasa corporal medio de cultivo
   1. para preparar el medio de cultivo de la grasa corporal, preparar todas las soluciones mencionadas.
   2. Combinar según los volúmenes en la tabla 5 para hacer 200 mL de medio de cultivo de la grasa corporal.
   3. Ajustar el pH a 7.2 con NaOH o HCl.
   4. Filtro estéril la solución utilizando un filtro de jeringa con un tamaño de poro de 0.2 μm.
   5. Dividir la solución en alícuotas de 15 mL y almacenar a-20 ° C hasta por 6 meses.

2. Preparación para la disección

1. preparar un estereomicroscopio (aumento de x 10-20) con la iluminación y colocar dos pinzas muy finas y un par de tijeras de disección micro.
2. Preparar todas las soluciones necesarias para el experimento. Descongelar el medio de cultivo de la grasa corporal a temperatura ambiente.
   Nota: Los precipitados pueden disolver calentando suavemente la solución a no superior a 30 ° C.
3. Con un aspirador, recoger los mosquitos hembras adultos (3-7 días después de la emergencia) y anestesiarlos usando dióxido de carbono o hielo.
   Nota: Una vez anestesiados, los mosquitos deben guardarse bajo CO ₂ para el menor tiempo posibles, no superior a 20 minutos o bien, los mosquitos pueden ser anestesiados en hielo y durante aproximadamente 30 minutos
4. Prepare una placa de la pozo de 6 con 3 mL de APS por bien.

3. Disección de la grasa corporal

1. enfocar la disección Estereomicroscopio y ajustar la silla a una altura cómoda.
2. Colocar un portaobjetos cóncavo en la superficie de microscopio y añadir dos gotas de APS para el centro.
3. Recoger un mosquito por una pierna usando un fórceps y transferirla a la superficie de la APS en el portaobjetos.
4. Cuidadosamente y agarre el mosquito por el tórax, con las pinzas en la mano izquierda y gire el mosquito para que el lado ventral hacia arriba.
5. Sosteniendo el cuerpo constante por el tórax, sujete los dos últimos segmentos abdominales, con las pinzas en la mano derecha y tire suavemente de.
   Nota: Los dos últimos segmentos abdominales va a separar del abdomen y los ovarios adjuntos, Malpighi túbulos, hindgut y midgut; a veces el cultivo se deslizará fuera del abdomen. Si no han sido removidos, inserte las puntas cerradas de las pinzas en el pequeño orificio creado y remover el tejido restante.
6. Apartar la pinza derecha y coger las tijeras de la primavera. Deslice una hoja en el orificio en el abdomen hasta el segmento a continuación del tórax. Suavemente y rápidamente cortar el abdomen longitudinalmente.
   Nota: Una vez realizado el corte, el abdomen debe comenzar a expandirse hacia el exterior, aunque esto puede no ocurrir inmediatamente.
7. Proceder a realizar el segundo corte, que será un corte lateral por debajo del tórax y ligeramente por debajo de donde terminó el primer corte.
   Nota: El abdomen debe abrir y disociar el tórax, con la cutícula hacia arriba y los órganos de grasa lado inmerso dentro de la APS. Este cuerpo de la pared abdominal es la preparación de la grasa corporal en vitro cultura.
8. Levante los cuerpos grasos de la solución APS con la punta de un par de pinzas y transferirlas desde la solución a la placa de 6 pozos con APS a temperatura ambiente. Permitir que el tejido reposar aproximadamente 0,5 h antes de avanzar a la cultura de la grasa corporal.

4. Grasa corporal cultura

1. incubar los cuerpos grasos en APS a temperatura ambiente durante por lo menos 0.5 h a que se equilibren los.
2. Transferir los órganos de grasa utilizando la punta de las pinzas y con cuidado saque la solución APS. Bajar la punta en el medio de cultivo de grasa corporal.
   Nota: La grasa corporal debe abrir en la superficie del medio y flotar libremente. La cultura de la grasa corporal se realiza generalmente en placas de 96 pocillos, con 150-200 μL de medio en cada pozo. Uno bien puede caber hasta tres cuerpos individuales de la grasa, y son viables por más de 12 h (no publicados resultados personales).
3. Después de la incubación, transferir los órganos de grasa del medio en tubos de centrífuga de 1,5 mL que contienen los reactivos adecuados para el procesamiento de abajo.
   Nota: Los análisis típicos incluyen qPCR ^{16 , 17 , 18 , 19}, Western Blot ^{18 , 20}, ²⁶ de la transcriptómica, proteómica ²¹ o metabolómica ²².

