Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

İki bitki organelleri DNA zenginleştirme yönteminin karşılaştırılması ve optimizasyonu sunulmaktadır: geleneksel diferansiyel santrifüjleme ve metilasyon durumuna dayalı toplam gDNA'nın fraksiyonlanması. Ortaya çıkan DNA miktarını ve kalitesini değerlendirir, kısa okunmuş yeni nesil dizilemede performans gösteririz ve uzun okunan tek moleküllü dizilemede kullanım potansiyelini tartışırız.

Özet

Bitki organelleri genomları, kompleks yapıları ve / veya alt genomik parçaları oluşturmak için eşleştirme veya rekombinasyona uğrayabilen büyük, tekrarlayan elementler içerir. Organeller genomları aynı zamanda belirli bir hücre veya doku türünün (heteroplasmi) katkı maddelerinde bulunur ve alt tiplerin bolluğu, gelişim boyunca veya stres altındayken (alt stoikometrik kayma) değişebilir. Organelar genom yapısını ve fonksiyonunu daha iyi anlamak için yeni nesil sıralama (NGS) teknolojileri gereklidir. Geleneksel sıralama çalışmaları organellar DNA elde etmek için çeşitli yöntemler kullanır: (1) Başlangıç ​​dokusu büyük miktarda kullanılırsa, homojenize edilir ve diferansiyel santrifüjleme ve / veya degrade saflaştırma tabi tutulur. (2) Daha az miktarda doku kullanılırsa ( yani, tohum, malzeme veya alan sınırlıysa), yeterli DNA elde etmek için (1) 'de olduğu gibi aynı işlem gerçekleştirilir ve bunu takiben tam genom amplifikasyon uygulanır. (3) Biyoenformatik analiz seq için kullanılabilirToplam genomik DNA'yı ve organelar okumaları ayrıştırmak. Bütün bu yöntemlerin kendi zorlukları ve zıvanaları vardır. (1) 'te bu kadar büyük miktarda başlangıç ​​dokusu elde etmek zor olabilir; (2) 'de, bütün genom amplifikasyonu bir sıralama ön yargı getirebilir; Ve (3) de, nükleer ve organel genomları arasındaki homoloji, toplanma ve analizi etkileyebilir. Büyük nükleer genomlara sahip bitkilerde, biyoinformatik analizler için sekanslama maliyetlerini ve sekans karmaşıklığını azaltmak için organellar DNA'yı zenginleştirmek avantajlıdır. Burada, toplam genomik DNA'yı nükleer ve organellar fraksiyonlara ayırmak için, geleneksel diferansiyel santrifüj yöntemini, adapte edilmiş bir CpG-metil açılım yaklaşımı olan dördüncü bir yöntemle karşılaştırabiliriz. Her iki yöntem de, organellar sekanslar için oldukça zenginleştirilmiş DNA olan NGS için yeterli miktarda DNA üretir; buna rağmen, mitokondriya ve kloroplastlarda farklı oranlarda bulunur. Buğday yaprak dokusu için bu yöntemlerin optimizasyonunu sunmak ve önemli avantajları tartışmak veÖrnek giriş, protokol kolaylığı ve akışaşağı uygulama bağlamında her yaklaşımın avantajları.

Giriş

Genom dizilimi, önemli bitki özelliklerinin altında yatan genetik temeli incelemek için güçlü bir araçtır. Çoğu genom dizilimi çalışması genlerin çoğunluğu çekirdekte yer aldığı için nükleer genom içeriğine odaklanır. Bununla birlikte, mitokondri (ökaryotlarda) ve plastidler (bitkilerde, özel form, kloroplast, fotosentezde çalışır) de dahil olmak üzere organellar genomları, organizmanın gelişimi, stres tepkisi ve genel uyum için gerekli olan önemli genetik bilgilere katkıda bulunur 1 . Organelar genomları nükleer genom dizilimi için toplam DNA ekstraksiyonlarında tipik olarak yer alır, ancak DNA ekstraksiyonundan önce organel sayıları azaltma yöntemleri de kullanılır 2 . Birçok çalışma, organellar genomlarını 3 , 4 , 5 ve 6 numaralı gruplara toplamak için toplam gDNA özütlemelerinden sıralama sonuçlarını kullandı.Xref "> 6 , 7. Bununla birlikte, çalışmanın amacı organellar genomlara odaklanmaktır, toplam gDNA'yı kullanmak sıralamaya ilişkin maliyetleri arttırır çünkü birçok okuma, özellikle büyük nükleer genomlara sahip bitkilerde çekirdek DNA dizileri için" kaybolur " Ayrıca, organellar sekansların nükleer genom ve organeller arasında kopyalanması ve aktarılması nedeniyle, dizileme okumalarının doğru haritalama pozisyonunu uygun genoma çevirmek bioinformatik olarak zorlayıcıdır 2 , 8. Organelar genomlarının nükleer genomdan saflaştırılması bir Bu problemleri azaltmak için strateji. Mitokondri ve kloroplastlar arasındaki homoloji bölgeleriyle eşleşen okumaları ayırmak için daha fazla biyoenformatik stratejiler kullanılabilir.

Birçok bitki türünden gelen organellar genomları sıralanırken, organellar genom çeşitliliğinin genişliği hakkında pek az şey bilinmektedirYabani popülasyonlarda veya ekili yetiştirme havuzlarında kullanılabilir. Organel genomları, aynı zamanda, tekrar sıraları 9 arasında rekombinasyon için önemli yapısal yeniden düzenlenmeye uğramayan dinamik moleküller olduğu bilinmektedir. Dahası, organellar genomun çok sayıda kopyası her bir organel içinde bulunur ve her hücrede birden fazla organel bulunur. Bu genomların tüm kopyaları aynı değildir, bu heteroplasmi olarak bilinir. Kanonik resimde aksine "ana çevrelerinde," alt-genomik daire, doğrusal kromozomlar, doğrusal konkatamerler ve dallanmış yapılar 10 de dahil olmak üzere organel genom yapılar, daha karmaşık bir görüntü için hemen giderek artan kanıtlar bulunmaktadır. Bitki organelleri genomlarının toplanması, nispeten büyük boyutları ve önemli ters çevrilmiş ve doğrudan tekrarlamalarıyla daha da karmaşıktır.

Organelar izolasyonu, DNA saflaştırması ve sonraki genom için geleneksel protokoller E dizilimi sıklıkla hantaldır ve başlangıç ​​noktasında 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 olması gereken yüzlerce gramdan daha fazla genç yaprak dokusundan birkaç gram yukarıya kadar doku girişinin büyük miktarlarını gerektirir. Bu, doku sınırlı olduğunda organellar genom sıralamasını erişilmez hale getirir. Bazı durumlarda, tohum miktarları, nesiller bazında veya geçiş yoluyla korunması gereken erkek steril hatlarda sıralanması gerektiğinde sınırlıdır. Bu durumlarda, organellar DNA saflaştırılabilir ve sonra bütün genom amplifikasyonuna tabi tutulabilir. Bununla birlikte, bütün genom amplifikasyonu, önemli yapısal sıralama önyargılarını ortaya çıkarabilir; bu, yapısal değişiklikleri, alt-genomik yapıları ve heteroplasmi seviyelerini değerlendirirken özel bir problemdir> 18. Kısa okunan sıralama teknolojileri için kütüphane hazırlığındaki son gelişmeler, tam genom amplifikasyonundan kaçınmak için düşük giriş engellerini aşmıştır. Örneğin Illumina Nextera XT kütüphane hazırlık kiti, girdi 19 olarak kullanılmak üzere 1 ng kadar az DNA'ya izin verir. Bununla birlikte, PacBio veya Oxford Nanopore sıralama teknolojileri gibi uzun okunan sıralama uygulamaları için standart kütüphane hazırlıkları, hala organellar genom dizilimi için zorluk oluşturabilen nispeten yüksek miktarda giriş DNA'sı gerektirir. Son zamanlarda, girdi miktarlarını azaltmak ve mikrogram-DNA miktarlarının elde edilmesinin zor olduğu örneklerde genom dizilimini kolaylaştırmak için yeni ve kullanıcı tarafından yapılmış uzun okunur sıralama protokolleri geliştirildi. 20 , 21 . Ancak, bu kütüphane preparatlarına beslemek için yüksek molekül ağırlıklı, saf organellar fraksiyonlarının elde edilmesi bir sorun teşkil etmektedir.

AradıkO Tam genom amplifikasyonuna ihtiyaç duymadan NGS için uygun olan organellar DNA zenginleştirme ve izolasyon yöntemlerini karşılaştırır ve optimize eder. Özellikle, amacımız, bir yaprak alt örneği gibi sınırlı başlangıç ​​malzemelerinden yüksek molekül ağırlıklı organellar DNA'yı zenginleştirmek için en iyi uygulamaların belirlenmesi idi. Bu çalışma, organellar DNA'yı zenginleştirmek için yöntemlerin karşılaştırmalı bir analizini sunmaktadır: (1) (2) ticari olarak mevcut bir DNA CpG-metil bağlama alanı proteini çekme yaklaşımının kullanılmasına dayanan bir DNA fraksiyonasyon protokolüne karşı (2) değiştirilmiş, geleneksel bir diferansiyel santrifüj protokolü 22 bitki dokusuna uygulanır 23 . Organel DNA'nın buğday yaprağı dokusundan izole edilmesi için, diğer bitkiler ve doku türlerine kolayca uzatılabilecek en iyi uygulamaları önermekteyiz.

Protokol

1. Organel İzolasyon ve DNA Ekstraksiyonu için Bitki Malzemelerinin Üretimi

  1. Buğday fidelerinin standart büyümesi
    1. Kök başına 4-6 tohum ile küçük, kare kaplarda vermikülit tohumları tohumlar. 16 saat ışık devri, 23 ºC gündüz / 18 ºC gece bir sera veya büyüme odasına aktarın.
    2. Bitkiler her gün su ister. Çimlenme üzerine ve çimlenmeden sonraki 7. günde ¼ çay kaşığı granül 20-20-20 NPK gübresi ile bitkiler dölleyin.
  2. Buğday fidelerinin alternatif etiyolasyonu
    1. Adım 1.1'i izleyin, ancak kapları 8 saat boyunca 16 saat / 18ºC'de 23 ° C'de koyu renk büyütme odasında yerleştirin. Alternatif olarak, seralardaki bitkileri örtün ( örn., Bir saklama kabı ile, ancak uygun havalandırma korunmalıdır).
  3. Büyüme ve doku toplama
    1. Bitkileri 12 - 14 gün boyunca büyütün. Çoğu buğday genotipi içinS, 75-100 fidan, farklı santrifüj yöntemini kullanarak iki organelar çıkarım için yeterli 10-12 g doku verir (bölüm 2); Nükleer DNA'dan organelleri fraksiyon haline getirmek için DNA CpG-metilasyona dayalı açılma yaklaşımını kullanırsak, yalnızca bir bitki gereklidir (bölüm 3).
    2. Diferansiyel santrifüj yaklaşımı kullanılıyorsa, dokuyu taze olarak toplayın ve bölüm 2'de açıklandığı gibi numunelerin işlenmesine hemen başlayın.
    3. CpG-metil açılma yaklaşımı kullanılıyorsa, genç yaprak dokusunun 20 mg'lık kesitlerini mikro santrifüj tüplerine hasat edin (standart büyümüş veya etilenmiş dokuyu kullanın, Temsilcisi Sonuçları'na bakın ). Sıvı nitrojende sıkıştırın ve kullanıma kadar -80 ºC'de dondurun. 3. bölümde anlatıldığı gibi, DNA'nın pulldown fraksiyonlamasına devam edin.

2. Yöntem # 1: Diferansiyel Santrifüj (DC) Kullanarak DNA Ekstraksiyonu

NOT: Farklılıkerential santrifüj protokolü iki organellere izole ancak mitokondri 17, 24 için zenginleştirmek üzere koşulları optimize iki yayınlardan modifiye edilmiştir. Elde edilen protokol daha az zaman alır ve daha önceki yöntemlere kıyasla daha az toksik kimyasal kullanır. Spesifik olarak, STE ekstraksiyon tamponuna polivinilpirolidon (PVP) eklenmesi ve sodyum florür (NaF) içeren NETF tamponundaki son yıkama adımının ortadan kaldırılması da dahil olmak üzere, tamponlar ve yıkama adımlarında değişiklikler yaptık.

Dikkat: Bu tampon 2-mercaptoethanol (BME) içerdiğinden, STE tamponunun hazırlanması ve kullanılması, uygun bir kişisel koruma ekipmanıyla kimyasal bir davlumbaz altında yapılmalıdır.

  1. Başlamadan önce yapılacaklar
    1. Tüm ekipmanın son derece temiz olduğundan emin olun ve otoklavlanabilir herhangi bir cihazı otoklavlayın ( örneğin, taşlama silindiri, yüksek hızlı merkezTüpler vb. ).
      NOT: Çapraz bulaşmayı önlemek için pipetleme gerektiren tüm adımlar için filtre uçları önerilir.
    2. Gerekli ekipman ve reaktiflerin listesini görün ve Yöntem # 1 için gerekli tamponları ve çalışma stoklarını hazırlayın ( Tablo 1 ). Kriyojenik öğütme bloklarını -20 ºC'ye, rotorları ve tamponları 4 ºC'ye soğutun, mikrosantrifüjü 4 ºC'ye getirin ve 37 ºC su banyosu açın.
  2. Organellerin izolasyonu
    1. 5 g taze dokuyu alın ve buz gibi soğutulmuş bir behergusta soğuk, steril suyla durulayın.
      NOT: Santrifüjler, davlumbazlar vb. Ile yapılan tüm işlemler ve nakliye esnasında örnekleri daima buzda tutun . Alternatif olarak, protokolü gerçekleştirmek için yeterli alana ve ekipmana erişim varsa soğuk bir odada çalışın.
    2. Makas kullanarak yaprak dokusunu ~ 1 cm'lik parçalar halinde doğrudan iki seramik öğütme içeren 50 mL tüp içine kessilindirler.
      NOT: Çapraz bulaşmayı önlemek için örnekler arasındaki makasları temizleyin veya değiştirin.
    3. Doku homojenleştiricisi yoksa, harç ve havlu kullanın ve adımlar 2.2.4 - 2.2.9'un yerine geçmek için izleyin.
      1. Yaprak dokusunu buz üzerinde önceden soğutulmuş harca kesin. Örnekleri 15 mL STE'de 2 - 3 dakika öğüttürün (davlumbazda).
      2. Önceden ıslak, steril bir filtreleme bezi (yaklaşık 22 ila 25 mikron gözenek boyutu, ayrıntılar için ana protokole bakın) içeren bir huni yoluyla tamponu (harç içindeki doku bırakın) başka bir 50 mL tüp içine boşaltın . Harca ve havaneye ilave 10 mL STE ekleyin ve tekrar homojenize edin.
      3. Homojenleştirilmiş dokuyu ve tamponu aynı huniye dökün. Harç ve havluyu 10 mL STE ile durulayın ve huniye dökün. Mümkün olduğunca çok sıvı almak için filtrasyon bezini huniye sıkıştırın ve sıkıştırın.
        NOT: Çapraz bulaşmayı önlemek için örnekler arasındaki eldivenleri değiştirin. Profesyonelle devam etAdım 2.2.10'da
    4. Her 50 mL tüpe 20 mL STE (duman kabininde) ilave edin.
    5. Numuneleri bir doku öğütme aparatı içinde önceden soğutulmuş kriyojenik öğütme bloklarına yerleştirin ve 1,750 rpm'de 2 x 30 saniye boyunca öğüttürün. Örnek pozisyonlarını döndürün ve numuneleri öğütücüler arasında yaklaşık 1 dakika buz üzerine yerleştirin.
      NOT: Bu basamakta bir havan ve havaneli karıştırıcı, blender veya diğer doku öğütücü / homojenleştirici cihaz kullanılabilir. Bununla birlikte, her yöntem elde edilen DNA kalitesini farklı derecelerde etkileyecektir ve bu nedenle, downstream uygulamalarla devam etmeden önce DNA uzunluğu ve kalitesi değerlendirilmelidir.
    6. Buz içine yerleştirilmiş temiz bir 50 mL tüpe bir huni yerleştirin. Huni içine bir kat filtreleme bezi yerleştirin ve 5 mL STE ile önceden ıslatın. Akışı atmayın.
    7. Homojenleştirilmiş dokuyu huniye boşaltın. 15 mL STE ile öğütme tüpünü durulayın, özetleyin ve tüpü ters çevirerek duvarları ve kapağı durulayın ve huniye dökünEl.
    8. Seramik taşları dikkatlice çıkarın ve sıkın ve filtreleme bezi huniye sıkıştırın.
      NOT: Çapraz bulaşmayı önlemek için örnekler arasındaki eldivenleri değiştirin.
    9. Dökülmesini önlemek için tüp kapaklarını parafilm ile sarın. 4 ºC'de 10 dakika süreyle 2000 x g'de santrifüjleyin.
    10. Dikkatlice serolojik bir pipet kullanarak süpernatantı aspire edin (pelleti rahatsız etmemek için) ve 50 mL yüksek hızlı santrifüj tüpüne yerleştirin (tüplerde sıkı conta contaları yoksa dökülmeyi önlemek için tüp kapaklarını parafilm ile sarın). Peletleri atın.
    11. Tüpleri STE kullanarak 0.1 g içinde dengeleyin ve elde edilen süpernatanı 18.000 xg ve 4 ° C'de 20 dakika santrifüjleyin. Tüpleri dengelemek için, buz üzerinde küçük bir buz bulup buz koyun, teraziyi dara alın ve örnekleri soğuk tutmak için buz üzerinde tartın. Alternatif olarak, soğuk bir odada bir terazi ve davlumbaz kullanın.
    12. Süpernatanı atın. Peleğe 1 mL ST ekleyip nazikçe tekrar askıya alYumuşak bir fırça. 24 mL ST (son hacim 25 mL) ilave edin ve karışımı / girdaplı ( yani, tüm sıvıyı çıkarmak için tüpün yan tarafındaki boya fırçasına basın).
    13. ST'yi kullanarak tüpleri 0.1 g içinde dengeleyin. 18.000 xg'de ve 4ºC'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Bu arada DNaseI solüsyonunu hazırlayın (stok ve çalışma solüsyonu tarifleri için Tablo 1'e bakın). Her numune için 1.5 mL'lik bir tüpte 200 μL'lik bir alikuot yapın.
    14. Süpernatantı atın, tüpü bloke edin ve yumuşak bir fırça kullanarak ST'nin 300 μL'sindeki peletini (hala yüksek hızda bir santrifüj tüpünde) yeniden askıya alın. Boya fırçasını, DNASI çözeltisinin 200 μL'ini içeren önceden hazırlanmış 1.5 mL tüp içine yerleştirin ve fırçaya yapışmış pelletlerin tümünü çıkarmak için fırça döner. DNaseI çözeltisini yüksek hızlı santrifüj tüpüne pipetleyin ve karıştırmak için hafifçe döndürünüz.
    15. 37 ° C'de 30 dakika su banyosunda inkübe edin (yoğuşmayı önlemek için tüpün üst kısmına sarın parafilmG kapağa koyun). İnkübasyon sırasında 2 kez dönüp hafifçe karıştırın.
    16. Pellet karışımını, geniş bir delikli bir pipet ucu kullanarak tüpün içinden yavaşça pipetleyin ve 1.5 mL düşük bağlama tüpüne yerleştirin. Yüksek hızda santrifüj tüpüne 500 mcL 400 mM EDTA, pH 8.0 ekleyin ve tüpün içindeki artık pelet miktarını elde etmek için yavaşça pipetleyin. EDTA'yı topak karışımı olarak aynı 1.5 mL'lik düşük bağlama tüpüne aktarın ve ters çevirme ile hafifçe karıştırın.
    17. 4 ºC'de 20 dakika boyunca 18,000 xg'de santrifüjleyin. Süpernatantı atın, tüpü silin ve DNA izolasyonu için bir kerede kullanın. Gerekirse, topakları -20 ºC'de dondurun, ancak artık DNaseI, hemen işleme tabi tutulmazsa, numune DNA'sını bozabildiğinden verim düşüşüyle ​​sonuçlanabilir.
  3. Ticari sütun bazlı bir yaklaşım kullanarak izole organellerden DNA ekstraksiyonu
    NOT: Tam protokol 25 için kit el kitabına bakın ve değişiklikler için aşağıya bakın. PrDoğrudan organel izolasyonundan DNA ekstraksiyonuna geçilmesi tercih edilir. Tekrarlanan dondurma ve çözme, DNA fragman boyutlarını azaltacak ve kalıntı DNaseI ile DNA bozunumuna neden olacaktır. Vortekslemeyi veya kuvvetli pipetlemeyi sınırlayın, çünkü DNA'yı kesebilir. DNA geri kazanımını en üst düzeye çıkarmak için düşük bağlamalı mikrosantrifüj tüplerinin kullanılması önerilir.
    1. DNA özütleme prosedürü
      NOT: Tamponların düzgün bir şekilde yapıldığından / depolandığından ve döner sütun prosedürlerinin anlaşıldığından emin olmak için, ayrıntılı ticari protokol 25'i okuyun.
      1. Pelet ile doğrudan tüpe 180 μL Tampon ATL ekleyin (daha önce donmuş ve tezgah üstünde oda sıcaklığına kadar dengelenmişse çözülmüştür).
      2. Kit el kitabındaki "DNA Saflaştırmaları İçin Dokulardan DNA Arındırma" protokolünde 3. adıma geçin, aşağıdaki değişikliklerle birlikte: 3. adımda 30 dakikalık bir lizis, isteğe bağlı RNaz A sindirimini ve elüsyon için 3 x 200 μL AE ( Her biri bir şeyeParate tüp ve daha sonra elüsyonları birleştirin).
      3. QPCR için bir alikuot (en az 20 μL) kaydedin (adım 4.1'e bakın). Konsantre olmadan önce miktarı ölçmek için, yüksek hassasiyetli miktar tespiti için ek olarak 1 μL'lik bir tasarruf yapın.
      4. İsterseniz, örnek konsantrasyonu ile devam edin.
  4. Ticari filtre üniteleri ile numune konsantrasyonu
    NOT: Daha fazla bilgi için ticari protokol 26'ya bakınız. Aşağı akım kullanımına bağlı olarak, örnek konsantrasyonu gerçekleştirmek gerekli olmayabilir ( örn., Son nokta PCR ve qPCR uygulamaları için). Bununla birlikte, NGS kütüphanesi inşası için, DNA ekstraksiyonu sonrasında elde edilen seyreltilmiş organellar DNA'nın konsantre edilmesi büyük olasılıkla olacaktır.
    1. Konsantrasyon sütun prosedürü
      1. Dijital bir analitik terazi üzerinde temiz bir tartı kağıdı üzerine boş filtre ünitesini (bir tüp içermez) dikkatlice önceden tartın (bkz. Tablo 2 ). Ağırlığı kaydedin.
      2. pi sayısıBirleştirilen elüsyonları filtre ünitesine koyun ve dikkatle tekrar tartın.
        NOT: Ticari el kitabı 26 , filtre ünitesinin maksimum hacminin 500 mcL olduğunu söyler, ancak birime aynı anda taşması olmadan üniteye 575 mcL'ye kadar eklenebilir.
      3. Dolu filtre ünitesini bir tüpe (kolonlarla birlikte sağlanmış) dikkatlice yerleştirin. İstenilen konsantre hacmi elde etmek için istenilen süre için 500 xg'de santrifüjleyin. ~ 575 μL'lik bir numune hacmi için, 20 dakikalık bir sıkma genellikle 15-30 μL'lik bir konsantrasyon hacmiyle sonuçlanır.
      4. Filtre ünitesini tüpten çıkarın ve tekrar tartın. İstenen konsantre hacme ulaşılmış olup olmadığını belirlemek için tabloyu kullanın. Değilse tekrar 500 xg'de daha kısa bir süre için santrifüjleyin ve tekrar tartın; Istenilen konsantre hacme ulaşılana kadar tekrarlayın.
      5. Filtre ünitesinin üst kısmına yeni bir tüp (kolonlarla birlikte verilir) yerleştirin ve tersine çevirin. Co taşımak için 1000 xg'da 3 dakika boyunca santrifüjleyinTüpün içine konsantre ol.
      6. Kurtarılan hacmi belirleyin. Filtre tutma sebebiyle bu genellikle hesaplanan hacimden 3-5 μL daha düşük olacaktır. Aşırı konsantrasyon halinde, istenen hacmi elde etmek için steril su veya TE ile seyreltin.
      7. DNA'yı yüksek hassaslıkta niceleme kullanarak ölçün (üretici talimatlarına göre).

3. Yöntem # 2: Toplam Genomik DNA'dan Organelar DNA'yı zenginleştirmek için Metil-fraksiyonlama (MF) Yaklaşımı

NOT: Bu protokol, bitkiler ve mantarlar 27 ve ticari Microbiome DNA Zenginleştirme Kiti protokolü 28 için kullanıcı tarafından geliştirilmiş Genomik İpucu Kiti DNA ekstraksiyon protokolünden değiştirildi. Teorik olarak, yüksek molekül ağırlıklı DNA üreten herhangi bir DNA izolasyon protokolü, pulldown için kullanılabilir. Kısa okunan sıralama için, aşağı yukarı> 15 kb'lik fragmanlar veren herhangi bir ekstraksiyon, açılan yerde kullanım için yeterlidir. Merak ettimNg-okuma dizilemesi, daha büyük fragmanlar istenebilir. Bu nedenle, bu protokolü yüksek molekül ağırlıklı DNA üretmek için optimize ettik.

  1. Toplam DNA izolasyonu
    NOT: Gerekli ekipman ve reaktiflerin listesine bakınız ve Yöntem # 2 için gerekli tamponları ve çalışma stoklarını hazırlayınız ( Tablo 1 ). Liziz tamponu çalışma solüsyonu yapmak için liziz tampon maddesine parçalayıcı enzimler ekleyin. Termomikeri açın ve 37 ° C'ye ayarlayın. Su banyosunu 50 ° C'ye getirin ve QF tamponunu banyoya yerleştirin. Dondurucuda% 70 EtOH yerleştirin ve mikrosantrifüjü 4 ° C'ye ayarlayın.
    1. Ticari DNA ekstraksiyon sütunları kullanılarak toplam DNA ekstraksiyonu
      NOT: Başlamadan önce, yerçekimi akış anyon değişim kolonları kullanımına ilişkin ayrıntılı bilgi için ticari el kitabı 29 okundu. Sütunlar, özel bir rafta kurulabilir veya sağlanan plastik halkaları kullanarak tüplerin üzerine yerleştirilebilir. G dahil olmak üzere tüm adımlarEnomik uçlar, yerçekimi akışı ile ilerlemesine izin verilmeli ve artık sıvı geçilmemelidir.
      1. 2 mL'lik tüpler için tasarlanmış elle tutulan öğütme kalemi kullanarak 2 mL'lik düşük bağlama tüpünde sıvı nitrojende 20 mg donmuş doku öğüt.
      2. 2 mL liziz tamponu çalışma solüsyonu ekleyin (tüpler çok dolacaktır).
      3. 300 rpm'de hafif çalkalamayla 1 saat boyunca 37 ° C'de bir termomiksöre kuluçkalayın. Bir termomiksör yoksa, bir ısı bloğunda inkübe edin ve 15 dakikada bir hafifçe titreşerek karıştırın, uygun bir alternatiftir.
      4. 4 uL RNaz A (100 mg / mL, 200 μg / mL nihai konsantrasyon) ilave edin. Melez bir çalkantı ile 300 rpm'de karıştırılarak 37 ° C'de 30 dakika boyunca bir termomikserde inkübe edin.
      5. 80 μL proteinaz K (20 mg / mL, 0.8 mg / ml son konsantrasyon) ilave edin, karıştırmak için tersine çevirin ve 300 rpm'de yavaşça çalkalayarak 50 ° C'de 2 saat boyunca bir termomikserde inkübe edin.
      6. 4 ° C'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin ve 1Çözülemez enkazın pelet haline getirilmesi için 5,000 xg.
      7. Numuneler santrifüj ederken, kolonları 1 mL Tampon QBT ile dengeleyin ve kolonun yerçekimi akışı ile boşaltılmasına izin verin.
      8. Denkleştirilen kolona numuneyi derhal uygulamak (peleti önlemek) ve kolondan tamamen akmasına izin vermek için geniş çaplı bir pipet ucu kullanın. Numune bulutlu hale gelirse, sütuna uygulamadan önce tekrar filtreleyin veya santrifüjleyin (ayrıntılar için ticari el kitabına bakın 29 ).
      9. Numune reçineye tamamen girdikten sonra, kolonu 4 x 1 mL Tampon QC ile yıkayın.
      10. Kolonu, temiz, 2 mL, düşük bağlamalı mikrosantrifüj tüpü üzerine asın. Genomik DNA'yı, 50 ° C'de önceden ısıtılmış 0.8 mL Tampon QF ile elute edin.
      11. Elde edilen DNA'ya 0.56 mL (0.7 hacim elüsyon tamponu) oda sıcaklığında izopropanol ekleyerek DNA'yı çöktürün.
      12. Inversiyon (10X) ile karıştırın ve 15,000 xg ve 4 ° C'de 20 dakika için hemen santrifüjleyin. BakımSerbest, gevşek bağlanmış pelet bozmadan süpernatantı tamamen çıkarın.
      13. Santrifüjlenen DNA pelletini 1 mL'lik soğuk% 70 etanol ile yıkayın. 15,000 xg ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
      14. Peleti bozmadan süpernatantı dikkatlice çıkarın (bu adımla da dikkatli olun). Hava ile 5-10 dakika kurutun ve DNA'yı 0.1 mL elüsyon tamponu (EB) içine tekrar süspansiyon haline getirin. DNA gece boyunca oda sıcaklığında eritilir. DNA'yı kesebilecek pipetleme işleminden kaçının.
      15. Yüksek duyarlıklı bir DNA kantifikasyon testi kullanarak numuneleri ölçün (üreticinin talimatlarına göre).
  2. Metillenmiş ve metilleştirilmemiş DNA'nın boncuk bazlı fraksiyonasyonu
    NOT: Yakın tarihli bir yayın, insan IgG Fc fragmanına (MBD2-Fc proteini) kaynaştırılmış bir CpG'ye spesifik metil bağlama alanı proteinini fraksiyona doğru kullanan bir açılma yaklaşımından yararlanan ticari olarak temin edilebilir bir kitin 28 kullanımını göstermiştirBitki organelleri genomlarını (metilleştirilmemiş) nükleer genomdan (yüksek metillenmiş) içeriği yedi 23 . Buğday numunelerindeki fraksiyonasyon etkinliği daha önce bu ticari MF kiti 28 kullanılarak test edilmemiştir.
    1. Başlamadan önce yapılacaklar
      1. Taze olarak% 80 etanol (reaksiyon başına en az 800 μL) hazırlayın. Buz üzerinde çözülmesi için 5x bağ / yıkama tamponu ayarlayın ve numune başına 5 mL 1x tampon hazırlayın (protokol esnasında steril, nükleaz içermeyen su ile 5X tamponu seyreltin ve buz üzerinde tutun).
    2. MBD2-Fc proteinine bağlı manyetik boncukları hazırlayın
      1. Gerekli boncuk seti sayısını hazırlayın. Reaksiyonları 160 ve 320 μL boncuk gerektiren 1 ila 2 μg toplam girdi DNA'sı arasında kullanılacak şekilde ölçeklendirin. Aşağıda listelenen reaksiyonların 1 μg toplam girdi DNA'sı için olduğunu ve bu yüzden 160 μL boncuk gerektirdiğini unutmayın. Reaksiyonları ihtiyaçlara göre ölçeklendirin.
      2. Geniş çaplı ipuçları kullanarak, Protein A Manyetik B'yi yavaşça pipetleyinHomojen bir süspansiyon oluşturmak için yukarı ve aşağı çamurdan arındırın. Alternatif olarak, boncuk tüpünü 4 ° C'de 15 dakika yavaşça döndürün.
        NOT: Boncukları vorteks vermeyin.
      3. Üretici talimatlarına göre yönergeleri takip edin 28 .
    3. Metillenmiş nükleer DNA'yı yakalayın
      1. Her bir örnek için, 160 μL MBD2-Fc-bağlı manyetik boncuk içeren bir tüpe 1 μg giriş DNA'sı ekleyin.
      2. 1x nihai bir konsantrasyon için DNA girdi örneğinin hacmi göz önüne alındığında uygun olarak 5x bağ / yıkama tamponu ekleyin (eklemek için 5x bağ / yıkama tamponu hacmi (μL) = giriş DNA'sının hacmi (μL) / 4). Geniş çaplı pipet ucu kullanarak karıştırmak için numuneyi birkaç kez pipetleyin.
      3. Tüpleri 15 dakika boyunca oda sıcaklığında döndürün. Örnekleri geniş çaplı bir pipet ucu ile hafifçe pipetleyin ve örneklerin boncuk yığılmasını önlemek için kuluçka boyunca 2-3 kez fiske vurun.
        NOT: pipetleme ve flickiMetilize DNA'nın etkili bir şekilde indirilmesini sağlamak için kritik önem taşır.
    4. Zenginleştirilmiş, metil olmayan organel DNA'yı toplayın
      1. DNA ve MBD2-Fc'ye bağlı manyetik boncuk karışımını içeren tüpü kısaca döndürün. Boncukları tüpün yanına toplamak için tüpü manyetik bir rafa en az 5 dakika boyunca yerleştirin. Çözüm açıkça görülmelidir.
      2. Geniş çaplı ipuçları kullanarak, boncukları rahatsız etmeden temizlenmiş yüzer malzemeyi dikkatlice çıkarın. Süpernatantı (metilleştirilmemiş, organelleri zenginleştirilmiş DNA'yı içerir), temiz, düşük bağlayıcı, 2 mL'lik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bu örneği -20 veya -80 ° C'de saklayın veya saflaştırma için doğrudan adım 3.2.6'ya geçin.
    5. Elde edilen nükleer DNA, MBD2-Fc'ye bağlı manyetik boncuklardan alındı
      1. Nükleer fraksiyon da istenirse, MBD2-Fc bağlı manyetik boncuk nükleer DNA Zehir için üretici talimatları 28 izleyin; Adım 3.2.7'de açıklandığı gibi arındırın.
    6. Boncuk esaslı nükleik asit arıtımı
      1. Temizleme boncuklarının oda sıcaklığında olduğundan ve iyice karıştırıldıklarından emin olun. Protokolü, MF kiti el kitabı 28'deki talimatlara göre uygulayın.
        NOT: Örnek şimdi NGS kütüphane inşası için veya başka bir aşağı doğru analiz için kullanılabilir.

4. Örnekleme ve Kalite Kontrolü

  1. Organik zenginleşmeyi değerlendirmek için qPCR tahlili
    NOT: Burada listelenen qPCR reaksiyonu ve analiz parametreleri, bir Roche LightCycler 480'de kullanılmak üzere tasarlanmıştır ve farklı ekipman ve reaktifler için ayarlanması gerekebilir. QPCR kullanılamazsa, burada tarif edilen aynı primerler ve koşulları kullanarak, numune saflığının kalitatif bir ölçümü olarak, bir agaroz jel üzerinde son nokta PCR ve görselleştirme kullanılabilir. Amplicon boyutları tüm primer setleri için ~ 150 bp olacaktır. Primer sekans için Tablo 3'e bakınız.Ces ve eşleştirmeler.
    1. QPCR reaksiyonu ayarı
      1. Tek tek bir 20 uL qPCR reaksiyonu oluşturmak için, dikkatlice bir 96-kuyucuklu qPCR plakasının tek bir kuyusuna pipetleyin: 2 x SYBR Green I Master'ın 10 uL; 2 uL 10 uM ileri ve geri primer karışımı (0.5 uM'lik bir son konsantrasyon için); 2 uL şablon (standart eğri aralığı dahilinde); ve steril, nükleaz içermeyen H2 O. 6 uL pipetleme hatalarını azaltmak için, şablon dışındaki tüm tepkime bileşenleri ile bir ana karışımı yapmak için tercih edilir. Ana karışığı qPCR plakasına ekleyin ve daha sonra ilgi şablonunu her kuyuya ekleyin. Her örnek için üç teknik kopya pipetleme hatasının etkilerini en aza indirgemek için yapılmalıdır.
        NOT: Nihai olarak, nükleer organellerin kantifikasyon çevrimlerine oranı örnekler arasında karşılaştırılarak konsantrasyonda ufak farklar kabul edilebilir. Bununla birlikte, DNA konsantrasyonları yaklaşık olarak ea aralığında olmalıdırDiğerini.
      2. Plakayı yüksek kaliteli bir qPCR sızdırmazlık filmi ile mühürleyin. Örnekleri hafifçe vorteksleyin, kabarcıkların oluşmasını önlemek için özen gösterin. Numuneyi toplamak ve herhangi bir küçük kabarcığı ortadan kaldırmak için plakayı 4 ° C'de 2 dakika kısaca döndürün.
      3. Plakayı makineye yükleyin. QPCR programını aşağıda listelenen kurallara uygun olarak çalıştırın.
    2. QPCR reaksiyon parametreleri
      NOT: Bunlar amplifikasyon aşamasının tavlama çevrimi haricinde varsayılan parametrelerdir. Kullanılanlar bu protokolde sunulan primerlerden farklıysa, bu ayarı belirli primerlere uyacak şekilde ayarlayın.
      1. 4.4 ° C / s'lik bir rampa hızı ile 95 ° C'de 5 dakika ön inkübe edin.
      2. 4.4 ° C / s'lik bir rampa hızı ile (1) 95 ° C'de 10 saniye boyunca 45 amplifikasyon döngüsü gerçekleştirin; (2) 20 ° C için 60 ° C, 2.2 ° C / s'lik bir rampa hızı; Ve (3) 72 ° C'de 10 saniye boyunca, 4.4 ° C / s'lik bir rampa hızı ile (veri (3) sırasında elde edilen veriler).
      3. Optio kullanın4.4 ° C / s'lik bir rampa hızı ile 5 s boyunca 95 ° C'de nal erime eğrisi çevrimi; 65 ° C'de 1 dakika boyunca, 2.2 ° C / s'lik bir rampa hızı ile; Ve 97 ° C, sürekli bir alım modu.
      4. 30 ° C'de 40 ° C'lik bir soğutma çevrimi kullanın ve 1.5 ° C / s'lik bir rampa hızı kullanın.
    3. Deney parametreleri
      1. SYBR şablonunu seçin. Deneme düğmesindeki program parametrelerini kontrol edin. Bir kez plaka yüklendiğinde, deneme başlatılabilir ve ayarlar test çalışırken ayarlanabilir.
      2. Numune editörünü kullanarak numuneler atayın. İş akışı olarak Abs Quant'i seçin ve örnekleri bilinmeyen, standartlar veya negatif kontroller olarak belirleyin. Belirlemek çoğaltır ve her replikasyonun ilki örnek adlarını girin. Standartlara konsantrasyon ve birimler ekleyin.
      3. Analiz için alt grupları kurun; Bunlar alt set editöründe atanır.
      4. Analiz için, "yeni analiz oluştur" listesinden Abs Quant / 2nd Derivative Max'i seçin.Harici olarak kaydedilen standart eğrisi (varsa) içe aktarın ve daha sonra hesaplamayı yapın; Rapor seçilen bilgileri içerecektir.
      5. Kopya sayısının veya konsantrasyonunun belirlenmesi için kesin kesin nicelikleme yapmak için, test edilen örneği temsil eden standart bir eğri kullanın ( örn ., Yukarıdaki yöntemlerden izole edilen organellar DNA). Standart bir eğri hazırlamak için gereken mitokondriyal DNA miktarı, makul bir miktarda doku ile elde edilemeyeceğinden, yazılım tarafından sağlanan kopya sayısı hesaplamalarını kullanmayın; bunun yerine göreli zenginleşmeyi belirlemek için geçiş noktası (Cp) değerlerini inceleyin Örneklerde nükleer DNA ile karşılaştırıldığında organellar. Bu göreli miktarları toplam genomik DNA'yla karşılaştırın (bkz. Temsilci Sonuçlar ). Tam ışık yetiştirilmiş, iki haftalık buğday fidelerinden toplam genomik DNA'nın beş 1: 10 dilüsyonunda primer verimliliklerini test edin (bu rapordaki temsili verimliliklerŞekil 2'deki efsane).
  2. Pulsed-field jel elektroforezi (PFGE)
    NOT: Bu protokol, yüksek molekül ağırlıklı DNA'yı çözmek için PFGE'yi gerçekleştirmek için üretici talimatlarına dayanmaktadır. Malzeme Tablosuna bakın .
    1. Jel ve örneklerin hazırlanması
      1. Jel ve numune hazırlama ile ilgili yönergeleri izleyin ve mevcut sisteme uyarlayın.
    2. Parametreleri çalıştır
      1. Elektroforez sistemini kurmak için yönergeleri izleyin ve aşağıdaki parametreleri kullanın: başlangıç ​​geçiş süresi 2 s, son geçiş süresi 13 sn, çalışma süresi 15 saat ve 16 dakika, V / cm 6 ve dahil açılı 120 ° .
    3. Jel lekesi ve görüntüsü
      1. Jel, seçilen bir boya ile örtün ( örn. Etidyum bromür veya uygun bir alternatif) ve uygun bir jel dokümantasyon sistemi ile görüntü yapın.
  3. NGS ve analiz
    1. DNA Kitaplığı Hazırlık Kiti için üreticinin talimatlarına göre 1 ng DNA kullanın.
    2. Tek bir koşu ile sıralama için barkod ve havuz örnekleri. Üreticinin yönergelerine göre sıralamayı gerçekleştirin.
      NOT: Havuzlama ve sıralama parametreleri, ilgi türüne, istenen kapsama seviyesine ve kütüphaneleri sıralamak için kullanılan platforma bağlı olarak değiştirilebilir. Örneğin, bir HiSeq şeridi MiSeq şeridine kıyasla çok daha fazla çıktı, bu nedenle çok daha fazla numune multiplekslenebiliyor. Organelar genomlarının kapsama seviyelerinin aşağı akım analizi için yeterli olup olmadığını belirlemek için daha küçük bir örnek alt kümesini sıralayın.
    3. Veriler için gerekli kırpma ve filtreleme boyutunu belirlemek için FastQC 31'i kullanarak okuma kalitesini inceleyin.
    4. Ham okumaları, Trimmomatic 32 veya başka bir benzer program kullanarak süzün ve filtreleyin. Aşağıdaki ayarları kullanın: ILLUMINACLIP 2:30:10 (adaptörleri çıkarmak için), LİDER 3, DORSE 3, SLIDINGWINDOW 4:10 ve MINLEN 100.
    5. Kaliteli filtrelenmiş ve adaptör ile kesilmiş eşleştirilmiş uçlu (PE) okumaları, Çin Bahar mitokondriyeline (NCBI Referans Dizisi NC_007579.1 33 ), kloroplasta (NCBI Referans Sırası NC_002762.1 34 ) ve nükleer 35 referans genomlarına Bowtie2 36 , Aşağıdaki ayarlarla: -I 0 -X 800 - hassas.
    6. Sam uyum dosyalarını bam formatına (samtools) dönüştürür ve bam dosyalarını sıralar. Bam dosyalarını, geneli kapsayan kapsama alanını ve bedtools ile taban başına kapsamı hesaplamak için kullanın. Sonuçları R-plot fonksiyonuyla görselleştir.

Sonuçlar

Bu yazıda sunulan protokoller, organellar DNA'sını bitki dokusundan zenginleştirmek için iki farklı yöntem tarif eder. Burada sunulan koşullar, buğday dokusu için optimizasyonu yansıtır. Protokollerde, gerekli doku girişi ve DNA çıktısı için önemli adımların bir karşılaştırması Şekil 1'de açıklanmaktadır. Test ettiğimiz DC protokolünün basamakları, daha önce tarif edilenlere benzer koşulları izlemektedir (

Tartışmalar

Bugüne kadar, çoğu organellar sıralama çalışmaları, geleneksel DC yöntemleri üzerine odaklanarak spesifik DNA'yı zenginleştirir. Çeşitli bitkilerden organelleri izole etme yöntemleri tanımlanmıştır; yosun 40 ; Buğday 15 ve yulaf 11 gibi monokotlar; Ve arabidopsis 11 , ayçiçeği 17 ve kolza tohumu 14 gibi dikotlar. Çoğu protokol 13

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

Bu yayındaki ticari isimler veya ticari ürünlerin açıklamaları, yalnızca spesifik bilgi sağlamak amacıyla verilmiştir ve ABD Tarım Bakanlığı'nın tavsiyesi veya onayını içermez. USDA eşit fırsat sağlayıcısı ve işverendir.

Teşekkürler

Birleşik Devletler Tarım-Tarımsal Araştırma Servisi ve Ulusal Bilim Vakfı'ndan (IOS 1025881 ve IOS 1361554) fon sağlandığını kabul etmek istiyoruz. R. Caspers'a sera bakımı ve bitki bakımı için teşekkür ederiz. Ayrıca, Illumina kütüphanesi hazırlıklarının ve sıralama işlemlerinin yapıldığı Minnesota Üniversitesi Genomik Merkezi'ne teşekkür ediyoruz. Dergi editörlerinin yorumları ve el yazmalarımızı daha da güçlendiren dört anonim gözden geçiren için de minnettarız. OECD'ye, Japonya'daki meslektaşları ile ortak projeler için bu protokolleri entegre etmek için SK'ye bir burs için teşekkür ediyoruz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol; BME)Sigma AldrichM3148-100ml
2-propanol (Isopropyl alcohol/isopropanol), bioreagentSigma AldrichI9516
agarose, Bio-Rad Cetified Megabase agaroseBio-Rad1613108
analytical balanceMettler ToledoAB54-S
balanceMettler ToledoPB1502-S
bovine serum albumin (BSA)Sigma AldrichB4287-25G
Ceramic grinding cylinders, 3/8in x 7/8inSPEX SamplePrep2183
Cryogenic Blocks compatible with tissue homogenizer for holding 50 ml tubesSPEX SamplePrep2664
DNaseISigmaDN25
ethanol, absoluteDecon Laboratories2716
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), 0.5M Solution, pH8.0FisherBP2482-500
gel imaging system
gel stainSuch as GelRed or Ethidium Bromide
grinding pestle, wide tip for 2 ml conical tubes
Guanidine-HCl, 8M solutionThermoFisher24115
LightCycler 480 SYBR Green I MasterRoche4707516001
liquid nitrogen
Lysing enzymes from Trichoderma harzianumSigmaL1412
Magnesium ChlorideG Bioscience24115
magnetic rackThermoFisherA13346
microcentrifuge tubes, LoBind 1.5 ml Eppendorf22431021
microcentrifuge tubes, standard nuclease-free 1.5 mlEppendorf
microcentrifuge, refrigeratedSorvall Legend X1ROr equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotors for 50 ml tubes, Oak Ridge tubes, and 1.5 ml tubes
microcentrifuge, room temperatureEppendorf5424Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotor for 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes
Microcon DNA Fast Flow Centrifugal Filter UnitsEMD MilliporeMRCFOR100
Miracloth, 1 square per sample cut to fit funnelEMD Millipore475855
NEBNext Microbiome DNA Enrichment KitNew England BiolabsE2612L
parafilmParafilm MPM992
plastic pots and trays
polyvinylpyrrolidone (PVP)FisherBP431-100
Proteinase KQiagen19131
Pulsed-Field Gel Electrophoresis rig (e.g. CHEF DR III)Bio-Rad1703697
purification beads, Agencourt AMpureXP beadsBeckman CoulterA63881
QIAamp DNA Mini KitQiagen51304
Qiagen 20/g Genomic Tip DNA Extraction KitQiagen10223
Qiagen Buffer EB (elution buffer)Qiagen19086
Qiagen DNA Extraction Buffer SetQiagen19060
QiaRackQiagen19015
qPCR machine (e.g. Roche Light Cycler 480)Roche
qPCR plate sealing filmRoche4729757001
qPCR plate, 96 well plateRoche4729692001
Qubit assay tubesLife TechnologiesQ32856
Qubit Broad Spectrum assay kitLife TechnologiesQ32850
Qubit High Sensitivity assay kitLife TechnologiesQ32851
RNaseAQiagen19101
Serological pipettes (20 ml) and pipet-aidFisher13-678-11
Small funnels, 1 per sample
Sodium ChlorideAmbionAM9759
Soft paintbrush, 2 per sample
SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder or another type of tissue homogenizerSPEX SamplePrepOr another comparable tissue homogenizer. If you do not have access to a tissue homogenizer, then grinding in a pre-chilled mortar and pestle will suffice (see protocol for details). However, a homogenizer will give more consistent results and total homogenization time is reduced.
SucroseOmnipure8550
TBE
thermomixer
TrisSigmaT2819-100ml
Triton X-100PromegaH5142
tube rotater
tubes, 50 mL conical polypropyleneCorning352070
tubes, 50 ml high-speed polypropylene ThermoScientific/Nalgene3119-0050e.g. Nalgene Oakridge tubes or equivalent
vermiculite
water bath
water, sterile and certified Nuclease-free Fisher1481
water, sterile milliQ

Referanslar

  1. Liberatore, K. L., Dukowic-Schulze, S., Miller, M. E., Chen, C., Kianian, S. F. The role of mitochondria in plant development and stress tolerance. Free Radic Biol Med. 100, 238-256 (2016).
  2. Samaniego Castruita, J. A., Zepeda Mendoza, M. L., Barnett, R., Wales, N., Gilbert, M. T. Odintifier--A computational method for identifying insertions of organellar origin from modern and ancient high-throughput sequencing data based on haplotype phasing. BMC Bioinformatics. 16 (232), 1-13 (2015).
  3. Zhang, T., Zhang, X., Hu, S., Yu, J. An efficient procedure for plant organellar genome assembly, based on whole genome data from the 454 GS FLX sequencing platform. Plant Methods. 7 (38), 1-8 (2011).
  4. Wambugu, P. W., Brozynska, M., Furtado, A., Waters, D. L., Henry, R. J. Relationships of wild and domesticated rices (Oryza AA genome species) based upon whole chloroplast genome sequences. Sci Rep. 5 (13957), 1-9 (2015).
  5. Iorizzo, M., et al. De novo assembly of the carrot mitochondrial genome using next generation sequencing of whole genomic DNA provides first evidence of DNA transfer into an angiosperm plastid genome. BMC Plant Biol. 12 (61), 1-17 (2012).
  6. Park, S., et al. Complete sequences of organelle genomes from the medicinal plant Rhazya stricta (Apocynaceae) and contrasting patterns of mitochondrial genome evolution across asterids. BMC Genomics. 15 (405), 1-18 (2014).
  7. Skippington, E., Barkman, T. J., Rice, D. W., Palmer, J. D. Miniaturized mitogenome of the parasitic plant Viscum scurruloideum is extremely divergent and dynamic and has lost all nad genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (27), E3515-E3524 (2015).
  8. Wicke, S., Schneeweiss, G. M., Hörandl, E., Appelhans, M. Chapter 1. Next Generation Sequencing in Plant Systematics. , (2015).
  9. Sloan, D. B. One ring to rule them all? Genome sequencing provides new insights into the 'master circle' model of plant mitochondrial DNA structure. New Phytol. 200 (4), 978-985 (2013).
  10. Woloszynska, M. Heteroplasmy and stoichiometric complexity of plant mitochondrial genomes--though this be madness, yet there's method in't. J Exp Bot. 61 (3), 657-671 (2010).
  11. Ahmed, Z., Fu, Y. B. An improved method with a wider applicability to isolate plant mitochondria for mtDNA extraction. Plant Methods. 11 (56), 1-11 (2015).
  12. Ejaz, M., et al. Comparison of small scale methods for the rapid and efficient extraction of mitochondrial DNA from wheat crop suitable for down-stream processes. Genet Mol Res. 13 (4), 10320-10331 (2014).
  13. Eubel, H., Heazlewood, J. L., Millar, A. H. Isolation and subfractionation of plant mitochondria for proteomic analysis. Methods Mol Biol. 355, 49-62 (2007).
  14. Hao, W., Fan, S., Hua, W., Wang, H. Effective extraction and assembly methods for simultaneously obtaining plastid and mitochondrial genomes. PLoS One. 9 (9), e108291 (2014).
  15. Pomeroy, M. K. Studies on the respiratory properties of mitochondria isolated from developing winter wheat seedlings. Plant Physiol. 53 (4), 653-657 (1974).
  16. Taylor, N. L., Stroher, E., Millar, A. H. Arabidopsis organelle isolation and characterization. Methods Mol Biol. 1062, 551-572 (2014).
  17. Triboush, S. O., Danilenko, N. G., Davydenko, O. G. A method for isolation of chloroplast DNA and mitochondrial DNA from Sunflower. Plant Mol Biol Rep. 16 (2), 183-189 (1998).
  18. Pinard, R., et al. Assessment of whole genome amplification-induced bias through high-throughput, massively parallel whole genome sequencing. BMC Genomics. 7 (216), 1-21 (2006).
  19. Lamble, S., et al. Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based Nextera system. BMC Biotechnol. 13 (104), 1-10 (2013).
  20. Raley, C., et al. Preparation of next-generation DNA sequencing libraries from ultra-low amounts of input DNA: Application to single-molecule, real-time (SMRT) sequencing on the Pacific Biosciences RS II. bioRxiv. , (2014).
  21. Tsai, Y. C., et al. Resolving the Complexity of Human Skin Metagenomes Using Single-Molecule Sequencing. MBio. 7 (1), e01948 (2016).
  22. Feehery, G. R., et al. A method for selectively enriching microbial DNA from contaminating vertebrate host DNA. PLoS One. 8 (10), e76096 (2013).
  23. Yigit, E., Hernandez, D. I., Trujillo, J. T., Dimalanta, E., Bailey, C. D. Genome and metagenome sequencing: Using the human methyl-binding domain to partition genomic DNA derived from plant tissues. Appl Plant Sci. 2 (11), 1-6 (2014).
  24. Noyszewski, A. K., et al. Accelerated evolution of the mitochondrial genome in an alloplasmic line of durum wheat. BMC Genomics. 15 (67), 1-16 (2014).
  25. . QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2016)
  26. . User developed protocol: Isolation of genomic DNA from plants and filamentous fungi using the QIAGEN Genomic-tip - (EN) Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2001)
  27. . QIAGEN Genomic DNA Handbook Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2012)
  28. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  29. Ogihara, Y., et al. Structural dynamics of cereal mitochondrial genomes as revealed by complete nucleotide sequencing of the wheat mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 33 (19), 6235-6250 (2005).
  30. Ogihara, Y., et al. Structural features of a wheat plastome as revealed by complete sequencing of chloroplast DNA. Mol Genet Genomics. 266 (5), 740-746 (2002).
  31. International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC). A chromosome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat (Triticum aestivum) genome. Science. 345 (6194), (2014).
  32. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  33. Bendich, A. J. Why do chloroplasts and mitochondria contain so many copies of their genome?. Bioessays. 6 (6), 279-282 (1987).
  34. Kumar, R. A., Oldenburg, D. J., Bendich, A. J. Changes in DNA damage, molecular integrity, and copy number for plastid DNA and mitochondrial DNA during maize development. J Exp Bot. 65 (22), 6425-6439 (2014).
  35. Ma, J., Li, X. Q. Organellar genome copy number variation and integrity during moderate maturation of roots and leaves of maize seedlings. Curr Genet. 61 (4), 591-600 (2015).
  36. Lang, E. G., et al. Simultaneous isolation of pure and intact chloroplasts and mitochondria from moss as the basis for sub-cellular proteomics. Plant Cell Rep. 30 (2), 205-215 (2011).
  37. Tobin, A. K. Subcellular fractionation of plant tissues. Isolation of chloroplasts and mitochondria from leaves. Methods Mol Biol. 59, 57-68 (1996).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

GenetikSay 125Kloroplastgenomikmitokondriyeni nesil s ralamaorganelle DNA izolasyonubitkilerbu day

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır