АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Представлено сравнение и оптимизация двух методов растительного органелларного ДНК: традиционное дифференциальное центрифугирование и фракционирование общей гДНК на основе статуса метилирования. Мы оцениваем полученное количество и качество ДНК, демонстрируем эффективность в короткометражном секвенировании следующего поколения и обсуждаем потенциал для использования в долгочитаемом одномолекулярном секвенировании.

Аннотация

Органные органные геномы растений содержат большие повторяющиеся элементы, которые могут подвергаться спариванию или рекомбинации с образованием сложных структур и / или подгеномных фрагментов. Органелларные геномы также существуют в смесях в пределах определенного клеточного или тканевого типа (гетероплазмы), а обилие подтипов может изменяться во время развития или при стрессе (субстехиометрическое смещение). Для более глубокого понимания структуры и функции органелларного генома необходимы технологии секвенирования следующего поколения (NGS). Традиционные исследования секвенирования используют несколько методов для получения органеллярной ДНК: (1) Если используется большое количество исходной ткани, оно гомогенизируется и подвергается дифференциальной центрифугированию и / или градиентной очистке. (2) Если используется меньшее количество ткани ( т. Е. Если семена, материал или пространство ограничены), тот же процесс выполняется, как и в (1), за которым следует амплификация всего генома для получения достаточной ДНК. (3) Анализ биоинформатики может быть использован дляСуммарную геномную ДНК и разобрать органолептические прочтения. Все эти методы имеют присущие проблемы и компромиссы. В (1) может быть трудно получить такое большое количество исходной ткани; В (2) усиление цельного генома может привести к смещению последовательности; И в (3) гомология между ядерными и органелларными геномами может мешать сбору и анализу. В растениях с крупными ядерными геномами выгодно обогащать органеральную ДНК, чтобы снизить затраты на секвенирование и сложность последовательности для анализа биоинформатики. Здесь мы сравниваем традиционный метод дифференциального центрифугирования с четвертым методом, адаптированным подходом CpG-methyl pulldown, для разделения общей геномной ДНК на ядерные и органеарные фракции. Оба метода дают достаточную ДНК для NGS, ДНК, которая сильно обогащена для органеллярных последовательностей, хотя и при различных соотношениях в митохондриях и хлоропластах. Мы представляем оптимизацию этих методов для ткани листьев пшеницы и обсуждаем основные преимущества и dЯвляется преимуществом каждого подхода в контексте ввода образца, упрощения протокола и последующего приложения.

Введение

Секвенирование геномов является мощным инструментом для анализа лежащей в основе генетической основы важных признаков растений. В большинстве исследований секвенирования генома основное внимание уделяется содержанию ядерного генома, так как большинство генов расположено в ядре. Тем не менее, органелл геномов, в том числе митохондрии (через эукариот) и пластид (в растениях; специализированной форме, хлоропластов, работает в фотосинтезе) способствуют значительной генетической информации , необходимой для организменном развития, реакции на стресс и общей пригодности 1. Органелларные геномы обычно включаются в общую экстракцию ДНК, предназначенную для секвенирования ядерного генома, хотя также используются методы уменьшения количества органелл до экстракции ДНК 2 . Во многих исследованиях были использованы результаты секвенирования от полных выделений гДНК для сборки органеллярных геномов 3 , 4 , 5 ,Xref "> 6 , 7. Однако, когда целью исследования является фокусирование на органелларных геномах, использование общей гДНК увеличивает затраты на секвенирование, потому что многие чтения« теряются »для последовательностей ядерных ДНК, особенно у растений с большими ядерными геномами Кроме того, из-за дублирования и переноса органелларных последовательностей в ядерный геном и между органеллами правильное отображение положения секвенирования, считываемое в соответствующий геном, является биоинформационно сложным 2 , 8. Очистка органелларных геномов от ядерного генома является одной Стратегия по уменьшению этих проблем. Дальнейшие стратегии биоинформатики могут использоваться для разделения чтений, которые сопоставляются с областями гомологии между митохондриями и хлоропластами.

В то время как органелларные геномы многих видов растений были секвенированы, мало что известно о широте разнообразия органелларного геномаДоступных в диких популяциях или в культивируемых племенных пулах. Известно, что органелларные геномы являются динамическими молекулами, которые подвергаются значительной структурной перестройке из-за рекомбинации между повторяющимися последовательностями 9 . Кроме того, в каждой органелле содержится несколько копий органомерного генома, и в каждой клетке содержится множество органелл. Не все копии этих геномов идентичны, что называется гетероплазмой. В отличие от канонической картины «мастер-кругов», в настоящее время растут доказательства более сложной картины органелларных структур генома, включая субгеномные круги, линейные хромосомы, линейные конкатэмеры и разветвленные структуры 10 . Сборка растительных органелларных геномов дополнительно осложняется их относительно большими размерами и существенными инвертированными и прямыми повторами.

Традиционные протоколы для органолептической изоляции, очистки ДНК и последующего генома E sequencing часто громоздки и требуют больших объемов ввода ткани, с несколькими граммами до более сотни граммов молодой листовой ткани, необходимой в качестве отправной точки 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Это делает секрецию органелларного генома недоступным, когда ткань ограничена. В некоторых ситуациях количество семян ограничено, например, когда необходимо последовательность на основе поколений или в мужских стерильных линиях, которые необходимо поддерживать путем скрещивания. В этих ситуациях органелларная ДНК может быть очищена, а затем подвергнута амплификации цельного генома. Однако амплификация цельного генома может привести к существенному смещению последовательности, что является особой проблемой при оценке структурных изменений, подгеномных структур и уровней гетероплазмы> 18. Недавние успехи в подготовке библиотек для технологий короткого чтения с чередованием преодолели барьеры с низким входным потенциалом, чтобы избежать усиления цельного генома. Например, набор для подготовки библиотеки Illumina Nextera XT позволяет использовать всего лишь 1 нг ДНК для ввода 19 . Тем не менее, стандартная подготовка библиотек для приложений с длительным чтением, таких как технологии секвенирования PacBio или Oxford Nanopore, по-прежнему требует относительно большого количества входной ДНК, что может создать проблему для секвенирования органелларного генома. Недавно были разработаны новые пользовательские протоколы последовательного кодирования с длительным чтением для уменьшения количества вводимых количеств и для облегчения секвенирования генома в образцах, где получение микрограммовых количеств ДНК затруднено 20 , 21 . Однако получение высокомолекулярных чистых органелларных фракций для подачи в эти библиотечные препараты остается проблемой.

Мы искали tO сравнить и оптимизировать органические методы обогащения и выделения ДНК, подходящие для NGS, без необходимости амплификации цельного генома. В частности, наша цель заключалась в определении оптимальных методов обогащения высокомолекулярной органелларной ДНК из ограниченных исходных материалов, таких как подвыборка листа. В этой работе представлен сравнительный анализ методов обогащения органелларной ДНК: (1) модифицированный традиционный протокол дифференциального центрифугирования по сравнению с (2) протоколом фракционирования ДНК на основе использования коммерчески доступного подхода к распаду ДНК CpG-метилсвязывающего домена 22 применяется к растительной ткани 23 . Мы рекомендуем лучшие методы для выделения органелларной ДНК из ткани листьев пшеницы, которая может быть легко распространена на другие растения и типы тканей.

протокол

1. Генерация растительных материалов для выщелачивания и выделения ДНК

  1. Стандартный рост посевов пшеницы
    1. Семена растений в вермикулите в небольших квадратных горшках с 4-6 семенами на угол. Перенос в теплицу или камеру роста с 16-часовым светом, 23 ºC днем ​​/ 18 ºC ночь.
    2. Вода растения каждый день. Оплодотворить растения с ¼ чайной ложкой зернистого удобрения 20-20-20 NPK при прорастании и через 7 дней после прорастания.
  2. Альтернативная этиоляция проростков пшеницы
    1. Следуйте шагу 1.1, но поместите горшки в темную камеру роста, 23 ° C в течение 16 ч / 18 ° С в течение 8 часов. Альтернативно, закройте растения в теплице ( например, с контейнером для хранения, однако необходимо поддерживать надлежащую вентиляцию).
  3. Рост и сбор тканей
    1. Растите растения на 12-14 дней. Для большинства генотипов пшеницыS, 75 - 100 саженцев дают около 10-12 г ткани, что достаточно для двух органелл. Экстракций с использованием метода дифференциального центрифугирования (раздел 2); Только одно растение необходимо, если использовать подход, основанный на распаде ДНК на основе CpG-метилирования, для фрактального органеллара из ядерной ДНК (раздел 3).
    2. При использовании метода дифференциального центрифугирования собирайте свежую ткань и немедленно приступайте к обработке образцов, как описано в разделе 2.
    3. Если вы используете подход CpG-methyl pulldown, урожай 20 мг секций молодой листовой ткани в микроцентрифужные пробирки (используйте стандартную или этиолитированную ткань, см. Представительские результаты ). Заморозить на жидком азоте и замораживать при -80 ºC до использования. Перейдите к раскрытию фракционирования ДНК, как описано в разделе 3.

2. Способ № 1: экстракция ДНК с использованием дифференциального центрифугирования (DC)

ПРИМЕЧАНИЕ.Протокол стандартного центрифугирования был модифицирован из двух публикаций, в которых оптимизированы условия для выделения обоих органелл, но обогащаются митохондриями 17 , 24 . Полученный протокол менее трудоемкий и использует меньше токсичных химических веществ, чем предыдущие методы. В частности, мы внесли изменения в буферы и стадии промывки, включая добавление поливинилпирролидона (ПВП) в буфер для экстракции STE и удаление заключительной стадии промывки в буфере NETF, который содержит фторид натрия (NaF).

Внимание: Подготовка и использование буфера STE следует выполнять под химическим вытяжным шкафом с надлежащим оборудованием для индивидуальной защиты, так как этот буфер содержит 2-меркаптоэтанол (BME).

  1. Что нужно сделать перед запуском
    1. Убедитесь, что все оборудование очень чистое, и автоклавируйте любое оборудование, которое может быть автоклавировано ( например, шлифовальные цилиндры, высокоскоростные центриФуги и т . Д. ).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Рекомендации по фильтрации рекомендуется для всех этапов, требующих пипетирования, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
    2. См. Список необходимого оборудования и реагентов и подготовьте необходимые буферы и рабочие запасы для метода № 1 ( таблица 1 ). Охладите криогенные шлифовальные блоки до -20 ºC, а роторы и буферы - до 4 ºC, установите микроцентрифугу на 4ºC и включите водяную баню с температурой 37ºC.
  2. Выделение органелл
    1. Уберите 5 г свежей ткани и промойте ее холодной, стерильной водой в охлажденном стакане на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Всегда держите образцы на льду во время всех операций и перевозок в центрифуги, вытяжные шкафы и т. Д. Кроме того, работайте в холодной комнате, если есть доступ к достаточному пространству и оборудованию для выполнения протокола.
    2. Используя ножницы, срезайте ткань листьев на части размером ~ 1 см непосредственно в трубку объемом 50 мл, содержащую два керамических шлифованияцилиндры.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Очистите или замените ножницы между образцами, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
    3. Если нет тканевого гомогенизатора, используйте ступку и пестик и следуйте инструкциям для замены шагов 2.2.4 - 2.2.9.
      1. Обрежьте ткань листа в предварительно охлажденный раствор на льду. Измельчите образцы в течение 2 - 3 минут в 15 мл STE (в вытяжном шкафу).
      2. Вылейте буфер (оставить ткань в ступке) через воронку, содержащую один слой предварительно мокрой стерильной фильтровальной ткани (размер пор от 22 до 25 мкм, см. Основной протокол для деталей) в другую трубку объемом 50 мл , Добавьте еще 10 мл STE в ступку и пестик и снова гомогенизируйте.
      3. Налейте гомогенизированную ткань и буфер в ту же воронку. Промойте раствор и пестик 10 мл STE и вылейте его в воронку. Сожмите и выжмите фильтровальную ткань в воронку, чтобы восстановить как можно больше жидкости.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Измените перчатки между образцами, чтобы избежать перекрестного загрязнения. ПродолжайтеTocol на этапе 2.2.10.
    4. Добавьте 20 мл STE (в вытяжной шкаф) к каждой трубке объемом 50 мл.
    5. Поместите образцы в предварительно охлажденные криогенные мелющие блоки в тканевый шлифовальный аппарат и измельчите образцы в течение 2 х 30 с при 1750 об / мин. Поверните позиции образца и поместите образцы на лед в течение ~ 1 мин между шлифовальными машинами.
      ПРИМЕЧАНИЕ. На этой стадии можно использовать ступку и пестик, блендер или другое устройство для измельчения / гомогенизации ткани. Тем не менее, каждый метод будет влиять на качество ДНК в разной степени, и поэтому длину и качество ДНК следует оценивать, прежде чем продолжить применение в нисходящем направлении.
    6. Вставьте воронку в чистую пробирку объемом 50 мл, помещенную во льду. Поместите один слой фильтровальной ткани в воронку и предварительно промокните ее 5 мл STE. Не отбрасывайте поток.
    7. Налейте гомогенизированную ткань в воронку. Промойте шлифовальную трубку 15 мл STE, повторите и поверните трубку, чтобы ополоснуть стенки и крышку, и влейте в нееэл.
    8. Осторожно удалите керамические камни, а затем вдавите и выжмите фильтровальную ткань в воронку.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Измените перчатки между образцами, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
    9. Оберните колпачки с парафильмом, чтобы избежать утечки. Центрифуга при 2000 мкг в течение 10 мин при 4 ° С.
    10. Осторожно аспирируйте супернатант, используя серологическую пипетку (не мешайте таблетке) и поместите ее в высокоскоростную центрифужную пробирку объемом 50 мл (если трубки не имеют плотных уплотняющих прокладок, заверните пробку с парафильмом, чтобы избежать утечки). Отбросьте гранулы.
    11. Балансируйте трубки до 0,1 г с помощью STE и центрифугируйте полученный супернатант в течение 20 минут при 18000 xg и 4ºC. Чтобы сбалансировать трубки, поместите на балансе небольшой стакан льда, помассируйте весы и взвешивайте образцы на льду, чтобы они были холодными. В качестве альтернативы, используйте в холодильнике баланс и вытяжной шкаф.
    12. Отбросьте супернатант. Добавьте 1 мл ST в таблетку и осторожно положитеС мягкой кистью. Добавьте 24 мл ST (конечный объем 25 мл) и смешайте / закрутите ( т. Е. Нажмите кисть на стороне трубки, чтобы удалить всю жидкость).
    13. Балансируйте трубки до 0,1 г, используя ST. Центрифуга в течение 20 мин при 18000 xg и 4 ºC. Между тем, подготовьте решение DNaseI (см. Таблицу 1 для рецептов на складе и рабочих решений). Для каждого образца сделайте одну 200 мкл аликвоту в 1,5 мл пробирке.
    14. Удалите супернатант, промокните пробирку и повторно суспендируйте гранулу (все еще в высокоскоростной центрифужной пробирке) в 300 мкл ST, используя мягкую кисть. Поместите кисть в предварительно приготовленную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 200 мкл раствора DNaseI, и закрутите кисть, чтобы удалить остатки гранул, застрявших в щетке. Внесите раствор DNaseI обратно в высокоскоростную центрифужную пробирку и осторожно смешайте.
    15. Инкубируйте при 37 ° C в течение 30 минут на водяной бане (оберните парафильм вокруг верхней части трубки, чтобы предотвратить утечку конденсатаГ в колпачок). Аккуратно перемешайте, закручивая 2 раза во время инкубации.
    16. Осторожно пипеткой таблетированной смеси из трубки с помощью наконечника пипетки с широким отверстием и поместите его в 1,5 мл трубки с низким связыванием. Добавьте 500 мкл 400 мМ ЭДТА, pH 8,0, в высокоскоростную центрифужную пробирку и аккуратно пипеткой, чтобы вытащить из остатка остаточный осадок. Перенесите ЭДТА в ту же 1,5-мл трубку с низким связыванием в виде смеси гранул и осторожно перемешайте путем инверсии.
    17. Центрифуга при 18000 мкг в течение 20 мин при 4 ° С. Отбросьте супернатант, промокните пробирку и сразу используйте для изоляции ДНК. При необходимости замораживать гранулы при -20 ºC, но это может привести к снижению урожайности, так как остаточная ДНКаза может ухудшить ДНК образца, если она не будет немедленно обработана.
  3. Выделение ДНК из изолированных органелл с использованием коммерческого подхода на основе столбцов
    ПРИМЕЧАНИЕ. См. Руководство по набору для полного протокола 25 и см. Ниже для внесения изменений. PrПредпочтительнее переходить непосредственно из органелларной изоляции в экстракцию ДНК. Повторное замораживание и оттаивание уменьшают размеры фрагментов ДНК и приводят к деградации ДНК остаточной ДНКазой. Ограничьте вихревую или энергичную пипетирование, так как это может сдвинуть ДНК. Рекомендуется использовать микроцентрифужные трубки с низким связыванием, чтобы максимизировать восстановление ДНК.
    1. Процедура экстракции ДНК
      ПРИМЕЧАНИЕ. Прочитайте подробный коммерческий протокол 25, прежде чем начинать следить за тем, чтобы буферы были надлежащим образом изготовлены / сохранены и что процедуры колонкового столба понятны.
      1. Добавьте 180 мкл буфера ATL непосредственно в пробирку с гранулой (оттаивают, если предварительно замораживают и уравновешивают до комнатной температуры на столешнице).
      2. Следуйте шагу 3 в протоколе «Очистка ДНК от тканей» в справочнике по набору со следующими изменениями: 30-минутный лизис на стадии 3 включает необязательное расщепление РНКазой А и элюирование в 3 × 200 мкл AE ( Каждый вИ затем объединить элюции).
      3. Сохраните аликвоту (не менее 20 мкл) для qPCR (см. Шаг 4.1). Для количественной оценки до концентрирования, сохраните дополнительные 1 мкл для высокочувствительной количественной оценки.
      4. При желании, протекайте с концентрацией проб.
  4. Концентрация проб с использованием коммерческих фильтров
    ПРИМЕЧАНИЕ. Дополнительную информацию см. В коммерческом протоколе 26 . В зависимости от использования в нисходящем потоке может не потребоваться концентрация проб ( например, для конечных точек PCR и приложений qPCR). Однако для построения библиотеки NGS, вероятно, потребуется сконцентрировать разбавленную органелларную ДНК, полученную после экстракции ДНК.
    1. Обработка колонны
      1. Осторожно предварительно взвешивайте (см. Таблицу 2 ) пустой блок фильтра (без трубки) на чистом куске взвешивающей бумаги на цифровом аналитическом балансе. Запишите вес.
      2. ПиПлетте комбинированные элюирования в блок фильтра и тщательно взвешивайте снова.
        ПРИМЕЧАНИЕ. В коммерческом руководстве 26 говорится, что максимальный объем блока фильтра составляет 500 мкл, но до 575 мкл можно одновременно добавлять в блок без переполнения.
      3. Осторожно поместите заполненный фильтрующий блок в трубку (снабженную колонками). Центрифугируйте при 500 xg в течение желаемого времени для достижения требуемого объема концентрата. Для объема образца, равного ~ 575 мкл, 20-минутный спин обычно приводит к концентрации концентрата 15-30 мкл.
      4. Выньте фильтр из трубки и снова взвешивайте. Используйте таблицу, чтобы определить, достигнут ли желаемый объем концентрата. Если нет, снова центрифугируйте при 500 xg в течение более короткого промежутка времени и снова взвешивайте; Повторите до тех пор, пока не будет достигнут желаемый объем концентрата.
      5. Поместите новую трубку (снабженную колоннами) поверх блока фильтра и инвертируйте. Центрифуга в течение 3 мин при 1000 мкг для передачи coНейтралитет к трубке.
      6. Определите объем восстановленного. Обычно это будет на 3 - 5 мкл меньше расчетного объема из-за сохранения фильтра. Если чрезмерно концентрированный, разбавленный стерильной водой или TE для достижения желаемого объема.
      7. Количественное определение ДНК с использованием высокочувствительной количественной оценки (согласно инструкциям производителя).

3. Способ №2: Метил-фракционирование (MF) Подход к обогащению для органеллярной ДНК из общей геномной ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ. Этот протокол был модифицирован из разработанного пользователем протокола извлечения ДНК Genomic Tip Kit для растений и грибов 27 и коммерческого протокола 28 для микробиологического обогащения ДНК. Теоретически, любой протокол выделения ДНК, который дает высокомолекулярную ДНК, может быть использован для раскрытия. Для секвенирования с коротким считыванием любая экстракция, дающая преимущественно фрагменты размером более 15 т.п.н., подходит для использования в раскрывающемся списке. Для loNg-read, могут потребоваться более крупные фрагменты. Поэтому мы оптимизировали этот протокол для получения высокомолекулярной ДНК.

  1. Выделение полной ДНК
    ПРИМЕЧАНИЕ. См. Список необходимого оборудования и реагентов и подготовьте необходимые буферы и рабочие запасы для Метода № 2 ( Таблица 1 ). Добавьте лизирующие ферменты в лизисный буферный буфер, чтобы сделать рабочий раствор лизирующего буфера. Включите термомиксер и установите его на 37 ° C. Включите водяную баню до 50 ° C и положите буфер QF в ванну. Поместите 70% EtOH в морозильник и установите микроцентрифуг на 4 ° C.
    1. Полная экстракция ДНК с использованием коммерческих колонок для экстракции ДНК
      ПРИМЕЧАНИЕ. Перед началом ознакомьтесь с коммерческим справочником 29 для получения подробной информации об использовании колонок анионного обмена гравитационного потока. Столбы могут быть установлены с использованием специализированной стойки или размещены над трубами с использованием прилагаемых пластиковых колец. Все этапы, включая gЭномические наконечники, должны пропускаться под действием силы тяжести, а остаточная жидкость НЕ должна быть пропущена.
      1. Измельчить 20 мг замороженной ткани в жидком азоте в 2-мл трубке с низким связыванием с использованием ручных мелющих пестиков, предназначенных для 2-мл пробирки.
      2. Добавьте 2 мл рабочего раствора лизирующего буфера (трубки будут очень полными).
      3. Инкубировать в термомиксере при 37 ° С в течение 1 ч при осторожном перемешивании со скоростью 300 об / мин. Если термомиксер недоступен, подходящей альтернативой является инкубация на тепловом блоке и перемешивание путем мягкого щелчка каждые 15 минут.
      4. Добавьте 4 мкл РНКазы А (100 мг / мл, конечная концентрация 200 мкг / мл). Инвертировать для смешивания и инкубации в термомиксере в течение 30 мин при 37 ° С с осторожным перемешиванием со скоростью 300 об / мин.
      5. Добавить 80 мкл протеиназы К (20 мг / мл, конечная концентрация 0,8 мг / мл), инвертировать для смешивания и инкубировать в термомиксере в течение 2 ч при 50 ° С с осторожным перемешиванием со скоростью 300 об / мин.
      6. Центрифуга в течение 20 мин при 4 ° С и 15000 xg для гранулирования нерастворимых обломков.
      7. В то время как образцы центрифугируют, уравновешивают колонки с 1 мл буфера QBT и позволяют колонне пустить гравитационным потоком.
      8. Используйте наконечник пипетки с широким отверстием, чтобы быстро применить образец (избегать гранулы) до уравновешенной колонки и дать ему полностью протекать через колонку. Если образец снова станет облачным, фильтром или центрифугой перед нанесением на столбец (см. Коммерческое руководство для деталей 29 ).
      9. После того, как образец полностью вступил в смолу, промойте колонку 4 х 1 мл буфера QC.
      10. Приостановить колонку на чистой, 2 мл, с низкой связующей микроцентрифужной пробиркой. Элюируют геномную ДНК с 0,8 мл буферного QF, предварительно нагретого до 50 ° C.
      11. Осаждайте ДНК путем добавления 0,56 мл (0,7 объема буфера для элюирования) изопропанола с комнатной температурой к элюированной ДНК.
      12. Перемешивают путем инверсии (10X) и центрифугируют в течение 20 мин при 15000 × и 4 ° С. ЗаботаПолностью удалите супернатант, не нарушая стекловидного, слабо прикрепленного гранулы.
      13. Промыть центрифугированную ДНК-таблетку 1 мл холодного 70% этанола. Центрифуга в течение 10 мин при 15000 xg и 4 ° C.
      14. Осторожно удалите супернатант (будьте осторожны с этим шагом), не нарушая осадок. Сушили на воздухе в течение 5-10 мин и ресуспендировали ДНК в 0,1 мл буфера для элюирования (ЕВ). Растворяют ДНК в течение ночи при комнатной температуре. Избегайте пипетирования, который может срезать ДНК.
      15. Количественное определение образцов с использованием высокочувствительного анализа количественной оценки ДНК (согласно инструкциям производителя).
  2. Фракционирование на основе бисера метилированной и неметилированной ДНК
    ПРИМЕЧАНИЕ. В недавней публикации было продемонстрировано использование коммерчески доступного набора 28 , в котором используется раскрытый подход, в котором используется CpG-специфический белок с метилсвязывающим доменом, слитый с фрагментом Fc человеческого IgG (белок MBD2-Fc) до фракции(Неметилированный) из ядерного генома (сильно метилированного) содержания 23 . Эффективность фракционирования в образцах пшеницы ранее не тестировалась с использованием этого коммерческого набора MF 28 .
    1. Что нужно сделать перед запуском
      1. Свежеприготовить 80% этанола (по меньшей мере 800 мкл на реакцию). Устанавливают 5-кратный буфер связывания / промывки для оттаивания на льду и готовят 5 мл 1-кратного буфера на образец (разбавленный буфер 5X стерильной, без нуклеазной воды и оставляют на льду во время протокола).
    2. Подготовьте MBD2-Fc белковые магнитные бусины
      1. Подготовьте необходимое количество наборов шариков. Масштабируйте реакции, чтобы использовать от 1 до 2 мкг общей входной ДНК, требуя 160 - 320 мкл шариков. Обратите внимание, что перечисленные ниже реакции рассчитаны на 1 мкг общей входной ДНК, поэтому они требуют 160 мкл шариков. Масштабируйте реакции в соответствии с потребностями.
      2. Используя наконечники с широким отверстием, аккуратно пипетируйте белок A Magnetic BЧтобы создать однородную суспензию. В качестве альтернативы осторожно вращайте трубку шариков в течение 15 минут при 4 ° C.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Не встряхивайте шарики.
      3. Приступайте к указаниям изготовителя 28 .
    3. Захват метилированной ядерной ДНК
      1. Для каждого отдельного образца добавьте 1 мкг входной ДНК в пробирку, содержащую 160 мкл связанных с MBD2-Fc магнитных гранул.
      2. Добавьте 5x связующий / промывочный буфер, если необходимо, с учетом объема входного образца ДНК для конечной концентрации 1x (объем 5x связующего / промывочного буфера для добавления (мкл) = объем входной ДНК (мкл) / 4). Пипетируйте образец вверх и вниз несколько раз, чтобы перемешать, используя наконечник пипетки с широким отверстием.
      3. Поверните трубки при комнатной температуре в течение 15 мин. Осторожно пипетируйте образцы с помощью наконечника пипетки с широким отверстием и прокрутите образцы 2 - 3 раза на протяжении всей инкубации, чтобы предотвратить скопление шариков.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Пипетка и фликкиNg имеет решающее значение для обеспечения эффективного раскрытия метилированной ДНК.
    4. Собирать обогащенную, неметилированную органелларную ДНК
      1. Кратко спин трубки, содержащей ДНК и MBD2-Fc-связанной магнитной шариковой смеси. Поместите трубку на магнитную стойку не менее 5 минут, чтобы собрать бусины сбоку от трубки. Решение должно выглядеть ясным.
      2. Используя наконечники с широким отверстием, осторожно удалите очищенный супернатант, не нарушая бусины. Перенесите супернатант (содержащий неметилированную, обогащенную органеллами ДНК) в чистую, с низкой связью, 2-мл микроцентрифужную пробирку. Храните этот образец при -20 или -80 ° C или переходите непосредственно к шагу 3.2.6 для очистки.
    5. Элюат захватил ядерную ДНК из магнитных гранул MBD2-Fc
      1. Если ядерная фракция также желательна, следуйте инструкциям изготовителя 28, чтобы элюировать ядерную ДНК из связанных с MBD2-Fc магнитных гранул; Очистить, как описано на этапе 3.2.7.
    6. Очистка нуклеиновой кислоты на основе бисера
      1. Убедитесь, что гранулы очистки находятся при комнатной температуре и тщательно перемешаны. Выполните протокол в соответствии с инструкциями в руководстве MF kit 28 .
        ПРИМЕЧАНИЕ. Образец теперь можно использовать для построения библиотеки NGS или другого последующего анализа.

4. Количественная оценка и контроль качества

  1. Анализ qPCR для оценки органического обогащения
    ПРИМЕЧАНИЕ. Параметры реакции и анализа qPCR, перечисленные здесь, были предназначены для использования на Roche LightCycler 480 и, возможно, их необходимо настроить для различного оборудования и реагентов. Если qPCR недоступен, конечная точка PCR и визуализация на агарозном геле могут быть использованы в качестве качественного показателя чистоты образца, используя те же самые праймеры и условия, описанные здесь. Размеры Amplicon будут ~ 150 bp для всех наборов праймеров. См. Таблицу 3 для секвенирования праймераCes и спаривания.
    1. Настройка реакции qPCR
      1. Чтобы настроить отдельную реакцию 20 мкл qPCR, осторожно пипеткой в ​​одну лунку 96-луночного планшета qPCR: 10 мкл 2x SYBR Green I Master; 2 мкл 10 мкМ смеси прямого и обратного праймеров (для конечной концентрации 0,5 мкМ); 2 мкл шаблона (в пределах стандартной кривой); И 6 мкл стерильного, не содержащего нуклеазы H 2 O. Чтобы уменьшить ошибки пипетирования, предпочтительно сделать мастер-смесь со всеми компонентами реакции, кроме шаблона. Добавьте мастер-микс к пластине qPCR, а затем добавьте шаблон, представляющий интерес для каждой лунки. Для минимизации последствий ошибки пипетирования необходимо выполнить три технических повторения для каждого образца.
        ПРИМЕЧАНИЕ. В конечном счете, отношение ядерных циклов квантования атомов к органеллам сравнивается между образцами, поэтому допустимы незначительные различия в концентрации. Однако концентрации ДНК должны быть примерно в пределах eaCh другой.
      2. Уплотните пластину высококачественной уплотнительной пленкой qPCR. Аккуратно встряхните образцы, стараясь избегать создания пузырьков. Кратко открутите планшет в течение 2 минут при 4 ° C для сбора образца и устранения любых мелких пузырьков.
      3. Загрузите пластину в машину. Запустите программу qPCR согласно приведенным ниже рекомендациям.
    2. Параметры реакции qPCR
      ПРИМЕЧАНИЕ. Это параметры по умолчанию, за исключением цикла отжига на стадии усиления. Отрегулируйте эту настройку, чтобы разместить конкретные праймеры, если те, которые используются, отличаются от праймеров, представленных в этом протоколе.
      1. Предварительно инкубировать при 95 ° С в течение 5 мин с частотой рампы 4,4 ° С / с.
      2. Выполните 45 циклов амплификации (1) 95 ° C в течение 10 с с частотой рампы 4,4 ° C / с; (2) 60 ° С в течение 20 с, с разбросом 2,2 ° С / с; И (3) 72 ° C в течение 10 с, с разбросом 4,4 ° C / с (данные, полученные во время (3)).
      3. Используйте опциюЦикл кривой расплава в расплаве 95 ° С в течение 5 с при скорости рампы 4,4 ° С / с; 65 ° С в течение 1 мин, с разбросом 2,2 ° С / с; И 97 ° C, с непрерывным режимом сбора.
      4. Используйте цикл охлаждения 40 ° C в течение 30 с при скорости рампы 1,5 ° C / с.
    3. Параметры анализа
      1. Выберите шаблон SYBR. Проверьте параметры программы на кнопке «Эксперимент». После загрузки пластины анализ можно запустить, и настройки могут быть отрегулированы во время анализа.
      2. Назначьте образцы с помощью редактора образцов. Выберите Abs Quant в качестве рабочего процесса и укажите образцы как неизвестные, стандарты или отрицательные элементы управления. Назначьте репликации и заполните имена образцов первого из каждого репликации. Добавьте концентрации и единицы в стандарты.
      3. Настроить подмножества для анализа; Они назначаются в редакторе подмножества.
      4. Для анализа выберите Abs Quant / 2nd Derivative Max из списка «Создать новый анализ».Импортируйте внешнюю сохраненную стандартную кривую (если применимо), а затем нажмите вычисление; Отчет будет содержать выбранную информацию.
      5. Для выполнения точной абсолютной количественной оценки для определения количества копий или концентрации используйте стандартную кривую, которая является репрезентативной для тестируемого образца ( например, органелларная ДНК, выделенная из вышеуказанных методов). Поскольку количество митохондриальной ДНК, необходимое для подготовки стандартной кривой, слишком велико для достижения достаточного количества ткани, не используйте вычисления количества копий, предоставляемые программным обеспечением, а вместо этого проверяйте значения точки пересечения (Cp) для определения относительного обогащения Органеллара по сравнению с ядерной ДНК в образцах. Сравните эти относительные количества с суммарной геномной ДНК (см. Представительские результаты ). Эффективность тестового праймера при пяти разведениях 1:10 общей геномной ДНК из полностью светлых, двухнедельных семян пшеницы (репрезентативная эффективность, указанная вE легенда на рисунке 2 ).
  2. Электрофорез в импульсном поле (PFGE)
    ПРИМЕЧАНИЕ. Этот протокол основан на рекомендациях производителя для выполнения PFGE для разрешения высокомолекулярной ДНК. См. Таблицу материалов.
    1. Подготовка геля и образцов
      1. Следуйте рекомендациям по подготовке геля и образцов и адаптируйте их к доступной системе.
    2. Запуск параметров
      1. Следуйте рекомендациям по настройке системы электрофореза и используйте следующие параметры: начальное время переключения 2 с, конечное время переключения 13 с, время работы 15 ч и 16 мин, В / см 6 и включенный угол 120 ° ,
    3. Пятно и изображение геля
      1. Пятно гель с красителем выбора ( например, бромид этидия или подходящая альтернатива) и изображение с подходящей системой документации на гель.
  3. NGS и анализ
    1. Используйте 1 нг ДНК в качестве входного сигнала для набора ДНК-библиотеки Prep Kit в соответствии с инструкциями производителя.
    2. Штрих-код и объединить образцы для секвенирования за один проход. Выполните последовательность в соответствии с рекомендациями производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Параметры пула и последовательности могут быть изменены в зависимости от интересующих видов, желаемого уровня покрытия и платформы, используемой для последовательности библиотек. Например, полоса HiSeq имеет значительно больший выход, чем дорожка MiSeq, поэтому многие другие образцы могут быть мультиплексированы. Последовательность меньшего подмножества выборок, чтобы определить, достаточны ли уровни охвата органеллогенных геномов для анализа ниже по течению.
    3. Изучите качество чтения с помощью FastQC 31, чтобы определить степень обрезки и фильтрации, требуемую для данных.
    4. Обрезать и фильтровать необработанные чтения с помощью Trimmomatic 32 или другой сопоставимой программы. Используйте следующие настройки: ILLUMINACLIP 2:30:10 (для удаления адаптеров), ВЕДУЩИЙ 3, ТРЕНИРОВКА 3, СКОЛЬЖЕНИЕ ВИДЕО 4:10 и МИНЛЕН 100.
    5. Сопоставьте обработанную по качеству фильтрованную и адаптированную по частям парную конец (PE), чтобы прочитать митохондрию китайской пружины (NCBI Reference Sequence NC_007579.1 33 ), хлоропласт (NCBI Reference Sequence NC_002762.1 34 ) и ядерные 35 эталонных геномов с использованием Bowtie2 36 , Со следующими настройками: -I 0 -X 800 - чувствительный.
    6. Преобразуйте файлы выравнивания sam в формат bam (samtools) и отсортируйте файлы bam. Используйте файлы bam, чтобы рассчитать охват генома и покрытие каждой базой с помощью постельных принадлежностей. Визуализируйте результаты с помощью функции R-plot.

Результаты

Протоколы, представленные в этой рукописи, описывают два разных метода обогащения органелларной ДНК из растительной ткани. Представленные здесь условия отражают оптимизацию для ткани пшеницы. Сравнение основных этапов протоколов, требуемого ввода ткани и выхода ДН?...

Обсуждение

На сегодняшний день большинство исследований органолептических секвенирования сосредоточены на традиционных методах DC, чтобы обогатить специфическую ДНК. Были описаны способы выделения органелл из различных растений, включая мох 40 ; Однодольные, такие как пшеница

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Упоминание торговых наименований или коммерческих продуктов в этой публикации исключительно для целей предоставления конкретной информации и не подразумевает рекомендации или одобрения Департамента сельского хозяйства США. USDA является поставщиком равных возможностей и работодателем.

Благодарности

Мы хотели бы отметить финансирование со стороны Министерства сельского хозяйства США по сельскохозяйственным исследованиям и Национального научного фонда (IOS 1025881 и IOS 1361554). Мы благодарим Р. Каспера за техобслуживание и уход за теплицами. Мы также благодарим Университет Миннесотского геномического центра, где были подготовлены и упорядочены библиотеки Illumina. Мы также благодарны за комментарии редакторов журнала и четырех анонимных рецензентов, которые еще больше укрепили нашу рукопись. Мы также благодарим ОЭСР за стипендию SK по интеграции этих протоколов для совместных проектов с коллегами из Японии.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol; BME)Sigma AldrichM3148-100ml
2-propanol (Isopropyl alcohol/isopropanol), bioreagentSigma AldrichI9516
agarose, Bio-Rad Cetified Megabase agaroseBio-Rad1613108
analytical balanceMettler ToledoAB54-S
balanceMettler ToledoPB1502-S
bovine serum albumin (BSA)Sigma AldrichB4287-25G
Ceramic grinding cylinders, 3/8in x 7/8inSPEX SamplePrep2183
Cryogenic Blocks compatible with tissue homogenizer for holding 50 ml tubesSPEX SamplePrep2664
DNaseISigmaDN25
ethanol, absoluteDecon Laboratories2716
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), 0.5M Solution, pH8.0FisherBP2482-500
gel imaging system
gel stainSuch as GelRed or Ethidium Bromide
grinding pestle, wide tip for 2 ml conical tubes
Guanidine-HCl, 8M solutionThermoFisher24115
LightCycler 480 SYBR Green I MasterRoche4707516001
liquid nitrogen
Lysing enzymes from Trichoderma harzianumSigmaL1412
Magnesium ChlorideG Bioscience24115
magnetic rackThermoFisherA13346
microcentrifuge tubes, LoBind 1.5 ml Eppendorf22431021
microcentrifuge tubes, standard nuclease-free 1.5 mlEppendorf
microcentrifuge, refrigeratedSorvall Legend X1ROr equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotors for 50 ml tubes, Oak Ridge tubes, and 1.5 ml tubes
microcentrifuge, room temperatureEppendorf5424Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotor for 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes
Microcon DNA Fast Flow Centrifugal Filter UnitsEMD MilliporeMRCFOR100
Miracloth, 1 square per sample cut to fit funnelEMD Millipore475855
NEBNext Microbiome DNA Enrichment KitNew England BiolabsE2612L
parafilmParafilm MPM992
plastic pots and trays
polyvinylpyrrolidone (PVP)FisherBP431-100
Proteinase KQiagen19131
Pulsed-Field Gel Electrophoresis rig (e.g. CHEF DR III)Bio-Rad1703697
purification beads, Agencourt AMpureXP beadsBeckman CoulterA63881
QIAamp DNA Mini KitQiagen51304
Qiagen 20/g Genomic Tip DNA Extraction KitQiagen10223
Qiagen Buffer EB (elution buffer)Qiagen19086
Qiagen DNA Extraction Buffer SetQiagen19060
QiaRackQiagen19015
qPCR machine (e.g. Roche Light Cycler 480)Roche
qPCR plate sealing filmRoche4729757001
qPCR plate, 96 well plateRoche4729692001
Qubit assay tubesLife TechnologiesQ32856
Qubit Broad Spectrum assay kitLife TechnologiesQ32850
Qubit High Sensitivity assay kitLife TechnologiesQ32851
RNaseAQiagen19101
Serological pipettes (20 ml) and pipet-aidFisher13-678-11
Small funnels, 1 per sample
Sodium ChlorideAmbionAM9759
Soft paintbrush, 2 per sample
SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder or another type of tissue homogenizerSPEX SamplePrepOr another comparable tissue homogenizer. If you do not have access to a tissue homogenizer, then grinding in a pre-chilled mortar and pestle will suffice (see protocol for details). However, a homogenizer will give more consistent results and total homogenization time is reduced.
SucroseOmnipure8550
TBE
thermomixer
TrisSigmaT2819-100ml
Triton X-100PromegaH5142
tube rotater
tubes, 50 mL conical polypropyleneCorning352070
tubes, 50 ml high-speed polypropylene ThermoScientific/Nalgene3119-0050e.g. Nalgene Oakridge tubes or equivalent
vermiculite
water bath
water, sterile and certified Nuclease-free Fisher1481
water, sterile milliQ

Ссылки

  1. Liberatore, K. L., Dukowic-Schulze, S., Miller, M. E., Chen, C., Kianian, S. F. The role of mitochondria in plant development and stress tolerance. Free Radic Biol Med. 100, 238-256 (2016).
  2. Samaniego Castruita, J. A., Zepeda Mendoza, M. L., Barnett, R., Wales, N., Gilbert, M. T. Odintifier--A computational method for identifying insertions of organellar origin from modern and ancient high-throughput sequencing data based on haplotype phasing. BMC Bioinformatics. 16 (232), 1-13 (2015).
  3. Zhang, T., Zhang, X., Hu, S., Yu, J. An efficient procedure for plant organellar genome assembly, based on whole genome data from the 454 GS FLX sequencing platform. Plant Methods. 7 (38), 1-8 (2011).
  4. Wambugu, P. W., Brozynska, M., Furtado, A., Waters, D. L., Henry, R. J. Relationships of wild and domesticated rices (Oryza AA genome species) based upon whole chloroplast genome sequences. Sci Rep. 5 (13957), 1-9 (2015).
  5. Iorizzo, M., et al. De novo assembly of the carrot mitochondrial genome using next generation sequencing of whole genomic DNA provides first evidence of DNA transfer into an angiosperm plastid genome. BMC Plant Biol. 12 (61), 1-17 (2012).
  6. Park, S., et al. Complete sequences of organelle genomes from the medicinal plant Rhazya stricta (Apocynaceae) and contrasting patterns of mitochondrial genome evolution across asterids. BMC Genomics. 15 (405), 1-18 (2014).
  7. Skippington, E., Barkman, T. J., Rice, D. W., Palmer, J. D. Miniaturized mitogenome of the parasitic plant Viscum scurruloideum is extremely divergent and dynamic and has lost all nad genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (27), E3515-E3524 (2015).
  8. Wicke, S., Schneeweiss, G. M., Hörandl, E., Appelhans, M. Chapter 1. Next Generation Sequencing in Plant Systematics. , (2015).
  9. Sloan, D. B. One ring to rule them all? Genome sequencing provides new insights into the 'master circle' model of plant mitochondrial DNA structure. New Phytol. 200 (4), 978-985 (2013).
  10. Woloszynska, M. Heteroplasmy and stoichiometric complexity of plant mitochondrial genomes--though this be madness, yet there's method in't. J Exp Bot. 61 (3), 657-671 (2010).
  11. Ahmed, Z., Fu, Y. B. An improved method with a wider applicability to isolate plant mitochondria for mtDNA extraction. Plant Methods. 11 (56), 1-11 (2015).
  12. Ejaz, M., et al. Comparison of small scale methods for the rapid and efficient extraction of mitochondrial DNA from wheat crop suitable for down-stream processes. Genet Mol Res. 13 (4), 10320-10331 (2014).
  13. Eubel, H., Heazlewood, J. L., Millar, A. H. Isolation and subfractionation of plant mitochondria for proteomic analysis. Methods Mol Biol. 355, 49-62 (2007).
  14. Hao, W., Fan, S., Hua, W., Wang, H. Effective extraction and assembly methods for simultaneously obtaining plastid and mitochondrial genomes. PLoS One. 9 (9), e108291 (2014).
  15. Pomeroy, M. K. Studies on the respiratory properties of mitochondria isolated from developing winter wheat seedlings. Plant Physiol. 53 (4), 653-657 (1974).
  16. Taylor, N. L., Stroher, E., Millar, A. H. Arabidopsis organelle isolation and characterization. Methods Mol Biol. 1062, 551-572 (2014).
  17. Triboush, S. O., Danilenko, N. G., Davydenko, O. G. A method for isolation of chloroplast DNA and mitochondrial DNA from Sunflower. Plant Mol Biol Rep. 16 (2), 183-189 (1998).
  18. Pinard, R., et al. Assessment of whole genome amplification-induced bias through high-throughput, massively parallel whole genome sequencing. BMC Genomics. 7 (216), 1-21 (2006).
  19. Lamble, S., et al. Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based Nextera system. BMC Biotechnol. 13 (104), 1-10 (2013).
  20. Raley, C., et al. Preparation of next-generation DNA sequencing libraries from ultra-low amounts of input DNA: Application to single-molecule, real-time (SMRT) sequencing on the Pacific Biosciences RS II. bioRxiv. , (2014).
  21. Tsai, Y. C., et al. Resolving the Complexity of Human Skin Metagenomes Using Single-Molecule Sequencing. MBio. 7 (1), e01948 (2016).
  22. Feehery, G. R., et al. A method for selectively enriching microbial DNA from contaminating vertebrate host DNA. PLoS One. 8 (10), e76096 (2013).
  23. Yigit, E., Hernandez, D. I., Trujillo, J. T., Dimalanta, E., Bailey, C. D. Genome and metagenome sequencing: Using the human methyl-binding domain to partition genomic DNA derived from plant tissues. Appl Plant Sci. 2 (11), 1-6 (2014).
  24. Noyszewski, A. K., et al. Accelerated evolution of the mitochondrial genome in an alloplasmic line of durum wheat. BMC Genomics. 15 (67), 1-16 (2014).
  25. . QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2016)
  26. . User developed protocol: Isolation of genomic DNA from plants and filamentous fungi using the QIAGEN Genomic-tip - (EN) Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2001)
  27. . QIAGEN Genomic DNA Handbook Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2012)
  28. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  29. Ogihara, Y., et al. Structural dynamics of cereal mitochondrial genomes as revealed by complete nucleotide sequencing of the wheat mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 33 (19), 6235-6250 (2005).
  30. Ogihara, Y., et al. Structural features of a wheat plastome as revealed by complete sequencing of chloroplast DNA. Mol Genet Genomics. 266 (5), 740-746 (2002).
  31. International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC). A chromosome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat (Triticum aestivum) genome. Science. 345 (6194), (2014).
  32. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  33. Bendich, A. J. Why do chloroplasts and mitochondria contain so many copies of their genome?. Bioessays. 6 (6), 279-282 (1987).
  34. Kumar, R. A., Oldenburg, D. J., Bendich, A. J. Changes in DNA damage, molecular integrity, and copy number for plastid DNA and mitochondrial DNA during maize development. J Exp Bot. 65 (22), 6425-6439 (2014).
  35. Ma, J., Li, X. Q. Organellar genome copy number variation and integrity during moderate maturation of roots and leaves of maize seedlings. Curr Genet. 61 (4), 591-600 (2015).
  36. Lang, E. G., et al. Simultaneous isolation of pure and intact chloroplasts and mitochondria from moss as the basis for sub-cellular proteomics. Plant Cell Rep. 30 (2), 205-215 (2011).
  37. Tobin, A. K. Subcellular fractionation of plant tissues. Isolation of chloroplasts and mitochondria from leaves. Methods Mol Biol. 59, 57-68 (1996).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

125

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены