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  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
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  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il grasso corporeo è l'organo metabolico centrale negli insetti. Vi presentiamo un sistema di cultura dal vivo organo che consente all'utente di studiare le risposte del corpo grasso isolato tessuto ai vari stimoli.

Abstract

Il corpo di grasso insetto svolge un ruolo centrale nel metabolismo dell'insetto e deposito dei nutrienti, funzioni del fegato e tessuto adiposo nei vertebrati di mirroring. Insetto grasso corpo tessuto di solito è distribuito in tutto il corpo dell'insetto. Tuttavia, è spesso concentrata nell'addome e collegato alla parete addominale del corpo.

Il corpo di grasso di zanzara è l'unica fonte di proteine di tuorlo, che sono critici per la produzione di uova. Di conseguenza, la cultura in vitro dei tessuti del corpo grasso di zanzara rappresenta un importante sistema per lo studio della fisiologia di zanzara, metabolismo e, in definitiva, la produzione di uova. Il processo di cultura del corpo grasso inizia con la preparazione di soluzioni e reagenti, incluse soluzioni di riserva dell'amminoacido Aedes soluzione fisiologica salina (APS), soluzione di riserva di calcio e terreno di coltura del grasso corporeo. Il processo continua con la dissezione del grasso corporeo, seguita da un trattamento sperimentale. Dopo il trattamento, può essere eseguita una varietà di diverse analisi, tra cui RNA (RNA-Seq) di sequenziamento, qPCR, Western blot, proteomica e metabolomica.

Nel nostro esperimento di esempio, dimostriamo il protocollo tramite l'asportazione e la cultura dei corpi grassi dalla zanzara di febbre gialla, Aedes aegypti, una principale vettore di arbovirus incluse Zika dengue e chikungunya. RNA da corpi grassi coltivate sotto una condizione fisiologica nota alle proteine di tuorlo upregulate contro il controllo sono stati oggetto di analisi di RNA-Seq per dimostrare la potenziale utilità di questa procedura per le indagini dell'espressione genica.

Introduzione

Le zanzare sono vettori di malattie umane devastanti, tra cui la malaria, la febbre dengue, chikungunya e Zika1,2,3. Nonostante gli sforzi internazionali intensi per frenare queste malattie e per controllare le popolazioni di zanzara trasmette la malattia, scoppi epidemici di malattie trasmesse dalle zanzare sono ancora comuni, soprattutto nei paesi in via di sviluppo. Vaccini efficaci contro molte di queste malattie sono disponibili o di efficacia limitata4,5. Il modo più efficace per prevenire focolai è quello di controllare le popolazioni di zanzare, soprattutto attraverso l'uso di trattamenti insetticidi. Tuttavia, resistenza agli insetticidi ha sviluppato in molte popolazioni di zanzare e diventato un problema comune in tutto il mondo6,7,8. Lo studio della fisiologia di zanzara è essenziale per lo sviluppo di nuovi strumenti e strategie per controllare la malattia.

Il corpo di grasso di zanzara svolge un ruolo centrale nel deposito dei nutrienti, omeostasi metabolica, riproduzione e xenobiotici catabolismo9,10,11,12. È l'organo principale di deposito per i trigliceridi, glicogeno e aminoacidi in forma di proteine di deposito. Funziona inoltre come la posizione di sintesi per la maggior parte delle proteine di emolinfa e metaboliti. Nelle zanzare, il grasso corporeo è l'unica fonte di produzione di proteine di tuorlo che si verifica nelle femmine dopo prendono un pasto di sangue13,14.

Il tipo delle cellule principali del corpo grasso è la trophocyte grande, poliploidi o del adipocyte3,9,10,12. Tessuto grasso corporeo è organizzato in lobi o guaine e può essere trovato in tutte le parti del corpo della zanzara, con la più grande parte situata nell'addome, dove grandi lobi di grasso corporeo sono attaccati alla parete addominale del corpo.

Il sistema di cultura del corpo grasso zanzara presentato qui è stato sviluppato negli anni ' 70 e rimane un potente strumento per lo studio della fisiologia grasso corpo10, specialmente in combinazione con le attuali tecnologie di analisi. La Fondazione di questa tecnica è basata sull'isolamento delle pareti addominali corpo e tessuto grasso associato. La natura idrofobica della cuticola addominale induce a galleggiare sulla superficie del terreno di coltura, con i lobi associati del corpo grasso addominale immersi. La struttura tracheolar e gli spiracoli sono tenute, garantendo l'ossigenazione del tessuto coltivato. D'ora in poi, si farà riferimento a queste preparazioni come "corpi grassi." Corpi di grasso isolati rimangono vitali per più di 12 h quando incubate nel mezzo appropriato (dati non pubblicati). Cultura del grasso corporeo è uno strumento prezioso che ha affrontato una serie di domande per quanto riguarda il corpo grasso endocrinologia e fisiologia9,10,12,15,16, 17.

