Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتم عرض المقارنة والاستفادة المثلى من اثنين من أساليب التخصيب دنا النبات العضوي: الطرد المركزي التفاضلي التقليدي وتجزئة من غنا الكلي على أساس حالة مثيلة. نقوم بتقييم كمية الحمض النووي الناتجة والجودة، وإظهار الأداء في قراءة قصيرة الجيل القادم التسلسل، ومناقشة إمكانات للاستخدام في قراءة طويلة تسلسل جزيء واحد.

Abstract

يحتوي الجينوم العضوي النباتي على عناصر كبيرة ومتكررة قد تخضع لعملية الاقتران أو إعادة التركيب لتشكيل هياكل معقدة و / أو شظايا دون الجينومية. توجد جينومات أورغانيلار أيضا في خلطات داخل خلية أو نوع معين من الأنسجة (هيتيروبلاسمي)، وقد تتغير وفرة الأنواع الفرعية في جميع مراحل التنمية أو عندما تكون تحت الضغط (التحول شبه المتكافئ). مطلوب الجيل التالي من تقنيات التسلسل (نغس) للحصول على فهم أعمق لهيكل الجينوم العضوي وظيفة. تستخدم دراسات التسلسل التقليدية عدة طرق للحصول على الحمض النووي العضوي: (1) إذا تم استخدام كمية كبيرة من الأنسجة بدءا، فمن المتجانسة وتعرض الطرد المركزي التفاضلي و / أو تنقية التدرج. (2) إذا تم استخدام كمية أقل من الأنسجة ( أي إذا كانت البذور أو المواد أو الفضاء محدودة)، يتم تنفيذ نفس العملية كما هو الحال في (1)، تليها تضخيم الجينوم كله للحصول على الحمض النووي كافية. (3) التحليل المعلوماتية الحيوية يمكن استخدامها ليقوموبالتالي الحمض النووي الجيني الكلي وتحليل قراءات أورغانيلار. كل هذه الأساليب لها تحديات ومواقف متأصلة. في (1)، قد يكون من الصعب الحصول على كمية كبيرة من الأنسجة بدءا. في (2)، يمكن أن تضخيم الجينوم كله إدخال التحيز التسلسل. وفي (3)، يمكن التماثل بين الجينوم النووية والعضلية التداخل مع التجمع والتحليل. في النباتات ذات الجينومات النووية الكبيرة، من المفيد إثراء الحمض النووي للعضلات للحد من تكاليف التسلسل وتعقيد تسلسل لتحليلات المعلوماتية الحيوية. هنا، قارنا طريقة الطرد المركزي التفاضلية التقليدية مع الطريقة الرابعة، نهج كبغ الميثيل المنسدلة تكييفها، لفصل الحمض النووي الجيني الكلي إلى الكسور النووية والعضلات. كلا الطرازين تعطي الحمض النووي كافية ل نغس، الحمض النووي التي هي المخصب للغاية لتسلسل أورغانيلار، وإن كان بنسب مختلفة في الميتوكوندريا والبلاستيك الكلور. نقدم الأمثل لهذه الأساليب لنسيج أوراق القمح ومناقشة المزايا الرئيسية و دوعيوب كل نهج في سياق مدخلات العينة، وسهولة البروتوكول، وتطبيق المصب.

Introduction

تسلسل الجينوم هو أداة قوية لتشريح الأساس الجيني الكامن وراء الصفات النباتية الهامة. تركز معظم الدراسات التسلسل الجينوم على محتوى الجينوم النووي، حيث أن غالبية الجينات تقع في النواة. ومع ذلك، فإن الجينوم العضوي، بما في ذلك الميتوكوندريا (عبر حقيقيات النوى) والبلاستيدات (في النباتات، والشكل المتخصص، والكلوروبلاست، ويعمل في عملية التمثيل الضوئي) يسهم معلومات وراثية هامة ضرورية لتنمية الكائنات الحية، والاستجابة للضغط، واللياقة البدنية العامة 1 . وعادة ما يتم تضمين جينومات أورغانيلار في الاستخراج الكلي للحمض النووي المقصود لتسلسل الجينوم النووي، على الرغم من أن أساليب للحد من عدد العضيات قبل استخراج الحمض النووي تستخدم أيضا 2 . وقد استخدمت العديد من الدراسات نتائج التسلسل من مجموع الاستخراج غنا لتجميع جينوم أورغانيلار 3 ، 4 ، 5 ،كريف "> 6 ، 7. ومع ذلك، عندما يكون الهدف من الدراسة هو التركيز على الجينوم العضلي، وذلك باستخدام مجموع غنا يزيد من تكاليف التسلسل لأن العديد من يقرأ" فقدت "تسلسل الحمض النووي النووي، وخاصة في النباتات ذات الجينوم النووية الكبيرة ، وعلاوة على ذلك، نظرا للازدواجية ونقل تسلسل الكيس العضلي في الجينوم النووي وبين العضيات، وحل موقف رسم الخرائط الصحيح من تسلسل يقرأ إلى الجينوم الصحيح هو بيوانفورماتيكالي تحدي 2 ، 8. تنقية جينوم عضوي من الجينوم النووي هو واحد استراتيجية للحد من هذه المشاكل.ويمكن استخدام مزيد من الاستراتيجيات المعلوماتية الحيوية لفصل يقرأ تلك الخريطة إلى مناطق التماثل بين الميتوكوندريا والكلوروبلاست.

في حين أن الجينوم العضوي من العديد من الأنواع النباتية قد تم تسلسلها، لا يعرف إلا القليل عن اتساع تنوع جينوم عضويالمتاحة في مجموعات البرية أو في تربية تربية المزارع. ومن المعروف أيضا جينومات أورغانيلار أن تكون الجزيئات الحيوية التي تخضع لإعادة ترتيب هيكلية كبيرة بسبب إعادة التركيب بين تسلسل تكرار 9 . وعلاوة على ذلك، يتم تضمين نسخ متعددة من الجينوم العضلي داخل كل عضلة، وترد عضيات متعددة داخل كل خلية. ليس كل نسخ هذه الجينوم متطابقة، والتي تعرف باسم هيتيروبلاسمي. على النقيض من الصورة الكنسي "الدوائر الرئيسية"، هناك الآن أدلة متزايدة على صورة أكثر تعقيدا من الهياكل الجينوم العضوي، بما في ذلك الدوائر شبه الجينومية، الكروموسومات الخطية، الخطية كونكاتامرس، والهياكل المتفرعة 10 . وتجدر الإشارة إلى أن تجميع الجينوم العضوي النباتي يزداد تعقيدا بسبب أحجامها الكبيرة نسبيا وتكرارها المقلوب والمباشر الكبير.