Resultados

Como ejemplo, realizamos un experimento de cultivo de la grasa corporal y estimulados cuerpos aislados de grasa por la incubación en una solución que contiene una mezcla equilibrada de los veinte aminoácidos que ocurren naturalmente y la ecdisona 20-hidroxi de insectos hormona esteroide (10 μm) durante 6 h . Como control, cuerpos grasos se incubaron en APS para la misma cantidad de tiempo.

Después de la incubación, el RNA total fue aislado usando un tri-reactivo²⁷ siguiendo las instrucciones del fabricante. La calidad y cantidad de muestras de RNA extraídas se evaluaron utilizando un espectrofotómetro, cuantificación fluorométrica y electroforesis en gel de agarosa. Las bibliotecas de la secuencia de RNA se generaron usando 4 μg de ARN total y se cuantificaron usando dos técnicas diferentes. Posteriormente, las bibliotecas fueron enviadas a un proveedor comercial de secuenciación del extremo apareado.

Los resultados de este experimento se muestran en la tabla 6. Genes que muestran la más fuerte respuesta transcripcional a aminoácidos y 20-hydroxyecdysone fueron principalmente yema proteína los genes, que está de acuerdo con anteriores resultados¹¹.

La figura 1 muestra un mapa que indica los niveles de expresión de gene de 1.256 diferencialmente expresados genes de cuerpos grasos cultivados después de dos tratamientos diferentes.

Figura 1 . Mapa de genes expresados en la cultura de la grasa corporal. El mapa de calor se calculó con base en el número de las transcripciones específicas para cada gen en las diferentes bibliotecas con el mapa de calor paquete²⁸ que es parte del entorno de software de R. La sombra más oscura representa la mayor expresión de genes. 1.256 genes con variación estadísticamente significativa en la expresión (valores de Q < 0.05) se muestran. Los genes se ordenan según su nivel de expresión promedio, indicada por el dendrograma de la izquierda (no según sus relaciones filogenéticas). Tenga en cuenta el elevado número de genes con expresión regulada hacia arriba o abajo después del estímulo con aminoácidos (AA) y 20-hydroxyecdysone (20E). APS = Aedes fisiológico. Ver archivo suplementario 1 para una lista de genes y su expresión relativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Del aminoácido	Peso molecular g/mol	m concentración	mg por litro	mg de volumen 300 mL
Alanina	89.1	26.68	2377.19	713.16
Arginina	174.2	26.68	4647.66	1394.3
Asparragina	150.1	26.68	4004.67	1201.4
Ácido aspártico	133	26.68	3548.44	1064.53
Cisteína	121.16	10.68	1293.99	388.2
Ácido glutámico	147.1	26.68	3924.63	1177.39
Glutamina	146	26.68	3895.28	1168.58
Glicina	75	53.32	3999	1199.7
Histidina	155.16	80	12412.8	3723.84
Isoleucina	131	10.68	1399.08	419.72
Lycine	183	26.68	4882.44	1464.73
Leucina	131	26.68	3495.08	1048.52
Fenilalanina	165	10.68	1762.2	528.66
Prolina	115	26.68	3068.2	920.46
Serina	105	53.32	5598.6	1679.58
Treonina	119	10.68	1270.92	381.28
Triptófano	204	10.68	2178.72	653.62
Tirosina	181	5.32	962.92	288.88
Valina	117	10.68	1249.56	374.87
Metionina	149	10.68	1591.32	477.4

Tabla 1. 4 solución madre de ácido Amino.

Componente	Peso en gramos a 50 ml ddH2O
NaCl	8.0 g
KCl	g 0,074
MgCl2-6 H2O	0,120 g
NaHCO3	0,0250 g

Tabla 2. 20 X sal solución.

Componente	Peso en gramos agregados a 100 ml ddH2O
CaCl2-2 H2O	g 0,90

g > tabla 3. 50 x solución calcio.

Componente	Concentración de la solución madre	Valores de volumen de 100 ml de tampón
PH8.0 Tris	1 M	5 mL
EDTA	0.25 M	2 mL
NaCl	NA	0.3 g
ddH2O	NA	a 100 mL (~ 93 mL)

Cuadro 4. Tampón Tris.

Componente	Valores de volumen de 200 ml
Solución madre de ácido amino	150 mL
Solución de sal común	10 mL
Calcio solución	4 mL
TES Buffer	10 mL
ddH2O	26 mL

Tabla 5. Medio de cultivo de la grasa corporal.

Anotación	Descripción gene	Doble cambio	Valor de P
AAEL006138	Vitelogenina-B	3443	2.52E-112
AAEL006126	Vitelogenina-C	2795	8.64E-91
AAEL006563	Carboxipeptidasa vitelogénicos	1002	2.17E-119
AAEL010434	Vitelogenina-A	220	1.14E-27
AAEL006542	Carboxipeptidasa vitelogénicos	185	2.14E-65
AAEL012678	AAEL003006-PA [Aedes aegypti](65%)	96	4.00E-70
AAEL000080	proteína hipotética	82	6.69E-188
AAEL015312	Vitelógenas catepsina B	77	1.27E-15
AAEL009588	receptor nuclear 3	75	4.58E-56
AAEL010529	proteína hipotética	66	1.32E-29

Tabla 6. Experimentales resultados.

Archivo suplementario 1. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Cultivo insectos se utiliza ampliamente para el estudio de Endocrinología de insectos, el desarrollo y metabolismo, así como a investigar la interacción entre órganos específicos y simbiontes bacterianos^{29,30,31, 32,33,34}. Cultivo in vitro grasa corporal se utilizó específicamente para estudiar el transporte de aminoácidos y la regulación de la producción de proteínas de yema de huevo en los mosquitos y otros dípteros^{16,17,35 , 36}. durante el proceso de vitelogénesis, el mosquito grasa corporal utiliza una gran variedad de transportadores de aminoácidos de alta especificidad para importar los aminoácidos derivados de la harina de sangre de la hemolinfa para sintetizar grandes cantidades de proteínas de yema de huevo^{12 ,19,35,36}. Grasa corporal cultura contribuyó a la determinación de los requerimientos nutricionales de la grasa corporal en este contexto¹⁸.

La calidad del material de partida, los mosquitos hembra, es fundamental para el éxito de estos experimentos. Larvas de mosquitos criados en condiciones de hacinamiento bajo y alimentados con dietas altas en nutrientes generalmente producen los mejores resultados. Existen algunas variables importantes a tener en cuenta al establecer las condiciones de cultivo de mosquitos grasa corporal en el laboratorio en cuanto al diseño experimental. Hemos mostrado en estudios anteriores que la expresión de genes de la grasa corporal varía significativamente dependiendo de la historia de la vida individual y el estado nutricional de los mosquitos^11,22. Las condiciones de cultivo del mosquito deben ser uniformes y para reducir la variabilidad en el tamaño y las reservas nutricionales de los mosquitos experimentales. Además, personal que realiza las disecciones debería ser entrenado para disecciones rápidas y exactas con resultados consistentes. Viabilidad celular en cuerpos aislados de grasa puede ser comprobado utilizando de^37,de métodos de tinción diferentes³⁸.

El diseño experimental de un experimento de cultivo de grasa corporal debe tener en cuenta el número de disecciones posible en un determinado período de tiempo. Cuando grandes cantidades de cuerpos grasos son necesarias, pueden ser necesarios varias sesiones de disección o disectores múltiples. Hay una amplia gama de aplicaciones futuras en vitro cultura de grasa corporal de los mosquitos y otros insectos. Será especialmente útil para probar posibles candidatos de medicamentos para control de insectos. El uso de técnicas transgénicas en insectos para expresar proteínas específicas reportero en trophocytes grasa corporal abrirá nuevos métodos para el desarrollo de pruebas biológicas de gran alcance para el estudio de la fisiología de la grasa corporal.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scissors	Fiskars	83872
Fly pad	Genesee Scientific	789060
Battery-powered aspirator w/ collection vial	Hausherrs Machine Works, Inc.	3740-01-210-2368
Fine tip forceps	World Precision Instruments, Inc.	500085
Light microscope	Leica Microsystems
96 well plate	Sigma	CL S3383
Sucrose	Sigma	S9378
Alanine	Sigma	A7627
Arginine	Sigma	A5006
Asparagine	Sigma	A0884
Aspartic Acid	Sigma	A9256
Cysteine	Sigma	W326305
Glutamic Acid	Sigma	G1251
Glutamine	Sigma	G3126
Glycine	Sigma	G2879
Histidine	Sigma	H6034
Isoleucine	Sigma	I2752
Lysine	Sigma	L5501
Leucine	Sigma	L8000
Phenylalanine	Sigma	P2126
Proline	Sigma	P0380
Serine	Sigma	S4500
Threonine	Sigma	T8625
Tryptophan	Sigma	T0254
Tyrosine	Sigma	T3754
Valine	Sigma	V0500
Methionine	Sigma	M9625
NaCl	Sigma	S7653
KCl	Sigma	P9333
MgCl2-6H2O	Sigma	M2670
NaHCO3	Sigma	S5761
CaCl2-2H2O	Sigma	C8106
Tris pH8.0	Sigma	T1503
EDTA	Sigma	E6758
ddH2O	Sigma	W4502