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Résumé

La comparaison et l'optimisation de deux méthodes d'enrichissement d'ADN organellaire végétal sont présentées: centrifugation différentielle traditionnelle et fractionnement de l'ADNc total basé sur l'état de méthylation. Nous évaluons la quantité et la qualité d'ADN qui en résultent, démontrons la performance dans le séquençage de prochaine génération de lecture courte et discutons le potentiel d'utilisation dans le séquençage à une seule molécule à longue lecture.

Résumé

Les génomes organellaires végétaux contiennent de gros éléments répétitifs qui peuvent faire l'objet d'un couplage ou d'une recombinaison pour former des structures complexes et / ou des fragments sub-génomiques. Les génomes organellés existent également dans des mélanges à l'intérieur d'une cellule ou d'un type de tissu (hétéroplasmique) donné, et une abondance de sous-types peut changer tout au long du développement ou sous stress (déplacement sous-stoechiométrique). Les technologies de séquençage de la prochaine génération (NGS) sont nécessaires pour obtenir une compréhension plus approfondie de la structure et de la fonction du génome organellaire. Les études de séquençage traditionnelles utilisent plusieurs méthodes pour obtenir l'ADN organellaire: (1) Si une grande quantité de tissu de départ est utilisée, elle est homogénéisée et soumise à une centrifugation différentielle et / ou à une purification par gradient. (2) Si une quantité plus petite de tissu est utilisée ( c'est-à-dire, si les graines, le matériau ou l'espace est limité), le même processus est effectué comme dans (1), suivi d'une amplification complète du génome pour obtenir un ADN suffisant. (3) L'analyse de bioinformatique peut être utilisée pour seqL'ADN génomique total et d'analyser les lectures organiques. Toutes ces méthodes ont des défis et des compromis inhérents. Dans (1), il peut être difficile d'obtenir une telle quantité importante de tissu de départ; Dans (2), l'amplification du génome entier pourrait introduire un biais de séquençage; Et dans (3), l'homologie entre génomes nucléaires et organellars pourrait entraver l'assemblage et l'analyse. Dans les plantes à grands génomes nucléaires, il est avantageux d'enrichir l'ADN organellaire pour réduire les coûts de séquençage et la complexité des séquences pour les analyses de bioinformatique. Ici, nous comparons une méthode de centrifugation différentielle traditionnelle avec une quatrième méthode, une approche CpG-méthyle modifiée, pour séparer l'ADN génomique total en fractions nucléaires et organellaires. Les deux méthodes produisent suffisamment d'ADN pour le NGS, l'ADN qui est très enrichi pour les séquences organellaires, mais à des rapports différents dans les mitochondries et les chloroplastes. Nous présentons l'optimisation de ces méthodes pour le tissu des feuilles de blé et discutons des avantages majeurs et dDes avantages de chaque approche dans le contexte de l'apport d'échantillon, la facilité du protocole et l'application en aval.

Introduction

Le séquençage du génome est un outil puissant pour disséquer la base génétique sous-jacente des traits importants de la plante. La plupart des études de séquençage génomique se concentrent sur le contenu du génome nucléaire, car la majorité des gènes sont situés dans le noyau. Cependant, les génomes organellars, y compris les mitochondries (à travers les eucaryotes) et les plastides (dans les plantes, la forme spécialisée, le chloroplaste, les travaux de la photosynthèse) apportent des informations génétiques importantes essentielles au développement de l'organisme, à la réponse au stress et à la condition physique globale 1 . Les génomes organellaires sont généralement inclus dans les extractions totales d'ADN destinées au séquençage du génome nucléaire, bien que des méthodes pour réduire les nombres d'organelles avant l'extraction de l'ADN soient également utilisées 2 . De nombreuses études ont utilisé les résultats de séquençage des extractions totales d'ADNg pour assembler les génomes organellaires 3 , 4 , 5 ,Xref "> 6 , 7. Cependant, lorsque la cible de l'étude est de se concentrer sur les génomes organellars, l'utilisation de l'ADNc total augmente les coûts de séquençage car de nombreuses lectures sont" perdues "pour les séquences d'ADN nucléaire, en particulier dans les plantes à grands génomes nucléaires De plus, en raison de la duplication et du transfert de séquences organellaires dans le génome nucléaire et entre les organites, résoudre la position de cartographie correcte des lectures de séquençage au génome approprié est un défi bioinformatique 2 , 8. La purification des génomes organellaires du génome nucléaire est une Stratégie pour réduire ces problèmes. D'autres stratégies de bioinformatique peuvent être utilisées pour séparer la carte à des régions d'homologie entre les mitochondries et les chloroplastes.

Alors que les génomes organellaires provenant de nombreuses espèces de plantes ont été séquencés, on sait peu à peu l'ampleur de la diversité du génome organellaireDisponible dans les populations sauvages ou dans les piscicultures cultivées. Les génomes organellés sont également connus pour être des molécules dynamiques qui subissent un réaménagement structurel important en raison de la recombinaison entre les séquences répétées 9 . En outre, plusieurs copies du génome organellaire sont contenues dans chaque organelle, et des organites multiples sont contenues dans chaque cellule. Toutes les copies de ces génomes ne sont pas identiques, ce qui est connu sous le nom d'hétéroplasme. Contrairement à l'image canonique des «cercles maîtres», il existe maintenant une preuve croissante d'une image plus complexe des structures du génome organellaire, y compris les cercles sub-génomiques, les chromosomes linéaires, les concatémas linéaires et les structures ramifiées 10 . L'assemblage des génomes organellaires végétaux est encore plus compliqué par leurs dimensions relativement importantes et leurs répétitions inversées et directes importantes.

Protocoles traditionnels pour l'isolement organellaire, la purification de l'ADN et la génomique subséquente Le séquençage est souvent encombrant et nécessite de gros volumes d'entrée de tissus, avec plusieurs grammes à plus de centaines de grammes de tissu de feuilles jeunes nécessaires comme point de départ 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Cela rend le séquençage du génome organellaire inaccessible lorsque le tissu est limité. Dans certaines situations, les quantités de semences sont limitées, par exemple lorsqu'elles doivent s'effectuer sur une base générationnelle ou sur des lignes stériles masculines qui doivent être maintenues par passage. Dans ces situations, l'ADN organellaire peut être purifié puis soumis à une amplification complète du génome. Cependant, l'amplification du génome complet peut introduire un biais significatif de séquençage, ce qui est un problème particulier lors de l'évaluation de la variation structurelle, des structures sous-génomiques et des niveaux d'hétéroplasmie> 18. Les progrès récents dans la préparation de la bibliothèque pour les technologies de séquençage à lecture courte ont permis de surmonter les obstacles à faible intrusion pour éviter l'amplification du génome entier. Par exemple, le kit de préparation de la bibliothèque Illumina Nextera XT permet d'utiliser aussi peu que 1 ng d'ADN comme entrée 19 . Cependant, les préparations de bibliothèques standard pour les applications de séquençage à lecture prolongée, telles que les technologies de séquençage PacBio ou Oxford Nanopore, nécessitent encore une quantité relativement élevée d'ADN d'entrée, ce qui peut constituer un défi pour le séquençage du génome organellaire. Récemment, de nouveaux protocoles de séquençage conçus par l'utilisateur et à lecture longue ont été développés pour réduire les quantités d'intrants et aider à faciliter le séquençage du génome dans les échantillons où l'obtention de microgrammes d'ADN est difficile 20 , 21 . Cependant, l'obtention de fractions organellaires pures et de masse moléculaire élevée pour alimenter ces préparations de bibliothèque reste un défi.

Nous avons cherchéO Comparer et optimiser les méthodes organiques d'enrichissement et d'isolement de l'ADN appropriées pour les NGS sans besoin d'amplification du génome entier. Plus précisément, notre objectif était de déterminer les meilleures pratiques pour enrichir l'ADN organellaire de masse moléculaire élevée à partir de matériaux de départ limités, comme un sous-échantillon de feuille. Ce travail présente une analyse comparative des méthodes à enrichir pour l'ADN organellaire: (1) un protocole de centrifugation différentielle traditionnel modifié par rapport à (2) un protocole de fractionnement de l'ADN basé sur l'utilisation d'une méthode de transfert de protéines de domaine CpG-liaison au méthyle d'ADN disponible dans le commerce 22 appliqué au tissu végétal 23 . Nous recommandons les meilleures pratiques pour l'isolement de l'ADN organellaire à partir de feuilles de blé, ce qui peut être facilement étendu à d'autres plantes et types de tissus.

Protocole

1. Génération de matériaux végétaux pour l'isolement organellaire et l'extraction d'ADN

  1. Croissance standard des semis de blé
    1. Plantez des graines dans de la vermiculite dans de petites casseroles carrées avec 4 à 6 graines par coin. Transférer dans une serre ou une chambre de croissance avec un cycle léger de 16 h, 23 ºC jour / 18 ºC de nuit.
    2. Eau les plantes chaque jour. Fertiliser les plantes avec ¼ c. À thé d'engrais granulés 20-20-20 NPK après germination et 7 jours après germination.
  2. Étiologie alternative des semis de blé
    1. Suivez l'étape 1.1, mais placez les pots dans une chambre de croissance sombre, 23 ° C pendant 16 h / 18 ºC pendant 8 h. Alternativement, couvrez les plantes dans la serre ( p. Ex., Avec un récipient de stockage, mais une ventilation appropriée doit être maintenue).
  3. Croissance et collecte des tissus
    1. Cultivez les plantes pendant 12 à 14 jours. Pour la plupart des génotypes de bléS, 75 - 100 plants proposent environ 10 à 12 g de tissu, ce qui est suffisant pour deux extractions organellaires en utilisant la méthode de centrifugation différentielle (section 2); Une seule plante est nécessaire si l'on utilise l'approche par pulvérisation à base de méthylation de CpG d'ADN pour fractionner l'organelaire à partir d'ADN nucléaire (section 3).
    2. Si l'on utilise l'approche de centrifugation différentielle, collecter le tissu frais et procéder immédiatement au traitement des échantillons, comme décrit dans la section 2.
    3. Si l'on utilise l'approche CpG-methyl pulldown, récoltez des sections de 20 mg de tissu de feuilles jeunes dans des tubes de microcentrifugeuse (utilisez des tissus standard ou étiolés, voir les résultats représentatifs ). Gélose instantanée sur l'azote liquide et congélation à -80 ºC jusqu'à l'utilisation. Procédez au fractionnement progressif de l'ADN, comme décrit dans la section 3.

2. Méthode n ° 1: Extraction d'ADN utilisant une centrifugation différentielle (DC)

REMARQUE: le diffUn protocole de centrifugation erroné a été modifié à partir de deux publications qui optimisent les conditions pour isoler les deux organelles mais enrichissent les mitochondries 17 , 24 . Le protocole résultant nécessite moins de temps et utilise moins de produits chimiques toxiques que les méthodes précédentes. Plus précisément, nous avons apporté des modifications aux tampons et aux étapes de lavage, y compris l'addition de polyvinylpyrrolidone (PVP) au tampon d'extraction STE et l'élimination de l'étape finale de lavage dans le tampon NETF, qui contient du fluorure de sodium (NaF).

Attention: La préparation et l'utilisation du tampon STE doivent être effectuées sous une hotte chimique avec un équipement de protection individuelle approprié, car ce tampon contient du 2-mercaptoéthanol (BME).

  1. Les choses à faire avant de commencer
    1. Assurez-vous que tout l'équipement est extrêmement propre, et autoclavez tout équipement pouvant être autoclavé ( p. Ex., Bouteilles de meulage , centraux à grande vitesseTubes de fuge, etc. ).
      REMARQUE: Des conseils de filtrage sont recommandés pour toutes les étapes nécessitant une pipetage afin d'éviter toute contamination croisée.
    2. Voir la liste des équipements et des réactifs requis et préparer les tampons requis et les stocks de travail pour la méthode no 1 ( tableau 1 ). Refroidir les blocs de broyage cryogénique à -20 ºC et les rotors et tampons à 4 ºC, mettre la microcentrifugeuse à 4 ºC et allumer un bain-marie à 37 ºC.
  2. Isolation des organites
    1. Récoltez 5 g de tissu frais et rincez-le dans de l'eau stérile et froide dans un bécher refroidi sur glace.
      REMARQUE: conservez toujours les échantillons sur de la glace pendant toutes les opérations et les transports depuis et vers les centrifugeuses, les hottes, etc. Vous pouvez également travailler dans une chambre froide s'il y a accès à suffisamment d'espace et d'équipement pour exécuter le protocole.
    2. À l'aide de ciseaux, couper des feuilles dans des morceaux de ~ 1 cm directement dans un tube de 50 ml contenant deux broyage en céramiqueDes cylindres.
      REMARQUE: Nettoyer ou changer les ciseaux entre les échantillons afin d'éviter toute contamination croisée.
    3. S'il n'y a pas d'homogénéisateur de tissu, utilisez un mortier et un pilon et suivez les étapes 2.2.4 à 2.2.9.
      1. Couper le tissu de feuilles dans un mortier pré-refroidi sur glace. Moudre les échantillons pendant 2 à 3 min dans 15 ml de STE (dans la hotte).
      2. Verser le tampon (laisser le tissu dans le mortier) à travers un entonnoir contenant une couche de tissu de filtration pré-humide et stérile (taille de pore de 22 à 25 μm, voir le protocole principal pour plus de détails) dans un autre tube de 50 ml . Ajouter un supplément de 10 ml de STE sur le mortier et le pilon et homogénéiser à nouveau.
      3. Verser le tissu homogénéisé et le tampon dans le même entonnoir. Rincez le mortier et le pilon avec 10 ml de STE et versez-le dans l'entonnoir. Pressez et essorez le tissu de filtration dans l'entonnoir pour récupérer autant de liquides que possible.
        REMARQUE: Changer les gants entre les échantillons afin d'éviter toute contamination croisée. Continuez avec le proTocol à l'étape 2.2.10.
    4. Ajouter 20 ml de STE (dans la hotte) à chaque tube de 50 ml.
    5. Placez les échantillons dans des blocs de meulage cryogéniques pré-refroidis dans un appareil de meulage de tissu et broyez les échantillons pendant 2 x 30 s à 1750 tr / min. Faites pivoter les positions de l'échantillon et placez les échantillons sur de la glace pendant environ 1 minute entre les broyages.
      REMARQUE: Un mortier et un pilon, un mélangeur ou un autre dispositif de broyage / homogénéisation de tissu peuvent être utilisés dans cette étape. Cependant, chaque méthode affectera la qualité de l'ADN résultante à différents degrés et, par conséquent, la longueur et la qualité de l'ADN devraient être évaluées avant de continuer avec les applications en aval.
    6. Insérez un entonnoir dans un tube propre de 50 ml placé dans de la glace. Placez une couche de tissu de filtration dans l'entonnoir et pré-mouillez-le avec 5 ml de STE. Ne pas jeter l'écoulement.
    7. Verser le tissu homogénéisé dans l'entonnoir. Rincer le tube de broyage avec 15 ml de STE, récapituler et inverser le tube pour rincer les murs et le couvercle, et verser dans le champEl.
    8. Retirez délicatement les pierres de céramique, puis serrez et essorez le linge de filtration dans l'entonnoir.
      REMARQUE: Changer les gants entre les échantillons afin d'éviter toute contamination croisée.
    9. Enrouler les bouchons de tubes avec du parafilm pour éviter les déversements. Centrifuger à 2 000 xg pendant 10 min à 4 ºC.
    10. Aspirer soigneusement le surnageant à l'aide d'une pipette sérologique (éviter de perturber la pastille) et la placer dans un tube de centrifugation à grande vitesse de 50 mL (si les tubes n'ont pas de joints d'étanchéité étroits, enrouler les bouchons avec du parafil pour éviter les déversements). Jeter les pastilles.
    11. Équilibrer les tubes à 0,1 g en utilisant STE et centrifuger le surnageant résultant pendant 20 min à 18 000 xg et 4 ºC. Pour équilibrer les tubes, placez un petit bécher de glace sur la balance, tuez l'échelle et pesez les échantillons sur de la glace pour les garder au froid. Sinon, utilisez une balance et une hotte dans une chambre froide.
    12. Jeter le surnageant. Ajouter 1 ml de ST à la pastille et reprendre doucement nousAvec un pinceau doux. Ajouter 24 mL de ST (volume final de 25 mL) et mélanger / tourbillonner ( c.-à-d. Presser le pinceau sur le côté du tube pour enlever tout le liquide).
    13. Équilibrez les tubes à moins de 0,1 g en utilisant ST. Centrifuger pendant 20 min à 18 000 xg et 4 ºC. Pendant ce temps, préparez la solution DNaseI (voir le tableau 1 pour les recettes de stock et de solution de travail). Pour chaque échantillon, faire une aliquote de 200 μL dans un tube de 1,5 mL.