البروتوكولات التقليدية لعزل العضل، وتنقية الحمض النووي، والجنوم اللاحقة e التسلسل غالبا ما تكون مرهقة وتتطلب كميات كبيرة من إدخال الأنسجة، مع عدة غرامات إلى ما يزيد عن مئات غرام من الأنسجة ورقة الشباب اللازمة كنقطة انطلاق 11 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15 ، 16 ، 17 . وهذا يجعل التسلسل الجينوم العضوي لا يمكن الوصول إليها عندما الأنسجة محدودة. في بعض الحالات، تكون كميات البذور محدودة، مثل عندما يكون ذلك ضروريا للتسلسل على أساس الأجيال أو في الخطوط العقيمة الذكرية التي يجب الحفاظ عليها عبر المعبر. في هذه الحالات، يمكن تنقيته الحمض النووي العضلي ثم تعرض لتضخيم الجينوم كله. ومع ذلك، يمكن أن تضخيم الجينوم كله إدخال التحيز تسلسل كبير، وهو مشكلة خاصة عند تقييم التباين الهيكلي، والهياكل شبه الجينومية، ومستويات هيتيروبلاسمي> 18. وقد ساهمت التطورات الحديثة في إعداد المكتبة للتكنولوجيات التسلسلية القصيرة القراءة في التغلب على الحواجز ذات المدخلات المنخفضة لتجنب تضخيم الجينوم بأكمله. على سبيل المثال، مجموعة إعداد مكتبة إلومينا نكستيرا شت تسمح بأقل من 1 نانوغرام من الحمض النووي لاستخدامها كمدخل 19 . ومع ذلك، فإن الاستعدادات القياسية للمكتبات لتطبيقات تسلسل قراءة طويلة، مثل تقنيات تسلسل باكبيو أو أكسفورد نانوبور، لا تزال تتطلب كمية عالية نسبيا من الحمض النووي المدخلات، والتي يمكن أن تشكل تحديا لتسلسل الجينوم العضوي. في الآونة الأخيرة، تم تطوير بروتوكولات تسلسل جديدة طويلة الصنع الصنع وقراءة طويلة للحد من كميات المدخلات والمساعدة في تسهيل تسلسل الجينوم في العينات حيث الحصول على كميات ميكروغرام من الحمض النووي صعب 20 ، 21 . ومع ذلك، لا يزال الحصول على الوزن الجزيئي عالية، الكسور العضوي النقي لتغذية هذه الاستعدادات مكتبة تحديا.

سعينا رo مقارنة وتحسين التخصيب الحمض النووي العضلي وطرق العزل مناسبة ل نغس دون الحاجة إلى تضخيم الجينوم كله. على وجه التحديد، كان هدفنا هو تحديد أفضل الممارسات لإثراء الحمض النووي العضلي عالي الوزن الجزيئي من مواد البدء المحدودة، مثل عينة فرعية من ورقة. يقدم هذا العمل تحليلا مقارنا لأساليب إثراء الحمض النووي العضوي: (1) تعديل، بروتوكول الطرد المركزي التفاضلي المعدل مقابل (2) بروتوكول تجزئة الحمض النووي على أساس استخدام دنا المتاحة تجاريا كبغ الميثيل ملزم نهج سحب البروتين المجال 22 تطبق على الأنسجة النباتية 23 . نوصي أفضل الممارسات لعزل الحمض النووي العضوي من الأنسجة ورقة القمح، والتي يمكن أن تمتد بسهولة إلى النباتات وأنواع الأنسجة الأخرى.

Protocol

1. جيل من المواد النباتية لعزل أورغانيلار واستخراج الحمض النووي

  1. النمو القياسي لشتلات القمح
    1. بذور النبات في الفيرميكوليت في الأواني الصغيرة، مربع مع 4 - 6 بذور لكل ركن. نقل إلى الدفيئة أو غرفة النمو مع دورة ضوء 16 ساعة، 23 ºC يوم / 18 ºC ليلة.
    2. المياه النباتات كل يوم. تسميد النباتات مع ¼ ملعقة صغيرة من الحبيبية 20-20-20 الأسمدة نيك عند الإنبات وفي 7 أيام بعد الإنبات.
  2. البدائل البديلة لشتلات القمح
    1. اتبع الخطوة 1.1، ولكن وضع الأواني في غرفة النمو المظلمة، 23 درجة مئوية لمدة 16 ساعة / 18 درجة مئوية لمدة 8 ساعات. بدلا من ذلك، تغطية النباتات في الاحتباس الحراري (على سبيل المثال، مع حاوية التخزين، ومع ذلك، يجب الحفاظ على التهوية المناسبة).
  3. النمو وجمع الأنسجة
    1. تنمو النباتات لمدة 12-14 أيام. بالنسبة لمعظم النمط الوراثي للقمحs، 75 - 100 الشتلات تنتج حوالي 10 - 12 غرام من الأنسجة، وهو ما يكفي لاستخراج اثنين من الخلايا العضلية باستخدام طريقة الطرد المركزي التفاضلية (القسم 2). مصنع واحد فقط هو ضروري إذا كان استخدام نهج الحمض النووي كبغ القائم على مثيلة القائم على مثيلة لكسر عضوي من الحمض النووي النووي (القسم 3).
    2. إذا كان استخدام نهج الطرد المركزي التفاضلي، وجمع الأنسجة الطازجة والمضي قدما على الفور لمعالجة العينات، كما هو موضح في القسم 2.
    3. إذا كان استخدام نهج كبغ ميثيل المنسدلة، وحصاد 20 ملغ أقسام من الأنسجة ورقة الشباب إلى أنابيب ميكروسنتريفوج (استخدام إما نمت القياسية أو الأنسجة المعتادة، انظر ممثل النتائج ). تجميد المفاجئة على النيتروجين السائل وتجميد في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. انتقل إلى تجزئة الدنا، كما هو موضح في القسم 3.

2. الطريقة رقم 1: استخراج الحمض النووي باستخدام الطرد المركزي التفاضلي (دس)

ملاحظة: الفرقتم تعديل بروتوكول الطرد المركزي إرجنتي من منشورين أن الظروف الأمثل لعزل كل من العضيات ولكن إثراء للميتوكوندريا 17 ، 24 . والبروتوكول الناتج أقل استهلاكا للوقت ويستخدم عددا أقل من المواد الكيميائية السامة مقارنة بالطرق السابقة. على وجه التحديد، أجرينا تعديلات على المخازن المؤقتة وغسل الخطوات، بما في ذلك إضافة البولي فينيل بيروليدون (بب) إلى العازلة استخراج ستي والقضاء على الخطوة غسل النهائي في نيتف العازلة، والذي يحتوي على فلوريد الصوديوم (ناف).

الحذر: إعداد واستخدام العازلة ستي ينبغي أن يؤديها تحت غطاء الدخان الكيميائية مع معدات الحماية الشخصية المناسبة، وهذا المخزن المؤقت يحتوي على 2-ميركابتويثانول (بمي).

  1. أشياء يجب القيام بها قبل البدء
    1. تأكد من أن جميع المعدات نظيفة للغاية، وأوتوكلاف أي المعدات التي يمكن تعقيمها (على سبيل المثال، طحن اسطوانات، عالية السرعة سنتريأنابيب فوج، الخ ).
      ملاحظة: ينصح نصائح تصفية لجميع الخطوات التي تتطلب بيبتينغ لتجنب انتقال التلوث.
    2. انظر قائمة المعدات والكواشف المطلوبة وإعداد المخازن المؤقتة ومخزونات العمل المطلوبة للطريقة رقم 1 ( الجدول 1 ). برد كتل طحن المبردة إلى -20 درجة مئوية والدوار ومخازن إلى 4 درجة مئوية، تعيين ميكروسنتريفوج إلى 4 درجة مئوية، وتشغيل حمام المياه 37 ºC.
  2. عزل العضيات
    1. حصاد 5 غرام من الأنسجة الطازجة وشطفه في الماء البارد والمعقم في كوب بارد على الجليد.
      ملاحظة: احتفظ دائما بالعينات على الجليد أثناء جميع العمليات وعمليات النقل من وإلى أجهزة الطرد المركزي، وأغطية الدخان، الخ. بدلا من ذلك، العمل في غرفة باردة إذا كان هناك الوصول إلى مساحة كافية والمعدات لتنفيذ البروتوكول.
    2. باستخدام مقص، وقطع الأنسجة الورقية إلى ~ 1 سم قطعة مباشرة إلى أنبوب 50 مل تحتوي على اثنين من طحن السيراميكاسطوانات.
      ملاحظة: تنظيف أو تغيير مقص بين العينات لتجنب التلوث المتبادل.
    3. إذا لم يكن هناك الخالط الأنسجة، واستخدام هاون ومدقة واتبع لتحل محل الخطوات 2.2.4 - 2.2.9.
      1. قطع الأنسجة ورقة إلى هاون قبل المبردة على الجليد. طحن العينات لمدة 2 - 3 دقائق في 15 مل من ستي (في غطاء الدخان).
      2. صب قبالة العازلة (ترك الأنسجة في هاون) من خلال قمع تحتوي على طبقة واحدة من قبل الرطب، القماش الترشيح العقيمة (~ 22- إلى 25 ميكرون حجم المسام؛ انظر البروتوكول الرئيسي لمزيد من التفاصيل) إلى أنبوب 50 مل آخر . إضافة 10 مل إضافية من ستي إلى هاون ومدقة والتجانس مرة أخرى.
      3. صب الأنسجة المتجانسة والعازلة في نفس القمع. شطف هاون ومدقة مع 10 مل من ستي وتصب في قمع. قم بضغط قطعة القماش في القمع واستخراجها قدر المستطاع.
        ملاحظة: تغيير قفازات بين العينات لتجنب التلوث المتبادل. مواصلة مع المواليةتوكول في الخطوة 2.2.10.
    4. إضافة 20 مل من ستي (في غطاء الدخان) لكل أنبوب 50 مل.
    5. وضع العينات في كتل طحن المبردة قبل المبردة في جهاز طحن الأنسجة وطحن العينات لمدة 2 × 30 ثانية في 1750 دورة في الدقيقة. تدوير المواقع عينة ووضع العينات على الجليد لمدة ~ 1 دقيقة بين طحن.
      ملاحظة: هاون ومدقة، خلاط، أو غيرها من الأنسجة طحن / التجانس الجهاز يمكن استخدامها في هذه الخطوة. ومع ذلك، فإن كل طريقة تؤثر على جودة الحمض النووي الناتجة لدرجات مختلفة، وبالتالي يجب تقييم طول الحمض النووي والجودة قبل الاستمرار مع التطبيقات المصب.
    6. إدراج قمع في أنبوب نظيفة 50 مل وضعت في الجليد. وضع طبقة واحدة من القماش الترشيح في قمع وقبل الرطب مع 5 مل من ستي. لا تتجاهل تدفق من خلال.
    7. صب الأنسجة المتجانسة في قمع. شطف أنبوب طحن مع 15 مل من ستي، خلاصة وعكس الأنبوب لشطف الجدران والغطاء، وتصب في فونايل
    8. إزالة بعناية من الحجارة السيراميك ثم الضغط والخروج من القماش الترشيح في قمع.
      ملاحظة: تغيير قفازات بين العينات لتجنب التلوث المتبادل.
    9. التفاف قبعات أنبوب مع بارافيلم لتجنب تسرب. أجهزة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    10. نضح بعناية طاف باستخدام ماصة المصلية (تجنب إزعاج بيليه) ووضعه في 50 مل عالية السرعة أنبوب الطرد المركزي (إذا لم يكن لديك أنابيب حشوات ختم ضيق، والتفاف قبعات أنبوب مع بارافيلم لتجنب تسرب). تجاهل الكريات.
    11. توازن الأنابيب إلى داخل 0.1 غرام باستخدام ستي والطرد المركزي الناتجة طاف لمدة 20 دقيقة في 18،000 x ج و 4 درجة مئوية. لتحقيق التوازن بين الأنابيب، ووضع كوب صغير من الجليد على التوازن، الفارغة الحجم، وتزن العينات على الجليد للحفاظ على البرد. بدلا من ذلك، استخدم ميزان وغطاء الدخان في غرفة باردة.
    12. تجاهل طاف. إضافة 1 مل من ست إلى بيليه وإعادة تعليق بلطف لناأداة تعريف إنجليزية غير معروفة، خشن، بينتبروش. إضافة 24 مل من ست (الحجم النهائي من 25 مل) ومزيج / دوامة ( أي، اضغط على فرشاة الطلاء على جانب الأنبوب لإزالة جميع السائل).
    13. توازن الأنابيب إلى داخل 0.1 غرام باستخدام ست. أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 18،000 x ج و 4 درجة مئوية. وفي الوقت نفسه، وإعداد حل دنازي (انظر الجدول 1 للأسهم وحل وصفات العمل). لكل عينة، وجعل واحد 200 قسامة ميكرولتر في أنبوب 1.5 مل.
    14. تجاهل طاف، وصمة عار الأنبوب، وإعادة تعليق بيليه (لا يزال في أنبوب الطرد المركزي عالية السرعة) في 300 ميكرولتر من ست باستخدام فرشاة الطلاء لينة. وضع فرشاة الطلاء في أنبوب 1.5 مل أعدت مسبقا تحتوي على 200 ميكرولتر من محلول دنازي ودوامة فرشاة الطلاء لإزالة أي بيليه المتبقية عالقة في الفرشاة. ماصة الحل دنازي مرة أخرى في أنبوب الطرد المركزي عالية السرعة ودوامة بلطف لخلط.
    15. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حمام مائي (التفاف بارافيلم حول الجزء العلوي من أنبوب لمنع تسرب التكثيفز في الغطاء). مزيج بلطف عن طريق تحوم 2 مرات خلال الحضانة.
    16. ماصة بلطف خليط بيليه من الأنبوب باستخدام طرف ماصة مع فتحة واسعة ووضعه في أنبوب منخفض ربط 1.5 مل. إضافة 500 ميكرولتر من 400 ملي إدتا، ودرجة الحموضة 8.0، إلى أنبوب الطرد المركزي عالية السرعة وماصة بلطف للحصول على كل من بيليه المتبقية من الأنبوب. نقل إدتا لنفس 1.5 مل، وانخفاض ربط أنبوب كما خليط بيليه ومزيج بلطف عن طريق انقلاب.
    17. أجهزة الطرد المركزي في 18،000 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية. تجاهل طاف، وصمة عار الأنبوب، واستخدامها مرة واحدة لعزل الحمض النووي. إذا لزم الأمر، وتجميد الكريات في -20 درجة مئوية، ولكن هذا قد يؤدي إلى انخفاض العائد، كما دنازي المتبقية قد تتحلل من الحمض النووي العينة إذا لم يتم معالجتها على الفور.
  3. استخراج الحمض النووي من عضيات معزولة باستخدام نهج قائم على العمود التجاري
    ملاحظة: انظر كتيب كيت للبروتوكول الكامل 25 ، ونرى أدناه لإجراء تعديلات. العلاقات العامةويعود مباشرة من العزلة العضلية إلى استخراج الحمض النووي. والتجميد المتكرر والذوبان يقلل من الأحجام الحمض النووي جزء ويؤدي إلى تدهور الحمض النووي من قبل دنازي المتبقية. الحد فورتيكسينغ أو بيبتينغ قوية، وهذا يمكن قص الحمض النووي. ويوصى باستخدام أنابيب ميكروسنتريفوج منخفضة ربط لتعظيم الانتعاش الحمض النووي.
    1. إجراء استخراج الحمض النووي
      ملاحظة: قراءة بروتوكول تجاري مفصل 25 قبل البدء في التأكد من أن المخازن المؤقتة يتم بشكل صحيح / تخزين وأن يتم فهم إجراءات عمود الدوران.
      1. إضافة 180 ميكرولتر من العازلة أتل مباشرة في أنبوب مع بيليه (إذابة إذا تجمد سابقا ومعايرة إلى درجة حرارة الغرفة على مقاعد البدلاء).
      2. المضي قدما مع الخطوة 3 في بروتوكول "تنقية الحمض النووي من الأنسجة" في كتيب عدة، مع التعديلات التالية: تحلل 30 دقيقة في الخطوة 3، وتشمل اختياري ريبونوكلياز الهضم، وأزل في 3 × 200 ميكرولتر من إ كل في سيأنبوب باريت ومن ثم الجمع بين إلوتيونس).
      3. حفظ قسامة (20 ميكرولتر على الأقل) ل قر (انظر الخطوة 4.1). لتحديد كمية قبل التركيز، حفظ إضافية 1 ميكرولتر لقياس حساسية عالية.
      4. إذا رغبت في ذلك، المضي قدما مع تركيز العينة.
  4. تركيز العينة مع وحدات تصفية التجارية
    ملاحظة: انظر البروتوكول التجاري 26 لمزيد من التفاصيل. اعتمادا على استخدام المصب، قد لا يكون من الضروري لأداء تركيز العينة (على سبيل المثال، لتطبيقات نهاية نقطة ير و قر). ومع ذلك، لبناء مكتبة نغس، فإنه من المرجح أن يكون من الضروري تركيز الحمض النووي العضلي المخفف تم الحصول عليها بعد استخراج الحمض النووي.
    1. إجراء عمود التركيز
      1. بعناية قبل وزن (انظر الجدول 2 ) وحدة تصفية فارغة (بدون أنبوب) على قطعة نظيفة من وزنها ورقة على التوازن التحليلي الرقمي. سجل الوزن.
      2. متزمتبيت إلوتيونس مجتمعة في وحدة التصفية وتزن بعناية مرة أخرى.
        ملاحظة: يقول الدليل التجاري 26 أن وحدة تصفية الحد الأقصى لحجم 500 ميكرولتر، ولكن ما يصل إلى 575 ميكرولتر يمكن أن تضاف إلى وحدة في وقت واحد مع عدم وجود تجاوز.
      3. وضع بعناية وحدة تصفية شغل في أنبوب (المقدمة مع الأعمدة). أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج الوقت المطلوب لتحقيق حجم التركيز المطلوب. لعينة حجم من ~ 575 ميكرولتر، و 20 دقيقة تدور عادة ما يؤدي إلى تركيز حجم 15-30 ميكرولتر.
      4. إزالة وحدة التصفية من الأنبوب وتزن مرة أخرى. استخدام الجدول لتحديد ما إذا كان قد تم تحقيق حجم التركيز المطلوب. إن لم يكن، أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 500 x ج لمدة أقصر من الوقت وتزن مرة أخرى؛ كرر حتى يتم التوصل إلى حجم التركيز المطلوب.
      5. وضع أنبوب جديد (المقدمة مع الأعمدة) على الجزء العلوي من وحدة التصفية وعكس. أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 1000 x ج لنقل الشركةنسنترات إلى الأنبوب.
      6. تحديد حجم استردادها. وهذا عادة ما يكون ~ 3 - 5 ميكرولتر أقل من حجم المحسوبة، بسبب الاحتفاظ فلتر. إذا الإفراط في التركيز، تمييع مع الماء المعقم أو تي لتحقيق الحجم المطلوب.
      7. تحديد الحمض النووي باستخدام قياس حساسية عالية (لكل تعليمات الشركة المصنعة).

3. الأسلوب رقم 2: ميثيل-تجزئة (مف) نهج لإثراء للحمض النووي العضوي من الحمض النووي الجيني الكلي

ملاحظة: تم تعديل هذا البروتوكول من بروتوكول استخراج الحمض النووي كيت مجموعة الحمض النووي جينوميوم المستخدم للنباتات والفطريات 27 والبروتوكول ميكروبيوم الدنا كيت التخصيب التجاري 28 . من الناحية النظرية، أي بروتوكول عزل الحمض النووي الذي ينتج الحمض النووي عالية الوزن الجزيئي يمكن أن تستخدم لسحب. وبالنسبة للتسلسل القصير القراءة، فإن أي استخراج ينتج في الغالب أكثر من 15 كيلو بايت شظايا كافية للاستخدام في السحب. لوNG- قراءة التسلسل، شظايا أكبر قد يكون مرغوبا فيه. لذلك، نحن الأمثل هذا البروتوكول لانتاج الحمض النووي عالية الوزن الجزيئي.

  1. عزل الحمض النووي الكلي
    ملاحظة: انظر قائمة المعدات والكواشف المطلوبة وإعداد المخازن المؤقتة ومخزونات العمل المطلوبة للطريقة رقم 2 ( الجدول 1 ). إضافة الإنزيمات ليسينغ إلى المخزن المؤقت تحلل لجعل الحل تحلل العازلة العمل. بدوره على ثيرموميكسر وتعيينه إلى 37 درجة مئوية. بدوره على حمام الماء إلى 50 درجة مئوية ووضع العازلة قف في الحمام. وضع إتوه 70٪ في الثلاجة وتعيين ميكروسنتريفوج إلى 4 درجات مئوية.
    1. مجموع استخراج الحمض النووي باستخدام أعمدة استخراج الحمض النووي التجارية
      ملاحظة: قبل البدء، اقرأ الكتيب التجاري 29 للحصول على معلومات مفصلة حول استخدام الأعمدة أنيون تبادل الصرف الجاذبية. قد يتم إعداد الأعمدة باستخدام رف متخصص أو موضوعة فوق الأنابيب باستخدام حلقات بلاستيكية مقدمة. جميع الخطوات، بما في ذلك زيجب أن يسمح لها بالمضي قدما عن طريق تدفق الجاذبية، وينبغي أن لا تضطر السائل المتبقية من خلال.
      1. طحن 20 ملغ من الأنسجة المجمدة في النيتروجين السائل في أنبوب منخفض ربط 2 مل باستخدام بيستليس طحن باليد مصممة للأنابيب 2 مل.
      2. إضافة 2 مل من تحلل العازلة حل العمل (الأنابيب سوف تكون كاملة جدا).
      3. احتضان في ثيرموميكسر في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع التحريض لطيف في 300 دورة في الدقيقة. إذا كان ثيرموميكسر غير متوفر، احتضان على كتلة الحرارة والاختلاط عن طريق عبها لطيف كل 15 دقيقة هو بديل مناسب.
      4. إضافة 4 ميكرولتر من ريبونوكلياز (100 ملغ / مل، تركيز النهائي من 200 ميكروغرام / مل). عكس لخلط واحتضان في ثيرموميكسر لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، مع التحريض لطيف في 300 دورة في الدقيقة.
      5. إضافة 80 ميكرولتر من بروتين K (20 ملغ / مل، تركيز النهائي من 0.8 ملغ / مل)، عكس لخلط، واحتضان في ثيرموميكسر لمدة 2 ساعة عند 50 درجة مئوية، مع التحريض لطيف في 300 دورة في الدقيقة.
      6. أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية و 15000 زغ لبيليه الحطام غير قابلة للذوبان.
      7. في حين أن العينات هي الطرد المركزي، موازنة الأعمدة مع 1 مل من العازلة كبت والسماح للعمود لتفريغ عن طريق تدفق الجاذبية.
      8. استخدام واسعة-- تتحمل غيض ماصة لتطبيق فورا العينة (تجنب بيليه) إلى عمود معاير والسماح لها تدفق كامل من خلال العمود. إذا أصبحت العينة غائمة، مرشح أو الطرد المركزي مرة أخرى قبل تطبيق على العمود (انظر الكتيب التجاري لمزيد من التفاصيل 29 ).
      9. مرة واحدة وقد دخلت العينة بالكامل الراتنج، وغسل العمود مع 4 × 1 مل من عازلة ق.
      10. تعليق العمود على نظيفة، 2 مل، وانخفاض ربط أنبوب ميكروسنتريفوج. أزل الحمض النووي الجيني مع 0.8 مل من العازلة قف بريوارمد في 50 درجة مئوية.
      11. يعجل الحمض النووي بإضافة 0.56 مل (0.7 مجلدات من العازلة شطف) من الأيزوبروبانول درجة حرارة الغرفة إلى الحمض النووي إلوتد.
      12. مزيج عن طريق انقلاب (10X) وأجهزة الطرد المركزي على الفور لمدة 20 دقيقة في 15،000 x ج و 4 درجة مئوية. رعايةتماما إزالة طاف دون إزعاج الزجاجي، المرفقة فضفاضة بيليه.
      13. غسل بيليه دنا الطرد المركزي مع 1 مل من الإيثانول البارد 70٪. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 15،000 زغ و 4 درجات مئوية.
      14. إزالة بعناية طاف (كن حذرا مع هذه الخطوة كذلك) دون إزعاج بيليه. الهواء الجاف لمدة 5-10 دقيقة و ريسوسبيند الحمض النووي في 0.1 مل من العازلة شطف (إب). حل الحمض النووي بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. تجنب بيبتينغ، والتي قد القص الحمض النووي.
      15. قياس العينات باستخدام عالية الحساسية الحمض النووي فحص الكمي (لكل تعليمات الشركة المصنعة).
  2. تجزئة مستندة إلى حبة من الحمض النووي ميثليته و أونميثيلاتد
    ملاحظة: أظهر منشور صدر مؤخرا استخدام مجموعة متوفرة تجاريا 28 التي تستفيد من نهج المنسدلة باستخدام كبغ محددة النطاق الميثيل ملزمة المجال البروتين تنصهر إلى الإنسان مفتش فك جزء (MBD2-فك البروتين) إلى جزء(ونميثيلاتد) من محتوى الجينوم النووي (المميثلي للغاية) 23 . لم يتم اختبار كفاءة التجزئة في عينات القمح سابقا باستخدام هذه المجموعة من الأدوات التجارية التجارية 28 .
    1. أشياء يجب القيام بها قبل البدء
      1. إعداد طازجة 80٪ من الإيثانول (800 ميكرولتر على الأقل لكل رد فعل). تعيين 5x ربط / غسل العازلة للذوبان الجليد على الجليد وإعداد 5 مل من العازلة 1X لكل عينة (تمييع 5X العازلة مع العقيمة، نوكليس خالية من المياه والحفاظ على الجليد خلال البروتوكول).
    2. إعداد MBD2-فك البروتين ملزمة الخرز المغناطيسي
      1. إعداد العدد المطلوب من مجموعات حبة. مقياس ردود الفعل للاستخدام بين 1 و 2 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي المدخلات، التي تتطلب 160 - 320 ميكرولتر من الخرز. لاحظ أن ردود الفعل المذكورة أدناه هي ل 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي المدخلات، لذلك فإنها تتطلب 160 ميكرولتر من الخرز. مقياس ردود الفعل وفقا للاحتياجات.
      2. باستخدام نصائح واسعة تتحمل، ماصة بلطف البروتين A المغناطيسي Bإيد الطين صعودا وهبوطا لإنشاء تعليق متجانس. كبديل، وتدوير بلطف أنبوب من الخرز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
        ملاحظة: لا دوامة الخرز.
      3. تابع الإرشادات وفقا لتعليمات المصنع 28 .
    3. التقاط الحمض النووي النووي ميثليته
      1. لكل عينة على حدة، إضافة 1 ميكروغرام من الحمض النووي المدخلات إلى أنبوب يحتوي على 160 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي MBD2-فك.
      2. إضافة 5X ربط / غسل العازلة حسب الاقتضاء نظرا لحجم عينة المدخلات الحمض النووي للتركيز النهائي من 1X (حجم 5X ربط / غسل العازلة لإضافة (ميكرولتر) = حجم المدخلات الحمض النووي (ميكرولتر) / 4). ماصة العينة صعودا وهبوطا عدة مرات لخلط باستخدام واسعة-- تتحمل طرف ماصة.
      3. تدوير الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. ماصة بلطف العينات مع طرف ماصة تتحمل واسعة ونفض الغبار العينات 2-3 مرات في جميع أنحاء الحضانة لمنع حبة التثاقل.
        ملاحظة: بيبتينغ وفليكينغ أمر بالغ الأهمية لضمان سحب فعالة من الحمض النووي ميثليته.
    4. جمع المخصب، ونميثيلاتد الحمض النووي العضلي
      1. تدور لفترة وجيزة الأنبوب الذي يحتوي على الحمض النووي و MBD2-فك ملزمة خليط حبة المغناطيسي. وضع أنبوب على الرف المغناطيسي لمدة لا تقل عن 5 دقائق لجمع الخرز إلى جانب الأنبوب. يجب أن يظهر الحل واضح.
      2. باستخدام واسعة-- تتحمل نصائح، إزالة بعناية طاف مسح دون إزعاج الخرز. نقل طاف (يحتوي أونميثيلاتد، الدنا المخصب العضوي) إلى نظيفة، وانخفاض ربط، أنبوب ميكروسنتريفوج 2 مل. تخزين هذه العينة في -20 أو -80 درجة مئوية، أو المضي قدما مباشرة إلى الخطوة 3.2.6 لتنقية.
    5. ألقي القبض على الحمض النووي النووي من الخرز المغناطيسي MBD2-فك
      1. إذا كان المطلوب أيضا جزء نووي، اتبع تعليمات الشركة المصنعة 28 لاستئصال الحمض النووي النووي من الخرز المغناطيسي MBD2-فك. تنقية كما هو موضح في الخطوة 3.2.7.
    6. حبة الحمض النووي تنقية
      1. تأكد من أن الخرز تنقية في درجة حرارة الغرفة ويتم خلطها بدقة. تابع البروتوكول وفقا للتعليمات الواردة في دليل مجموعة مف 28 .
        ملاحظة: يمكن الآن أن تستخدم العينة لبناء مكتبة نغس أو تحليل المصب آخر.