Corpi grassi coltivati possono essere sottoposti a vari sperimentale e controllo trattamenti, la tempistica di cui può essere decisa dallo sperimentatore. Alla fine del periodo d'incubazione, i corpi di grasso possono essere raccolti ed elaborati per analisi successive, tra cui qPCR16,17,18,19, Western blotting18 ,20, proteomica21o22di metabolomica. Esperimenti possono essere eseguiti su scale diverse, da singoli corpi grassi a gruppi di centinaia che possa essere coltivate insieme.

I risultati rappresentativi inclusi in questa sezione sono stati derivati da corpi grassi coltivati in presenza di aminoacidi e l'ecdisone 20-idrossi ormone steroide per simulare l'attivazione di pasto di sangue di vitellogenesi16,17, 23,24. Abbiamo analizzato e confrontato l'espressione genica differenziale di non-attivato contro corpi grassi attivati attraverso l'analisi di sequenziamento di nuova generazione.

Protocollo

1. preparazione delle soluzioni e dei reagenti

  1. soluzione di riserva dell'amminoacido
    1. preparare un 4 X amminoacido soluzione stock 23 , 24 di pesatura e l'aggiunta di 20 aminoacidi differenti per un matraccio di Erlenmeyer secondo le concentrazioni riportati nella tabella 1.
      Nota: In alcuni casi, amino acid(s) possono essere esclusi dalla soluzione e sostituito da uguali quantità molare di mannitolo per mantenere una concentrazione uguale di osmolytes.
    2. Aggiungere la quantità appropriata di ddH 2 O per produrre il volume desiderato della soluzione.
    3. Per garantire che gli aminoacidi hanno completamente dissolto, scaldare leggermente, mescolando continuamente fino a quando il liquido è completamente chiaro; ci vorrà da una leggera tonalità gialla.
      Nota: Potrebbe essere necessario ridurre il pH a 6 con l'aggiunta di HCl per consentire alcuni degli aminoacidi più idrofobi per dissolvere.
    4. Dimensione del poro aliquotare la soluzione e filtro sterile utilizzando un siringa filtro con un-0,2 µm.
    5. Store in un contenitore sigillato a-20 ° C fino a 6 mesi.
  2. APS
    Nota: vedere 25.
    1. Per 20 X soluzione stock di sale, unire i sali elencati nella tabella 2 in 50 mL di acqua. Mescolare fino a completa dissoluzione.
      Nota: Potrebbe essere necessario riscaldare leggermente la soluzione per sciogliere completamente i sali.
    2. Filtro Sterile utilizzando un siringa filtro con un-0,2 µm dimensione dei pori e conservare la soluzione in un tubo da 50 mL a -20 ° C.
  3. Soluzione di riserva di calcio
    1. per i 50 X soluzione di riserva di calcio, aggiungere 0,90 g di cloruro di calcio per 100 mL di acqua (tabella 3); mescolare fino a completa dissoluzione.
    2. Utilizzando una siringa Sterile-filtro del filtro con un diametro dei pori da 0,2 µm, aliquota la soluzione nelle provette da 50 mL e conservare a -20 ° C.
  4. Tampone Tris (pH 7,4)
    1. per il Tris buffer, unire il sale e le soluzioni elencate in tabella 4 e aggiungere ddH 2 O fino a 100 mL.
    2. Utilizzando una siringa Sterile-filtro del filtro con un diametro dei pori da 0,2 µm e aliquota la soluzione nelle provette da 50 mL; conservare a temperatura ambiente.
  5. Terreno di coltura di corpo grasso
    1. per preparare il terreno di coltura del grasso corporeo, preparare tutte le soluzioni elencate in precedenza.
    2. Combinarli secondo i volumi in tabella 5 per fare 200 mL di terreno di coltura del grasso corporeo.
    3. Aggiustare il pH a 7,2 con NaOH o HCl.
    4. Filtro Sterile la soluzione utilizzando un siringa filtro con un diametro dei pori da 0,2 µm.
    5. Dividere la soluzione in 15 mL aliquote e conservare a-20 ° C fino a 6 mesi.

2. Preparazione per la dissezione

  1. preparare uno stereomicroscopio (ingrandimento x 10-20) con illuminazione e stendere due pinzette ultra-sottili e un paio di forbici micro dissezione.
  2. Preparare tutte le soluzioni necessarie per l'esperimento. Scongelare il terreno di coltura di corpo grasso a temperatura ambiente.
    Nota: Precipitanti possono essere dissolto riscaldando delicatamente la soluzione per non superiore ai 30 ° C.
  3. Con un aspiratore, raccogliere le zanzare femmina adulte (3-7 giorni dopo l'emersione) e anestetizzare li utilizzando anidride carbonica o Ice.
    Nota: Una volta anestetizzato, le zanzare devono essere tenute sotto CO 2 per il minor tempo possibile, non superiore a 20 min. in alternativa, le zanzare possono essere anestetizzate sul ghiaccio e tenute per circa 30 min.
  4. Preparare una piastra a 6 pozzetti con 3 mL di APS per pozzetto.

3. Dissezione del corpo grasso

  1. lo stereomicroscopio per dissezione a fuoco e regolare la sedia ad un'altezza confortevole.
  2. Mettere un vetrino concavo sulla superficie del microscopio e aggiungere due gocce di APS al centro.
  3. Pick up una zanzara di una gamba per mezzo di un forcipe e trasferirlo sulla superficie di APS sul vetrino da microscopio.
  4. Attentamente afferrare la zanzara per il torace, con la pinza nella mano sinistra e ruotare la zanzara, in modo che il lato ventrale è verso l'alto.
  5. Tenendo il corpo costante di torace, afferrare i due ultimi segmenti addominali, con la pinza nella mano destra e tirare delicatamente.
    Nota: Gli ultimi due segmenti addominali separerà dall'addome e l'annesso ovaie, Malpighian tubuli, del hindgut e del midgut; a volte il raccolto scivolerà fuori l'addome. Se non sono state rimosse, inserire le punte chiuse delle pinze nel piccolo foro creato e rimuovere i restanti tessuti.
  6. Accantonare la pinza destra e prendere le forbici di primavera. Infilare una lama nel foro nell'addome fino al segmento sotto il torace. Delicatamente e rapidamente tagliare longitudinalmente l'addome.
    Nota: Una volta effettuato il taglio, l'addome dovrebbe cominciare ad espandere verso l'esterno, anche se questo potrebbe non verificarsi immediatamente.
  7. Procedere per rendere il secondo taglio, che sarà un taglio laterale sotto il torace e leggermente di sotto di dove si è concluso il primo taglio.
    Nota: L'addome dovrebbe quindi aprire e dissociare dal torace, con la cuticola fino e i corpi di grasso lato-immersi all'interno l'APS. Questa corpo della parete addominale è la preparazione del grasso corporeo per la coltura in vitro.
  8. Sollevare i corpi grassi dalla soluzione APS con la punta di un paio di pinze e trasferirli dalla soluzione alla piastra 6 pozzetti contenenti APS a temperatura ambiente. Consentire il tessuto a riposare per circa 0,5 h prima di avanzare la cultura del grasso corporeo.

4. Cultura del grasso di corpo

  1. Incubare i corpi grassi su APS a temperatura ambiente per almeno 0,5 h equilibrare li.
  2. Trasferire i corpi grassi usando la punta delle pinze e sollevare delicatamente li fuori la soluzione APS. Abbassare la punta nel terreno di coltura del grasso corporeo.
    Nota: Il grasso corporeo dovrebbe aprire sulla superficie del mezzo e galleggiare liberamente. La cultura del grasso corporeo viene in genere eseguita in piastre da 96 pozzetti, con 150-200 µ l di terreno in ciascun pozzetto. Uno ben può montare fino a tre singoli corpi grassi, e sono valide per più di 12 h (risultati personali non pubblicati).
  3. Dopo il periodo di incubazione, trasferire i corpi grassi dal mezzo in provette da 1,5 mL Centrifuga contenente i reagenti appropriati per l'elaborazione a valle.
    Nota: Analisi tipiche includono qPCR 16 , 17 , 18 , 19, Western blotting 18 , 20, 26 di trascrittomica, proteomica 21 o metabolomica 22.

Risultati

Ad esempio, abbiamo eseguito un esperimento di cultura del grasso corporeo e stimolato corpi grassi isolati da incubarle in una soluzione contenente una miscela equilibrata di tutti i venti amminoacidi naturali e l'ecdisone 20-idrossi insetto dell'ormone steroide (10 µM) per 6 h . Come controllo, corpi grassi sono stati incubati su APS per un uguale periodo di tempo.

Dopo l'incubazione, il RNA totale è stato isolato mediante un tri-reagente27 seguendo le istruzioni del produttore. La qualità e la quantità di campioni di RNA estratti sono stati valutati utilizzando un spettrofotometro, fluorometrica e l'elettroforesi del gel dell'agarosi. Librerie di sequenziamento di RNA sono state generate utilizzando 4 µ g di RNA totale e sono state quantificate utilizzando due tecniche differenti. Successivamente, le librerie sono state inviate a un provider commerciale per fine-sequenziamento accoppiato.

I risultati di questo esperimento sono riportati nella tabella 6. Geni che mostra la più forte risposta trascrizionale dell'aminoacido e 20-hydroxyecdysone erano principalmente tuorlo geni della proteina, che è in accordo con precedenti risultati11.

La figura 1 Mostra una mappa di calore che indica i livelli di espressione genica di 1.256 differenzialmente espressi geni da corpi grassi coltivati dopo due trattamenti diversi.

figure-results-1731
Figura 1 . Mappa di calore di geni espressi nella cultura del grasso corporeo. La mappa di calore è stata calcolata in base al numero di specifici trascritti per ogni gene in librerie diverse utilizzando heatmap pacchetto28 che è parte dell'ambiente software R. La tonalità più scura rappresenta la maggiore espressione del gene. 1.256 geni con variazione statisticamente significativa nell'espressione (valori di Q < 0.05) vengono visualizzati. I geni sono ordinati secondo i loro livelli di espressione media, indicati dal dendrogramma sulla sinistra (non secondo il loro relazioni filogenetiche). Si noti l'elevato numero di geni con espressione up - o down-regolati dopo stimolazione con gli aminoacidi (AA) e 20-hydroxyecdysone (20E). APS = Aedes fisiologica. Per un elenco dei geni e dei loro livelli di espressione relativa, vedere Supplemental File 1 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

AminoacidoPeso molecolare g/molmM concentrazionemg per litromg per 300 mL di volume
Alanina89.126,682377.19713.16
Arginina174,226,684647.661394.3
Asparagina150.126,684004.671201.4
Acido aspartico13326,683548.441064.53
Cisteina121,1610.681293.99388,2
Acido glutammico147.126,683924.631177.39
Glutammina14626,683895.281168.58
Glicina7553.3239991199.7
Istidina155,168012412.83723.84
Isoleucina13110.681399.08419.72
Lisina18326,684882.441464.73
Leucina13126,683495.081048.52
Fenilalanina16510.681762.2528.66
Prolina11526,683068.2920.46
Serina10553.325598.61679.58
Treonina11910.681270.92381.28
Triptofano20410.682178.72653.62
Tirosina1815,32962.92288.88
Valina11710.681249.56374.87
Metionina14910.681591.32477.4

Tabella 1. 4 x soluzione stock dell'aminoacido.

ComponentePeso in grammi 50 ml ddH2O aggiunti
NaCl8,0 g
KCl0,074 g
MgCl2-6 H2O0,120 g
NaHCO30,0250 g

Tabella 2. 20 X sale soluzione stock.

ComponentePeso in grammi aggiunti a 100 ml ddH2O
CaCl2-2 H2O0,90 g

g > tabella 3. 50 x soluzione stock calcio.

ComponenteConcentrazione della soluzione di riservaStock volume 100 ml di tampone
Tris pH8.01 M5 mL
EDTA0,25 M2 mL
NaClNA0,3 g
ddH2ONAa 100 mL (~ 93 mL)

Tabella 4. Tampone Tris.

ComponenteStock volume 200ml
Soluzione di riserva dell'amminoacido150 mL
Soluzione di riserva di sale10 mL
Soluzione di riserva di calcio4 mL
Buffer TES10 mL
ddH2O26 mL

Tabella 5. Terreno di coltura del grasso corporeo.

AnnotazioneDescrizione del genePiegare il cambiamentoValore di P
AAEL006138Vitellogenina-B34432.52E-112
AAEL006126Vitellogenina-C27958.64E-91
AAEL006563vitellogeniche carbossipeptidasi10022.17E-119
AAEL010434Vitellogenina-A2201.14E-27
AAEL006542vitellogeniche carbossipeptidasi1852.14E-65
AAEL012678AAEL003006-PA [Aedes aegypti](65%)964.00 E-70
AAEL000080proteina ipotetica826.69E-188
AAEL015312Vitellogeniche catepsina B771.27E-15
AAEL009588recettore nucleare 3754.58E-56
AAEL010529proteina ipotetica661.32E-29

Tabella 6. Risultati sperimentali.

File supplementare 1. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Cultura di organo insetto fu ampiamente utilizzato per lo studio di Endocrinologia dell'insetto, sviluppo e metabolismo, nonché di studiare l'interazione tra organi specifici e batteri simbionti29,30,31, 32,33,34. In vitro coltura di organo di grasso corporeo è stato utilizzato specificamente per studiare il trasporto dell'aminoacido e la regolazione della produzione di proteine di tuorlo in zanzare e altri Ditteri16,17,35 , 36. durante il processo di vitellogenesi, il corpo di grasso di zanzara utilizza una matrice di amminoacidi di alta specificità per importare il pasto di sangue-derivati di aminoacidi da emolinfa di sintetizzare grandi quantità di tuorlo proteine12 ,19,35,36. Cultura del grasso corporeo era strumentale alla delineazione dei requisiti nutrizionali del grasso corporeo in questo contesto18.

La qualità della materia prima, le zanzare femmina, è fondamentale per il successo di questi esperimenti. Larve di zanzara, allevati in condizioni di sotto-affollata e alimentati le diete alto-sostanza nutriente di solito producono i migliori risultati. Ci sono alcune importanti variabili da considerare quando si stabilisce condizioni di coltura del grasso corporeo di zanzara in laboratorio in termini di disegno sperimentale. Abbiamo dimostrato in studi precedenti che l'espressione genica del grasso corporeo varia significativamente a seconda della storia di vita individuale e lo stato nutrizionale di zanzara11,22. Le condizioni della coltura zanzara dovrebbero essere uniforme per ridurre la variabilità delle dimensioni e nutrizionali si riserva delle zanzare sperimentale. Inoltre, personale che esegue le dissezioni dovrebbero essere addestrato per garantire le dissezioni rapide e precise con i risultati costanti. Attuabilità delle cellule in corpi isolati di grasso può essere controllato tramite diverse colorazione metodi37,38.

Il disegno sperimentale di un esperimento di cultura del grasso corporeo dovrebbe prendere in considerazione il numero delle dissezioni possibili in un dato periodo di tempo. Quando sono necessarie grandi quantità di corpi grassi, più sessioni di dissezione o dissettori multipli possono essere necessari. C'è una vasta gamma di applicazioni future in vitro del grasso corporeo cultura in zanzare e altri insetti. Sarà particolarmente utile per testare potenziali farmaci candidati per controllo di insetto. L'uso di tecniche transgeniche negli insetti di esprimere proteine reporter specifici nel corpo grasso trophocytes aprirà nuovi metodi per sviluppare potenti analisi biologiche per lo studio della fisiologia del corpo grasso.

Divulgazioni

Non abbiamo nulla di divulgare.

Riconoscimenti

Questa ricerca è stata sostenuta da grant NIH #SC1AI109055, il 2014 NMSU HHMI grant #52008103 e NSF PGR concedere #1238731. Ringraziamo i partecipanti della classe NMSU primavera 2015 BIOL302 molecolare metodi e Lavesh Bhatia, per il loro supporto tecnico con gli esperimenti di cultura del grasso corporeo.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Scissors Fiskars83872
Fly padGenesee Scientific789060
Battery-powered aspirator w/ collection vialHausherrs Machine Works, Inc.3740-01-210-2368
Fine tip forcepsWorld Precision Instruments, Inc. 500085
Light microscope Leica Microsystems
96 well plate SigmaCL S3383
SucroseSigmaS9378
AlanineSigmaA7627
ArginineSigmaA5006
AsparagineSigmaA0884
Aspartic AcidSigmaA9256
CysteineSigmaW326305
Glutamic AcidSigmaG1251
GlutamineSigmaG3126
GlycineSigmaG2879
HistidineSigmaH6034
IsoleucineSigmaI2752
LysineSigmaL5501
LeucineSigmaL8000
PhenylalanineSigmaP2126
ProlineSigmaP0380
SerineSigmaS4500
ThreonineSigmaT8625
TryptophanSigmaT0254
TyrosineSigmaT3754
ValineSigmaV0500
MethionineSigmaM9625
NaClSigmaS7653
KClSigmaP9333
MgCl2-6H2OSigmaM2670
NaHCO3SigmaS5761
CaCl2-2H2OSigmaC8106
Tris pH8.0 SigmaT1503
EDTASigmaE6758
ddH2OSigmaW4502

Riferimenti

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