    14. Jeter le surnageant, nettoyer le tube et remettre en suspension la pastille (toujours dans un tube centrifuge à grande vitesse) dans 300 μL de ST à l'aide d'un pinceau doux. Placez le pinceau dans le tube de 1,5 mL préalablement préparé contenant 200 μL de solution DNaseI et faites tourbillonner le pinceau pour éliminer toute pastille résiduelle collée dans la brosse. Pipettez la solution DNaseI dans le tube centrifuge à grande vitesse et tournez doucement pour mélanger.
    15. Incuber à 37 ° C pendant 30 min dans un bain-marie (envelopper le parafilm autour de la partie supérieure du tube pour éviter la fuite de condensationG dans le capuchon). Mélanger délicatement en remuant 2 fois pendant l'incubation.
    16. Pipeter doucement le mélange de pastilles hors du tube à l'aide d'une pointe de pipette avec un grand orifice et le placer dans un tube à faible liant de 1,5 ml. Ajouter 500 μL d'EDTA 400 mM, pH 8,0, au tube de centrifugation à grande vitesse et à une pipette douce pour éliminer toute la pastille résiduelle du tube. Transférer l'EDTA sur le même tube à 1,5 litre sous forme de pellet et mélanger délicatement par inversion.
    17. Centrifuger à 18 000 xg pendant 20 min à 4 ºC. Jeter le surnageant, tacher le tube et utiliser à la fois pour isoler l'ADN. Si nécessaire, congeler des granulés à -20 ºC, mais cela peut entraîner une réduction du rendement, car DNase résiduelle peut dégrader l'échantillon d'ADN s'il n'est pas traité immédiatement.
  3. Extraction d'ADN à partir d'organelles isolées à l'aide d'une approche commerciale à base de colonne
    REMARQUE: consultez le manuel du kit pour le protocole complet 25 , et voir ci-dessous les modifications. PrIl est préférable de passer directement de l'isolement organellaire à l'extraction de l'ADN. La congélation et la décongélation répétées réduiront la taille des fragments d'ADN et conduiront à une dégradation de l'ADN par DNaseI résiduelle. Limiter le vortex ou le pipettage vigoureux, car cela peut cisailler l'ADN. L'utilisation de tubes de microcentrifugation à faible liaison est recommandée pour maximiser la récupération de l'ADN.
    1. Procédure d'extraction d'ADN
      REMARQUE: lisez le protocole commercial détaillé 25 avant de commencer à vous assurer que les tampons sont correctement fabriqués / stockés et que les procédures de spin-column sont comprises.
      1. Ajouter 180 μL de tampon ATL directement dans le tube avec la pastille (décongelée si préalablement congelée et équilibrée à température ambiante sur la table).
      2. Procédez à l'étape 3 dans le protocole pour "Purifications d'ADN à partir des tissus" dans le manuel du kit, avec les modifications suivantes: une lyse de 30 minutes à l'étape 3, incluent la digestion facultative de la RNase A et élucient dans 3 x 200 μL d'AE ( Chacun dans un seParate tube puis combine les élutions).
      3. Enregistrez une aliquote (au moins 20 μL) pour qPCR (voir étape 4.1). Pour quantifier avant la concentration, économisez 1 μL supplémentaire pour la quantification à haute sensibilité.
      4. Si désiré, procéder à la concentration de l'échantillon.
  4. Concentration d'échantillon avec des unités de filtrage commerciales
    REMARQUE: voir le protocole commercial 26 pour plus de détails. En fonction de l'utilisation en aval, il se peut qu'il ne soit pas nécessaire d'effectuer une concentration d'échantillon ( p. Ex., Pour la PCR en bout de point et les applications qPCR). Cependant, pour la construction de la bibliothèque NGS, il sera probablement nécessaire de concentrer l'ADN organellaire dilué obtenu après l'extraction de l'ADN.
    1. Procédure de colonne de concentration
      1. Pré-peser soigneusement (voir le tableau 2 ) l'unité de filtre vide (sans tube) sur un morceau de papier de travail propre sur une balance analytique numérique. Notez le poids.
      2. PiPette les élutions combinées dans l'unité de filtrage et pesez-les soigneusement.
        REMARQUE: Le manuel commercial 26 indique que le volume maximal de l'unité de filtrage est de 500 μL, mais jusqu'à 575 μL peuvent être ajoutés à l'unité à la fois sans débordement.
      3. Placez soigneusement l'unité de filtre remplie dans un tube (fourni avec les colonnes). Centrifuger à 500 xg pour le temps désiré pour atteindre le volume de concentré requis. Pour un volume d'échantillon de ~ 575 μL, un spin de 20 minutes entraînera habituellement un volume de concentré de 15 à 30 μL.
      4. Retirez le filtre du tube et pesez à nouveau. Utilisez le tableau pour déterminer si le volume désiré du concentré a été atteint. Sinon, centrifuger à nouveau à 500 xg pendant plus de temps et pesez encore; Répétez jusqu'à ce que le volume désiré du concentré soit atteint.
      5. Placez un nouveau tube (fourni avec les colonnes) sur le dessus de l'unité de filtrage et inversez. Centrifuger pendant 3 min à 1000 xg pour transférer le coCentré sur le tube.
      6. Déterminez le volume récupéré. Ce sera généralement de ~ 3 à 5 μL de moins que le volume calculé, en raison de la rétention du filtre. Si trop concentré, diluer avec de l'eau stérile ou TE pour obtenir le volume désiré.
      7. Quantifier l'ADN en utilisant une quantification de haute sensibilité (selon les instructions du fabricant).

3. Méthode n ° 2: Approche de fractionnement de méthyle (MF) pour enrichir l'ADN organellaire de l'ADN génomique total

NOTE: Ce protocole a été modifié à partir d'un protocole d'extraction d'ADN Genomic Tip Kit développé par l'utilisateur pour les plantes et les champignons 27 et le protocole commercial Microbiome DNA Enrichment Kit 28 . En théorie, tout protocole d'isolement d'ADN qui donne un ADN de masse moléculaire élevée peut être utilisé pour le déroulage. Pour un séquençage à lecture courte, toute extraction produisant principalement des fragments de 15 kb est adéquate pour une utilisation dans le déroulage. Pour leNg-read sequence, des fragments plus importants peuvent être souhaitables. Par conséquent, nous avons optimisé ce protocole pour produire un ADN de poids moléculaire élevé.

  1. Isolation de l'ADN total
    REMARQUE: voir la liste des équipements requis et des réactifs et préparer les tampons requis et les stocks de travail pour la méthode no 2 ( tableau 1 ). Ajouter des enzymes de lysing au stock de tampon de lyse pour obtenir la solution de traitement du tampon de lyse. Allumez le thermomixer et réglez-le à 37 ° C. Allumez le bain-marie à 50 ° C et placez le tampon QF dans le bain. Placer 70% d'EtOH dans le congélateur et mettre la microcentrifugeuse à 4 ° C.
    1. Extraction totale d'ADN à l'aide de colonnes commerciales d'extraction d'ADN
      REMARQUE: Avant de commencer, lisez le manuel commercial 29 pour des informations détaillées concernant l'utilisation des colonnes d'échange d'anions par gravité. Les colonnes peuvent être configurées à l'aide d'un rack spécialisé ou placées sur les tubes à l'aide des bagues en plastique fournies. Toutes les étapes, y compris le gDes astuces d'émotion, devraient être autorisées à se faire par écoulement par gravité, et le liquide résiduel ne devrait PAS être forcé.
      1. Moudre 20 mg de tissu congelé dans de l'azote liquide dans un tube à 2 ml à faible liant en utilisant des pilons à broyer portatifs conçus pour des tubes de 2 ml.
      2. Ajouter 2 mL de solution de tampon de lyse (les tubes seront très complets).
      3. Incuber dans un thermomixer à 37 ° C pendant 1 h avec une agitation douce à 300 tr / min. Si un thermomixer n'est pas disponible, l'incubation sur un bloc de chaleur et le mélange par un léger flicking toutes les 15 minutes est une alternative appropriée.
      4. Ajouter 4 μL de RNase A (100 mg / mL, concentration finale de 200 μg / mL). Inverser pour mélanger et incuber dans un thermomixer pendant 30 min à 37 ° C, avec une agitation douce à 300 tr / min.
      5. Ajouter 80 μl de protéinase K (20 mg / ml, concentration finale de 0,8 mg / mL), inverser pour mélanger et incuber dans un thermomixer pendant 2 h à 50 ° C, avec une agitation douce à 300 tr / min.
      6. Centrifuger pendant 20 min à 4 ° C et 15.000 xg pour granuler les débris insolubles.
      7. Pendant que les échantillons sont centrifugés, équilibrer les colonnes avec 1 mL de Buffer QBT et laisser la colonne s'effondrer par écoulement par gravité.
      8. Utilisez une pointe de pipette à large diamètre pour appliquer rapidement l'échantillon (éviter la pastille) à la colonne équilibrée et lui permettre de circuler complètement dans la colonne. Si l'échantillon devient trouble, filtrer ou centrifuger à nouveau avant l'application sur la colonne (voir le manuel commercial pour les détails 29 ).
      9. Une fois que l'échantillon est entré dans la résine, lavez la colonne avec 4 x 1 mL de tampon QC.
      10. Suspendre la colonne sur un tube de microcentrifugeuse propre, à 2 ml, à faible liaison. Eluire l'ADN génomique avec 0,8 ml de Buffer QF préchauffé à 50 ° C.
      11. Précipiter l'ADN en ajoutant 0,56 ml (0,7 volume de tampon d'élution) d'isopropanol à température ambiante à l'ADN élué.
      12. Mélanger par inversion (10X) et centrifuger immédiatement pendant 20 min à 15 000 xg et 4 ° C. Se soucierEnlever complètement le surnageant sans perturber la pastille vitreuse, lâchement attachée.
      13. Laver la pastille d'ADN centrifugée avec 1 ml d'éthanol froid à 70%. Centrifugez pendant 10 min à 15 000 xg et 4 ° C.
      14. Retirez soigneusement le surnageant (soyez prudent avec cette étape également) sans perturber la pastille. Sécher à l'air pendant 5 à 10 min et ré-endiguer l'ADN dans 0,1 ml de tampon d'élution (EB). Dissoudre l'ADN pendant une nuit à température ambiante. Évitez les pipettes, ce qui peut cisailler l'ADN.
      15. Quantifier les échantillons en utilisant un dosage de quantification d'ADN à haute sensibilité (selon les instructions du fabricant).
  2. Fractionnement à base de perles d'ADN méthylé et non méthylé
    NOTE: Une publication récente a démontré l'utilisation d'un kit 28 disponible dans le commerce qui profite d'une approche déroulante en utilisant une protéine de domaine de liaison au méthyle spécifique de CpG fusionnée au fragment Fc IgG humain (protéine MBD2-Fc) à la fractionA mangé des génomes organellaires de plantes (non méthylés) à partir de génome nucléaire (fortement méthylé) 23 . L'efficacité de fractionnement dans les échantillons de blé n'a pas été préalablement testée à l'aide de ce kit MF commercial 28 .
    1. Les choses à faire avant de commencer
      1. Préparez à nouveau 80% d'éthanol (au moins 800 μL par réaction). Réglez le tampon de liaison / lavage 5x pour décongeler sur la glace et préparez 5 mL de 1x tampon par échantillon (diluer le tampon 5X avec de l'eau stérile sans nuclease et garder la glace pendant le protocole).
    2. Préparer des billes magnétiques liées à la protéine MBD2-Fc
      1. Préparez le nombre requis de jeux de talons. Évaluez les réactions à utiliser entre 1 et 2 μg d'ADN d'entrée totale, nécessitant 160 à 320 μl de perles. Notez que les réactions énumérées ci-dessous sont pour 1 μg d'ADN d'entrée totale, donc elles nécessitent 160 μL de perles. Échelle les réactions selon les besoins.
      2. À l'aide de pointes à puits larges, faites pipeter doucement la protéine A magnétique BMélanger les boules de mouton vers le haut et vers le bas pour créer une suspension homogène. En variante, tourner doucement le tube de perles pendant 15 min à 4 ° C.
        REMARQUE: Ne pas tourbillonner les perles.
      3. Procédez selon les instructions selon les instructions du fabricant 28 .
    3. Capture d'ADN nucléaire méthylé
      1. Pour chaque échantillon individuel, ajouter 1 μg d'ADN d'entrée à un tube contenant 160 μL de billes magnétiques liées à MBD2-Fc.
      2. Ajouter 5 fois le tampon de liaison / lavage en fonction du volume de l'échantillon d'ADN pour une concentration finale de 1x (volume de 5x bind / tampon de lavage pour ajouter (μL) = volume d'ADN d'entrée (μL) / 4). Pipettez l'échantillon vers le haut et vers le bas quelques fois pour le mélanger en utilisant une pointe de pipette à large diamètre.
      3. Faire tourner les tubes à température ambiante pendant 15 min. Pipettez doucement les échantillons avec une pointe de pipette à large diamètre et faites passer les échantillons 2 à 3 fois tout au long de l'incubation pour éviter l'agglomération des bourrelets.
        REMARQUE: le pipettage et le flickiNg est essentiel pour assurer un effondrement efficace de l'ADN méthylé.
    4. Collecte d'ADN organellaire enrichi et non méthylé
      1. Tourner brièvement le tube contenant l'ADN et le mélange de cordons magnétiques liés à MBD2-Fc. Placez le tube sur un support magnétique pendant au moins 5 minutes pour collecter les perles sur le côté du tube. La solution devrait apparaître claire.
      2. En utilisant des pointes à large éventail, retirez soigneusement le surnageant nettoyé sans perturber les perles. Transférer le surnageant (contient un ADN non méthylé, enrichi en organelle) à un tube de microcentrifugeuse propre, à faible liaison et à 2 mL. Rangez cet échantillon à -20 ou -80 ° C, ou passez directement à l'étape 3.2.6 pour la purification.
    5. Elute a capturé l'ADN nucléaire à partir des billes magnétiques liées à MBD2-Fc
      1. Si la fraction nucléaire est également souhaitée, suivre les instructions du fabricant 28 pour éluer l'ADN nucléaire à partir des billes magnétiques liées à MBD2-Fc; Purifier comme décrit à l'étape 3.2.7.
    6. Purification d'acide nucléique à base de perles
      1. Assurez-vous que les grains de purification sont à température ambiante et sont bien mélangés. Procédez avec le protocole selon les instructions du manuel MF kit 28 .
        REMARQUE: l'échantillon peut maintenant être utilisé pour la construction de la bibliothèque NGS ou une autre analyse en aval.

4. Quantification d'échantillon et contrôle de qualité

  1. QPCR analyse pour évaluer l'enrichissement organellaire
    REMARQUE: les paramètres de réaction et d'analyse du qPCR répertoriés ici ont été conçus pour être utilisés sur un Roche LightCycler 480 et peuvent être ajustés pour différents équipements et réactifs. Si qPCR n'est pas disponible, la PCR et la visualisation finale sur un gel d'agarose peuvent être utilisées comme mesure qualitative de la pureté de l'échantillon, en utilisant les mêmes amorces et les mêmes conditions décrites ici. Les tailles d'amplicon seront de ~ 150 pb pour tous les ensembles d'amorces. Voir le tableau 3 pour la séquence d'amorcesCes et les jumelages.
    1. Configuration de la réaction qPCR
      1. Pour mettre en place une réaction individuelle de 20 μL de qPCR, faites pipeter soigneusement le suivant dans un puit unique d'une plaque qPCR à 96 puits: 10 μL de 2x SYBR Green I Master; 2 μL du mélange d'amorces avant et arrière de 10 μM (pour une concentration finale de 0,5 μM); 2 μL de gabarit (dans la plage de la courbe standard); Et 6 μl de H 2 O stérile et exempt de nucléases. Pour réduire les erreurs de pipetage, il est préférable de créer un mélange maître avec tous les composants de réaction sauf le modèle. Ajoutez le mélange maître à la plaque qPCR, puis ajoutez le modèle d'intérêt pour chaque puits. Trois répétitions techniques pour chaque échantillon devraient être effectuées pour minimiser les effets de l'erreur de pipettage.
        NOTE: En fin de compte, le rapport des cycles de quantification nucléaire à organellaire est comparé entre les échantillons, de sorte que de légères différences de concentration sont acceptables. Cependant, les concentrations d'ADN devraient être à peu près dans la limite deCh autre.
      2. Sceller la plaque avec un film d'étanchéité qPCR de haute qualité. Mélanger doucement les échantillons, en prenant soin d'éviter la création de bulles. Tourner brièvement la plaque pendant 2 min à 4 ° C pour collecter l'échantillon et éliminer les petites bulles.
      3. Chargez la plaque dans la machine. Exécutez le programme qPCR selon les directives énumérées ci-dessous.
    2. QPCR paramètres de réaction
      REMARQUE: Ce sont les paramètres par défaut, à l'exception du cycle de recuit de l'étape d'amplification. Réglez ce paramètre pour tenir compte des amorces spécifiques si celles utilisées diffèrent des amorces présentées dans ce protocole.
      1. Pré-incuber à 95 ° C pendant 5 min, avec un taux de rampe de 4.4 ° C / s.
      2. Effectuer 45 cycles d'amplification de (1) 95 ° C pendant 10 s, avec un taux de rampe de 4.4 ° C / s; (2) 60 ° C pendant 20 s, avec un taux de rampe de 2,2 ° C / s; Et (3) 72 ° C pendant 10 s, avec un taux de rampe de 4.4 ° C / s (données acquises pendant (3)).
      3. Utilisez une optioCycle de courbure de fond de 95 ° C pendant 5 s, avec un taux de rampe de 4.4 ° C / s; 65 ° C pendant 1 min, avec un taux de rampe de courant de 2.2 ° C / s; Et 97 ° C, avec un mode d'acquisition continu.
      4. Utilisez un cycle de refroidissement de 40 ° C pendant 30 s, avec un taux de rampe de 1,5 ° C / s.
    3. Paramètres d'analyse
      1. Sélectionnez le modèle SYBR. Vérifiez les paramètres du programme dans le bouton Expérience. Une fois la plaque chargée, le dosage peut être démarré et les réglages peuvent être ajustés pendant l'exécution du test.
      2. Affectez des échantillons à l'aide de l'éditeur d'échantillons. Sélectionnez Abs Quant comme flux de travail et désignez les échantillons comme inconnus, des normes ou des contrôles négatifs. Désignez les répliques et remplissez les exemples de noms de la première de chaque réplique. Ajouter les concentrations et les unités aux normes.
      3. Configurer les sous-ensembles pour l'analyse; Ceux-ci sont attribués dans l'éditeur de sous-ensemble.
      4. Pour l'analyse, sélectionnez Abs Quant / 2nd Derivative Max dans la liste "Créer une nouvelle analyse".Importez la courbe standard sauvegardée de l'extérieur (le cas échéant), puis cliquez sur Calculer; Le rapport contiendra les informations sélectionnées.
      5. Pour effectuer une quantification absolue précise pour la détermination du nombre de copies ou de la concentration, utilisez une courbe standard représentative de l'échantillon testé ( par exemple, l' ADN organellaire isolé des méthodes ci-dessus). Étant donné que la quantité d'ADN mitochondrial nécessaire pour préparer une courbe standard est trop élevée pour être atteinte avec une quantité raisonnable de tissu, ne pas utiliser les calculs de numéros de copie fournis par le logiciel, mais plutôt examiner les valeurs du point de passage (Cp) pour déterminer l'enrichissement relatif D'organelaire par rapport à l'ADN nucléaire dans les échantillons. Comparez ces quantités relatives à celles de l'ADN génomique total (voir les résultats représentatifs ). Efficacité des amorces de test sur cinq dilutions 1:10 d'ADN génomique total à partir de semis de blé entièrement cultivés à la lumière de deux semaines (efficacités représentatives signalées dansE légende de la figure 2 ).
  2. L'électrophorèse sur gel à champ pulsé (PFGE)
    REMARQUE: Ce protocole est basé sur les directives du fabricant pour effectuer le PFGE pour résoudre l'ADN de masse moléculaire élevée. Voir la table des matériaux.
    1. Préparation du gel et des échantillons
      1. Suivez les directives pour la préparation du gel et des échantillons et adaptez-les au système disponible.
    2. Exécuter les paramètres
      1. Suivez les instructions pour la mise en place du système d'électrophorèse et utilisez les paramètres suivants: temps de commutation initial de 2 s, temps de commutation final de 13 s, durée de fonctionnement de 15 h et 16 min, V / cm de 6 et angle inclus de 120 ° .
    3. Tacher et imaginer le gel
      1. Tachez le gel avec un colorant de choix ( par exemple, bromure d'éthidium ou une alternative appropriée) et une image avec un système de documentation de gel approprié.
  3. NGS et analyse
    1. Utilisez 1 ng d'ADN comme entrée pour le kit de préparation de la bibliothèque d'ADN, selon les instructions du fabricant.
    2. Barcode et regroupe les échantillons pour le séquençage en une seule course. Effectuer le séquençage selon les directives du fabricant.
      REMARQUE: les paramètres de mise en commun et de séquençage peuvent être modifiés selon les espèces d'intérêt, le niveau de couverture souhaité et la plate-forme utilisée pour séquencer les bibliothèques. Par exemple, une voie HiSeq a beaucoup plus de sortie qu'une voie MiSeq, tant d'autres échantillons peuvent être multiplexés. Séquence d'un sous-ensemble plus petit d'échantillons pour déterminer si les niveaux de couverture des génomes organellaires sont adéquats pour l'analyse en aval.
    3. Examinez la qualité de lecture en utilisant FastQC 31 pour déterminer l'étendue de la coupe et du filtrage requise pour les données.
    4. Découpez et filtrez les lectures brutes en utilisant Trimmomatic 32 ou un autre programme comparable. Utilisez les paramètres suivants: ILLUMINACLIP 2:30:10 (pour enlever les adaptateurs), LEADING 3, TRAILING 3, SLIDINGWINDOW 4:10 et MINLEN 100.
    5. Mettez les lectures filtrées filtrées par la qualité et adaptées (PE) à la mitochondrie Spring chinoise (NCBI Reference Sequence NC_007579.1 33 ), au chloroplaste (NCBI Reference Sequence NC_002762.1 34 ) et au nucléaire 35 génomes de référence utilisant Bowtie2 36 , Avec les paramètres suivants: -I 0 -X 800 - sensible.
    6. Convertissez les fichiers d'alignement sam au format bam (samtools) et trimez les fichiers bam. Utilisez les fichiers bam pour calculer la couverture de l'ensemble du génome et la couverture par base avec les toiles de lit. Visualisez les résultats avec la fonction R-plot.

Résultats

Les protocoles présentés dans ce manuscrit décrivent deux méthodes distinctes pour enrichir l'ADN organellaire du tissu végétal. Les conditions présentées ici reflètent l'optimisation du tissu de blé. Une comparaison des étapes clés dans les protocoles, l'apport de tissus requis et la sortie d'ADN sont décrites à la figure 1 . Les étapes du protocole DC testé suivent des conditions similaires à celles décrites précédemment...

Discussion

À ce jour, la plupart des études de séquençage organellaire se concentrent sur les méthodes DC traditionnelles pour enrichir l'ADN spécifique. Des méthodes pour isoler des organites de diverses plantes ont été décrites, y compris la mousse 40 ; Monocoques telles que le blé 15 et l'avoine 11 ; Et des dicotylédones comme l'arabidopsis 11 , le tournesol 17 et le colza

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts concurrents.

La mention de noms commerciaux ou de produits commerciaux dans cette publication vise uniquement à fournir des informations spécifiques et n'implique pas une recommandation ou une approbation par le ministère de l'Agriculture des États-Unis. USDA est un fournisseur et un employeur offrant l'égalité des chances.

Remerciements

Nous souhaitons remercier le ministère du Service d'agriculture et de recherche agricole de l'Amérique du Nord et de la National Science Foundation (IOS 1025881 et IOS 1361554). Nous remercions R. Caspers pour la maintenance des serres et les soins des plantes. Nous remercions également le Centre de génomique de l'Université du Minnesota, où les préparations et le séquençage de la bibliothèque Illumina ont été réalisés. Nous sommes également reconnaissants pour les commentaires des éditeurs de journaux et de quatre examinateurs anonymes qui ont renforcé notre manuscrit. Nous remercions également l'OCDE pour une bourse à SK pour intégrer ces protocoles pour des projets collaboratifs avec des collègues au Japon.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol; BME)Sigma AldrichM3148-100ml
2-propanol (Isopropyl alcohol/isopropanol), bioreagentSigma AldrichI9516
agarose, Bio-Rad Cetified Megabase agaroseBio-Rad1613108
analytical balanceMettler ToledoAB54-S
balanceMettler ToledoPB1502-S
bovine serum albumin (BSA)Sigma AldrichB4287-25G
Ceramic grinding cylinders, 3/8in x 7/8inSPEX SamplePrep2183
Cryogenic Blocks compatible with tissue homogenizer for holding 50 ml tubesSPEX SamplePrep2664
DNaseISigmaDN25
ethanol, absoluteDecon Laboratories2716
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), 0.5M Solution, pH8.0FisherBP2482-500
gel imaging system
gel stainSuch as GelRed or Ethidium Bromide
grinding pestle, wide tip for 2 ml conical tubes
Guanidine-HCl, 8M solutionThermoFisher24115
LightCycler 480 SYBR Green I MasterRoche4707516001
liquid nitrogen
Lysing enzymes from Trichoderma harzianumSigmaL1412
Magnesium ChlorideG Bioscience24115
magnetic rackThermoFisherA13346
microcentrifuge tubes, LoBind 1.5 ml Eppendorf22431021
microcentrifuge tubes, standard nuclease-free 1.5 mlEppendorf
microcentrifuge, refrigeratedSorvall Legend X1ROr equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotors for 50 ml tubes, Oak Ridge tubes, and 1.5 ml tubes
microcentrifuge, room temperatureEppendorf5424Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotor for 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes
Microcon DNA Fast Flow Centrifugal Filter UnitsEMD MilliporeMRCFOR100
Miracloth, 1 square per sample cut to fit funnelEMD Millipore475855
NEBNext Microbiome DNA Enrichment KitNew England BiolabsE2612L
parafilmParafilm MPM992
plastic pots and trays
polyvinylpyrrolidone (PVP)FisherBP431-100
Proteinase KQiagen19131
Pulsed-Field Gel Electrophoresis rig (e.g. CHEF DR III)Bio-Rad1703697
purification beads, Agencourt AMpureXP beadsBeckman CoulterA63881
QIAamp DNA Mini KitQiagen51304
Qiagen 20/g Genomic Tip DNA Extraction KitQiagen10223
Qiagen Buffer EB (elution buffer)Qiagen19086
Qiagen DNA Extraction Buffer SetQiagen19060
QiaRackQiagen19015
qPCR machine (e.g. Roche Light Cycler 480)Roche
qPCR plate sealing filmRoche4729757001
qPCR plate, 96 well plateRoche4729692001
Qubit assay tubesLife TechnologiesQ32856
Qubit Broad Spectrum assay kitLife TechnologiesQ32850
Qubit High Sensitivity assay kitLife TechnologiesQ32851
RNaseAQiagen19101
Serological pipettes (20 ml) and pipet-aidFisher13-678-11
Small funnels, 1 per sample
Sodium ChlorideAmbionAM9759
Soft paintbrush, 2 per sample
SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder or another type of tissue homogenizerSPEX SamplePrepOr another comparable tissue homogenizer. If you do not have access to a tissue homogenizer, then grinding in a pre-chilled mortar and pestle will suffice (see protocol for details). However, a homogenizer will give more consistent results and total homogenization time is reduced.
SucroseOmnipure8550
TBE
thermomixer
TrisSigmaT2819-100ml
Triton X-100PromegaH5142
tube rotater
tubes, 50 mL conical polypropyleneCorning352070
tubes, 50 ml high-speed polypropylene ThermoScientific/Nalgene3119-0050e.g. Nalgene Oakridge tubes or equivalent
vermiculite
water bath
water, sterile and certified Nuclease-free Fisher1481
water, sterile milliQ

Références

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