4. عينة الكمي ومراقبة الجودة

  1. قر فحص لتقييم تخصيب العضل
    ملاحظة: تم تصميم رد فعل قر ومعلمات الفحص المدرجة هنا للاستخدام على روش ليتسيكلر 480، وربما تحتاج إلى تعديل لمختلف المعدات والكواشف. إذا قر غير متوفر، يمكن استخدام ير نقطة نهاية والتصور على هلام الاغاروز كمقياس نوعي من نقاء العينة، وذلك باستخدام نفس الاشعال والشروط الموصوفة هنا. أحجام أمبليكون سيكون ~ 150 نقطة أساس لجميع مجموعات التمهيدي. انظر الجدول 3 لترتيب التمهيديسيس و بيرينغس.
    1. قر رد فعل الإعداد
      1. لإعداد الفردية 20 ميكرولتر رد فعل قر، ماصة بعناية ما يلي في بئر واحدة من لوحة قر 96 جيدا: 10 ميكرولتر من 2X سيبر الأخضر أنا سيد. 2 ميكرولتر من 10 ميكرومتر إلى الأمام وعكس التمهيدي مزيج (للتركيز النهائي من 0.5 ميكرومتر). 2 ميكرولتر من قالب (ضمن مجموعة من منحنى القياسية). و 6 ميكرولتر من العقيمة، نوكليس خالية H 2 O. للحد من الأخطاء بيبتينغ، فمن الأفضل لجعل مزيج الرئيسي مع جميع مكونات رد الفعل باستثناء القالب. إضافة مزيج الرئيسي إلى لوحة قر ومن ثم إضافة قالب من الفائدة لكل بئر. يجب إجراء ثلاث مكررات تقنية لكل عينة للتقليل إلى أدنى حد من آثار الخطأ بيبتينغ.
        ملاحظة: في نهاية المطاف، يتم مقارنة نسبة النووي إلى دورات القياس الكمي العضوي بين العينات، لذلك الاختلافات الطفيفة في تركيز مقبولة. ومع ذلك، يجب أن تكون تركيزات الحمض النووي تقريبا داخل نطاق إيتش أخرى.
      2. ختم لوحة مع عالية الجودة قر ختم الفيلم. دوامة بلطف العينات، مع الحرص على تجنب إنشاء أي فقاعات. تدور لفترة وجيزة لوحة أسفل لمدة 2 دقيقة في 4 درجات مئوية لجمع العينة والقضاء على أي فقاعات صغيرة.
      3. تحميل لوحة في الجهاز. قم بتشغيل برنامج قر وفقا للإرشادات المدرجة أدناه.
    2. قر معلمات رد الفعل
      ملاحظة: هذه هي المعلمات الافتراضية، باستثناء دورة الصلب لمرحلة التضخيم. ضبط هذا الإعداد لاستيعاب الاشعال محددة إذا كانت تلك المستخدمة تختلف عن الاشعال المعروضة في هذا البروتوكول.
      1. قبل احتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، مع معدل منحدر من 4.4 درجة مئوية / ثانية.
      2. أداء 45 دورات التضخيم من (1) 95 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، مع معدل منحدر من 4.4 درجة مئوية / ثانية. (2) 60 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، مع معدل منحدر من 2.2 درجة مئوية / ثانية؛ و (3) 72 درجة مئوية لمدة 10 ثوان، مع معدل منحدر 4.4 درجة مئوية / ثانية (البيانات المكتسبة خلال (3)).
      3. استخدام أوبتيونال تذوب دورة منحنى 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوانى، مع معدل منحدر 4.4 درجة مئوية / ثانية؛ 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، مع معدل منحدر من 2.2 درجة مئوية / ثانية؛ و 97 درجة مئوية، مع وضع الاستحواذ المستمر.
      4. استخدام دورة التبريد من 40 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، مع معدل منحدر من 1.5 درجة مئوية / ثانية.
    3. معايير الفحص
      1. حدد قالب سيبر. تحقق من معلمات البرنامج في زر التجربة. مرة واحدة يتم تحميل لوحة، يمكن أن تبدأ الفحص، ويمكن ضبط الإعدادات أثناء الفحص قيد التشغيل.
      2. تعيين عينات باستخدام محرر نموذج. حدد عبس كوانت كما سير العمل وتعيين العينات كما غير معروف، والمعايير، أو الضوابط السلبية. تعيين النسخ المتماثل وملء أسماء عينة من الأول من كل تكرار. إضافة تركيزات ووحدات إلى المعايير.
      3. إعداد مجموعات فرعية للتحليل؛ يتم تعيين هذه في محرر مجموعة فرعية.
      4. للتحليل، حدد عبس كوانت / 2 مشتق ماكس من قائمة "إنشاء تحليل جديد".استيراد منحنى القياسية حفظها خارجيا (إن وجدت) ومن ثم ضرب حساب. سيحتوي التقرير على المعلومات المختارة.
      5. ولإجراء قياس دقيق مطلق لتحديد عدد النسخ أو تركيزها، استخدم منحنيا قياسيا يمثل العينة التي يجري اختبارها ( مثل الحمض النووي العضوي المعزول عن الأساليب المذكورة أعلاه). منذ كمية من الحمض النووي الميتوكوندريا المطلوبة لإعداد منحنى القياسية مرتفعة جدا لتحقيقها مع كمية معقولة من الأنسجة، لا تستخدم نسخ عدد النسخ التي يقدمها البرنامج، ولكن بدلا من ذلك فحص نقاط العبور (كب) القيم لتحديد الإثراء النسبي من أورغانيلار بالمقارنة مع الحمض النووي النووي في العينات. قارن هذه المبالغ النسبية لتلك التي من الحمض النووي الجيني الكلي (انظر ممثل النتائج ). اختبار كفاءة التمهيدي على خمس التخفيفات 1:10 من الحمض النووي الجيني الكلي من شتلات القمح التي نمت بشكل كامل، والتي تبلغ من العمر أسبوعين،ه أسطورة من الشكل 2 ).
  2. نابض المجال الكهربائي هلام (بفج)
    ملاحظة: ويستند هذا البروتوكول على المبادئ التوجيهية المصنعة لأداء بفج لحل ارتفاع الحمض النووي الوزن الجزيئي. انظر جدول المواد.
    1. إعداد الجل والعينات
      1. اتبع الإرشادات الخاصة بالهلام وإعداد العينات وتكييفها مع النظام المتاح.
    2. تشغيل المعلمات
      1. اتبع المبادئ التوجيهية لإعداد نظام الكهربائي واستخدام المعلمات التالية: وقت التبديل الأولي من 2 ثانية، وقت التبديل النهائي من 13 ثانية، تشغيل الوقت من 15 ساعة و 16 دقيقة، V / سم من 6، وشملت زاوية 120 درجة .
    3. وصمة عار وصورة هلام
      1. وصمة عار هلام مع صبغ الاختيار (على سبيل المثال، بروميد إثيديوم أو بديل مناسب) والصورة مع نظام التوثيق هلام مناسبة.
  3. نغس والتحليل
    1. استخدام 1 نانوجرام من الحمض النووي كمدخلات لمجموعة دنا مكتبة الإعدادية، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    2. الباركود وبركة عينات للتسلسل في تشغيل واحد. أداء التسلسل وفقا للمبادئ التوجيهية الشركة المصنعة.
      ملاحظة: يمكن تغيير معلمات التجميع والتسلسل تبعا لنوع الاهتمام، ومستوى التغطية المطلوب، والمنصة المستخدمة لتسلسل المكتبات. على سبيل المثال، حارة هيس لديها مخرجات أكثر بكثير من حلبة ميسق، لذلك العديد من العينات يمكن مضاعفة. تسلسل مجموعة فرعية أصغر من العينات لتحديد ما إذا كانت مستويات التغطية من جينوم عضوي كافية لتحليل المصب.
    3. فحص جودة القراءة باستخدام فاستق 31 لتحديد مدى التشذيب والتصفية المطلوبة للبيانات.
    4. تقليم وتصفية يقرأ الخام باستخدام تريمموماتيك 32 أو برنامج آخر مماثل. استخدم الإعدادات التالية: إلوميناكليب 2:30:10 (لإزالة المحولات)، ليدينغ 3، ترايلينغ 3، سليدينغويندو 4:10، و مينلين 100.
    5. قم بتعيين نهاية المزاوجة التي تمت تصفيتها و المقلدة بنقطة المحول (بي) إلى الميتوكوندريا الربيعية الصينية (تسلسل مرجع نسبي NC_007579.1 33 )، و كلوروبلاست (نسبي المرجع المرجعي NC_002762.1 34 )، و الجينوم المرجعي النووي 35 باستخدام Bowtie2 36 ، مع الإعدادات التالية: -I 0 -X 800 - حساس.
    6. تحويل ملفات محاذاة سام إلى تنسيق بام (سامتولس) وفرز ملفات بام. استخدام ملفات بام لحساب التغطية على نطاق الجينوم والتغطية لكل قاعدة مع بيدتولز. تصور النتائج مع وظيفة R- مؤامرة.

النتائج

البروتوكولات الواردة في هذه المخطوطة تصف طريقتين متميزتين لإثراء الحمض النووي العضوي من الأنسجة النباتية. وتعكس الشروط المعروضة هنا التحسين لأنسجة القمح. يتم وصف مقارنة بين الخطوات الرئيسية في البروتوكولات، والمدخلات الأنسجة المطلوبة، وإخراج ال...

Discussion

حتى الآن، تركز معظم الدراسات التسلسل العضوي على أساليب دس التقليدية لإثراء الحمض النووي المحدد. وقد وصفت طرق لعزل العضيات من النباتات المتنوعة، بما في ذلك الطحلب 40 ؛ مونوكوتس مثل القمح 15 والشوفان 11 ؛ و ديكوتس مثل أرابيدوبسيس

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة.

إن ذكر الأسماء التجاریة أو المنتجات التجاریة في ھذا المنشور ھو فقط لغرض تقدیم معلومات محددة ولا یعني التوصیة أو المصادقة من قبل وزارة الزراعة الأمریکیة. وزارة الزراعة الأمريكية هي مزود فرص متساوية وصاحب العمل.

Acknowledgements

ونود أن نعترف بتمويل من وزارة الزراعة الأمريكية - دائرة البحوث الزراعية ومن المؤسسة الوطنية للعلوم (يوس 1025881 و يوس 1361554). نشكر R. كاسبرز لصيانة الدفيئة ورعاية النبات. كما نشكر جامعة مينيسوتا مركز الجينوميات، حيث تم إجراء التحضيرات مكتبة إلومينا والتسلسل. كما نعرب عن امتناننا للتعليقات التي أبداها محررو المجلة وأربعة مراجعين مجهولين من شأنها تعزيز مخطوطةنا. كما نشكر منظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي على زمالة ل سك لدمج هذه البروتوكولات للمشاريع التعاونية مع الزملاء في اليابان.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol; BME)Sigma AldrichM3148-100ml
2-propanol (Isopropyl alcohol/isopropanol), bioreagentSigma AldrichI9516
agarose, Bio-Rad Cetified Megabase agaroseBio-Rad1613108
analytical balanceMettler ToledoAB54-S
balanceMettler ToledoPB1502-S
bovine serum albumin (BSA)Sigma AldrichB4287-25G
Ceramic grinding cylinders, 3/8in x 7/8inSPEX SamplePrep2183
Cryogenic Blocks compatible with tissue homogenizer for holding 50 ml tubesSPEX SamplePrep2664
DNaseISigmaDN25
ethanol, absoluteDecon Laboratories2716
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), 0.5M Solution, pH8.0FisherBP2482-500
gel imaging system
gel stainSuch as GelRed or Ethidium Bromide
grinding pestle, wide tip for 2 ml conical tubes
Guanidine-HCl, 8M solutionThermoFisher24115
LightCycler 480 SYBR Green I MasterRoche4707516001
liquid nitrogen
Lysing enzymes from Trichoderma harzianumSigmaL1412
Magnesium ChlorideG Bioscience24115
magnetic rackThermoFisherA13346
microcentrifuge tubes, LoBind 1.5 ml Eppendorf22431021
microcentrifuge tubes, standard nuclease-free 1.5 mlEppendorf
microcentrifuge, refrigeratedSorvall Legend X1ROr equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotors for 50 ml tubes, Oak Ridge tubes, and 1.5 ml tubes
microcentrifuge, room temperatureEppendorf5424Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotor for 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes
Microcon DNA Fast Flow Centrifugal Filter UnitsEMD MilliporeMRCFOR100
Miracloth, 1 square per sample cut to fit funnelEMD Millipore475855
NEBNext Microbiome DNA Enrichment KitNew England BiolabsE2612L
parafilmParafilm MPM992
plastic pots and trays
polyvinylpyrrolidone (PVP)FisherBP431-100
Proteinase KQiagen19131
Pulsed-Field Gel Electrophoresis rig (e.g. CHEF DR III)Bio-Rad1703697
purification beads, Agencourt AMpureXP beadsBeckman CoulterA63881
QIAamp DNA Mini KitQiagen51304
Qiagen 20/g Genomic Tip DNA Extraction KitQiagen10223
Qiagen Buffer EB (elution buffer)Qiagen19086
Qiagen DNA Extraction Buffer SetQiagen19060
QiaRackQiagen19015
qPCR machine (e.g. Roche Light Cycler 480)Roche
qPCR plate sealing filmRoche4729757001
qPCR plate, 96 well plateRoche4729692001
Qubit assay tubesLife TechnologiesQ32856
Qubit Broad Spectrum assay kitLife TechnologiesQ32850
Qubit High Sensitivity assay kitLife TechnologiesQ32851
RNaseAQiagen19101
Serological pipettes (20 ml) and pipet-aidFisher13-678-11
Small funnels, 1 per sample
Sodium ChlorideAmbionAM9759
Soft paintbrush, 2 per sample
SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder or another type of tissue homogenizerSPEX SamplePrepOr another comparable tissue homogenizer. If you do not have access to a tissue homogenizer, then grinding in a pre-chilled mortar and pestle will suffice (see protocol for details). However, a homogenizer will give more consistent results and total homogenization time is reduced.
SucroseOmnipure8550
TBE
thermomixer
TrisSigmaT2819-100ml
Triton X-100PromegaH5142
tube rotater
tubes, 50 mL conical polypropyleneCorning352070
tubes, 50 ml high-speed polypropylene ThermoScientific/Nalgene3119-0050e.g. Nalgene Oakridge tubes or equivalent
vermiculite
water bath
water, sterile and certified Nuclease-free Fisher1481
water, sterile milliQ

References

  1. Liberatore, K. L., Dukowic-Schulze, S., Miller, M. E., Chen, C., Kianian, S. F. The role of mitochondria in plant development and stress tolerance. Free Radic Biol Med. 100, 238-256 (2016).
  2. Samaniego Castruita, J. A., Zepeda Mendoza, M. L., Barnett, R., Wales, N., Gilbert, M. T. Odintifier--A computational method for identifying insertions of organellar origin from modern and ancient high-throughput sequencing data based on haplotype phasing. BMC Bioinformatics. 16 (232), 1-13 (2015).
  3. Zhang, T., Zhang, X., Hu, S., Yu, J. An efficient procedure for plant organellar genome assembly, based on whole genome data from the 454 GS FLX sequencing platform. Plant Methods. 7 (38), 1-8 (2011).
  4. Wambugu, P. W., Brozynska, M., Furtado, A., Waters, D. L., Henry, R. J. Relationships of wild and domesticated rices (Oryza AA genome species) based upon whole chloroplast genome sequences. Sci Rep. 5 (13957), 1-9 (2015).
  5. Iorizzo, M., et al. De novo assembly of the carrot mitochondrial genome using next generation sequencing of whole genomic DNA provides first evidence of DNA transfer into an angiosperm plastid genome. BMC Plant Biol. 12 (61), 1-17 (2012).
  6. Park, S., et al. Complete sequences of organelle genomes from the medicinal plant Rhazya stricta (Apocynaceae) and contrasting patterns of mitochondrial genome evolution across asterids. BMC Genomics. 15 (405), 1-18 (2014).
  7. Skippington, E., Barkman, T. J., Rice, D. W., Palmer, J. D. Miniaturized mitogenome of the parasitic plant Viscum scurruloideum is extremely divergent and dynamic and has lost all nad genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (27), E3515-E3524 (2015).
  8. Wicke, S., Schneeweiss, G. M., Hörandl, E., Appelhans, M. Chapter 1. Next Generation Sequencing in Plant Systematics. , (2015).
  9. Sloan, D. B. One ring to rule them all? Genome sequencing provides new insights into the 'master circle' model of plant mitochondrial DNA structure. New Phytol. 200 (4), 978-985 (2013).
  10. Woloszynska, M. Heteroplasmy and stoichiometric complexity of plant mitochondrial genomes--though this be madness, yet there's method in't. J Exp Bot. 61 (3), 657-671 (2010).
  11. Ahmed, Z., Fu, Y. B. An improved method with a wider applicability to isolate plant mitochondria for mtDNA extraction. Plant Methods. 11 (56), 1-11 (2015).
  12. Ejaz, M., et al. Comparison of small scale methods for the rapid and efficient extraction of mitochondrial DNA from wheat crop suitable for down-stream processes. Genet Mol Res. 13 (4), 10320-10331 (2014).
  13. Eubel, H., Heazlewood, J. L., Millar, A. H. Isolation and subfractionation of plant mitochondria for proteomic analysis. Methods Mol Biol. 355, 49-62 (2007).
  14. Hao, W., Fan, S., Hua, W., Wang, H. Effective extraction and assembly methods for simultaneously obtaining plastid and mitochondrial genomes. PLoS One. 9 (9), e108291 (2014).
  15. Pomeroy, M. K. Studies on the respiratory properties of mitochondria isolated from developing winter wheat seedlings. Plant Physiol. 53 (4), 653-657 (1974).
  16. Taylor, N. L., Stroher, E., Millar, A. H. Arabidopsis organelle isolation and characterization. Methods Mol Biol. 1062, 551-572 (2014).
  17. Triboush, S. O., Danilenko, N. G., Davydenko, O. G. A method for isolation of chloroplast DNA and mitochondrial DNA from Sunflower. Plant Mol Biol Rep. 16 (2), 183-189 (1998).
  18. Pinard, R., et al. Assessment of whole genome amplification-induced bias through high-throughput, massively parallel whole genome sequencing. BMC Genomics. 7 (216), 1-21 (2006).
  19. Lamble, S., et al. Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based Nextera system. BMC Biotechnol. 13 (104), 1-10 (2013).
  20. Raley, C., et al. Preparation of next-generation DNA sequencing libraries from ultra-low amounts of input DNA: Application to single-molecule, real-time (SMRT) sequencing on the Pacific Biosciences RS II. bioRxiv. , (2014).
  21. Tsai, Y. C., et al. Resolving the Complexity of Human Skin Metagenomes Using Single-Molecule Sequencing. MBio. 7 (1), e01948 (2016).
  22. Feehery, G. R., et al. A method for selectively enriching microbial DNA from contaminating vertebrate host DNA. PLoS One. 8 (10), e76096 (2013).
  23. Yigit, E., Hernandez, D. I., Trujillo, J. T., Dimalanta, E., Bailey, C. D. Genome and metagenome sequencing: Using the human methyl-binding domain to partition genomic DNA derived from plant tissues. Appl Plant Sci. 2 (11), 1-6 (2014).
  24. Noyszewski, A. K., et al. Accelerated evolution of the mitochondrial genome in an alloplasmic line of durum wheat. BMC Genomics. 15 (67), 1-16 (2014).
  25. . QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2016)
  26. . User developed protocol: Isolation of genomic DNA from plants and filamentous fungi using the QIAGEN Genomic-tip - (EN) Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2001)
  27. . QIAGEN Genomic DNA Handbook Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2012)
  28. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  29. Ogihara, Y., et al. Structural dynamics of cereal mitochondrial genomes as revealed by complete nucleotide sequencing of the wheat mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 33 (19), 6235-6250 (2005).
  30. Ogihara, Y., et al. Structural features of a wheat plastome as revealed by complete sequencing of chloroplast DNA. Mol Genet Genomics. 266 (5), 740-746 (2002).
  31. International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC). A chromosome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat (Triticum aestivum) genome. Science. 345 (6194), (2014).
  32. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  33. Bendich, A. J. Why do chloroplasts and mitochondria contain so many copies of their genome?. Bioessays. 6 (6), 279-282 (1987).
  34. Kumar, R. A., Oldenburg, D. J., Bendich, A. J. Changes in DNA damage, molecular integrity, and copy number for plastid DNA and mitochondrial DNA during maize development. J Exp Bot. 65 (22), 6425-6439 (2014).
  35. Ma, J., Li, X. Q. Organellar genome copy number variation and integrity during moderate maturation of roots and leaves of maize seedlings. Curr Genet. 61 (4), 591-600 (2015).
  36. Lang, E. G., et al. Simultaneous isolation of pure and intact chloroplasts and mitochondria from moss as the basis for sub-cellular proteomics. Plant Cell Rep. 30 (2), 205-215 (2011).
  37. Tobin, A. K. Subcellular fractionation of plant tissues. Isolation of chloroplasts and mitochondria from leaves. Methods Mol Biol. 59, 57-68 (1996).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

125

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved