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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Viene presentato il confronto e l'ottimizzazione di due metodi di arricchimento organellare del DNA vegetale: centrifugazione differenziale tradizionale e frazionamento del gDNA totale sulla base dello stato di metilazione. Valutiamo la quantità e la qualità del DNA risultanti, dimostriamo le prestazioni in sequenza di prossima generazione e discutiamo il potenziale di utilizzo in sequenza a lunga lettura di singole molecole.

Abstract

I genomi organellari delle piante contengono grandi elementi ripetitivi che possono subire un accoppiamento o una ricombinazione per formare strutture complesse e / o frammenti subgenomici. Anche i genomi organistici esistono in aggiunte all'interno di una determinata cellula o tipo di tessuto (eteroplasma) e un'abbondanza di sottotipi può cambiare durante lo sviluppo o quando è sotto lo stress (spostamento sotto-stechiometrico). Sono necessarie tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS) per ottenere una comprensione più approfondita della struttura e della funzione del genoma organellare. Gli studi di sequenziamento tradizionali utilizzano diversi metodi per ottenere DNA organellare: (1) Se viene utilizzata una grande quantità di tessuto di partenza, viene omogeneizzata e sottoposta a centrifugazione differenziale e / o depurazione gradiente. (2) Se si utilizza una quantità minore di tessuti ( cioè, se i semi, il materiale o lo spazio sono limitati), lo stesso processo viene eseguito come in (1), seguito da un'amplificazione del genoma completa per ottenere un DNA sufficiente. (3) L'analisi di bioinformatica può essere usata per seqIl DNA totale genomico e per analizzare le letture organellari. Tutti questi metodi hanno sfide intrinseche e compromessi. In (1), può essere difficile ottenere una così grande quantità di tessuto di partenza; In (2), l'amplificazione del genoma intero potrebbe introdurre una bias di sequenziamento; E in (3), l'omologia tra genomi nucleari e organellari potrebbe interferire con l'assemblaggio e l'analisi. Nelle piante con grandi genomi nucleari è vantaggioso arricchire il DNA organellare per ridurre i costi di sequenza e la complessità delle sequenze per le analisi di bioinformatica. Qui confrontiamo un tradizionale metodo di centrifugazione differenziale con un quarto metodo, un approccio adattato CpG-metile, per separare il DNA genomico totale in frazioni nucleari e organellari. Entrambi i metodi forniscono un sufficiente DNA per NGS, DNA che è altamente arricchito per sequenze organellari, anche se a diversi rapporti nei mitocondri e nei cloroplasti. Presentiamo l'ottimizzazione di questi metodi per i fogli di frumento e discutere di importanti vantaggi e dI vantaggi di ogni approccio nel contesto dell'input di campionamento, della facilità di protocollo e dell'applicazione a valle.

Introduzione

Il sequenziamento del genoma è un potente strumento per disseccare la base genetica sottostante di importanti tratti vegetali. La maggior parte degli studi di sequenziamento genomico si concentra sul contenuto del genoma nucleare, in quanto la maggioranza dei geni si trova nel nucleo. Tuttavia, i genomi organellari, inclusi i mitocondri (attraverso eucarioti) e plastidi (in piante, la forma specializzata, il cloroplasto, funzionano in fotosintesi) contribuiscono a fornire notevoli informazioni genetiche fondamentali per lo sviluppo organico, la risposta allo stress e la forma fisica1 . I genomi organellari sono tipicamente inclusi nelle estrazioni totali del DNA destinate al sequenziamento del genoma nucleare, anche se vengono impiegati anche metodi per ridurre i numeri degli organeli prima dell'estrazione del DNA 2 . Molti studi hanno utilizzato risultati di sequenziamento delle estrazioni totali di gDNA per assemblare genomi organistici 3 , 4 , 5 ,xref "> 6, 7. Tuttavia, quando l'obiettivo dello studio è di concentrarsi su genomi organellari, utilizzando il totale gDNA aumenta i costi di sequenziamento perché molti letture sono 'perso' per le sequenze di DNA nucleare, in particolare in impianti di grandi genomi nucleari Inoltre, a causa della duplicazione e del trasferimento di sequenze organellari nel genoma nucleare e tra gli organelli, risolvendo la corretta posizione di mappatura del sequenziamento legale al genoma corretto è bioinformatica impegnativa 2 , 8. La purificazione dei genomi organellari dal genoma nucleare è una Strategia per ridurre questi problemi.Per ulteriori strategie di bioinformatics possono essere utilizzati per separare le letture che mappano alle regioni di omologia tra i mitocondri ei cloroplasti.

Mentre i genomi organellari da molte specie vegetali sono stati sequenziati, poco si sa sulla larghezza della diversità genomica organellareDisponibile in popolazioni selvatiche o in piscine coltivate. I genomi organellari sono noti anche per essere molecole dinamiche che subiscono un significativo riarrangiamento strutturale a causa della ricombinazione tra sequenze di ripetizione 9 . Inoltre, molte copie del genoma organellare sono contenute all'interno di ciascuna organella e sono presenti più organelli all'interno di ciascuna cellula. Non tutte le copie di questi genomi sono identiche, che è conosciuto come eteroplasma. Contrariamente all'immagine canonica di "cerchi master", ora si registra una crescente evidenza per un quadro più complesso di strutture del genoma organellare, compresi cerchi subgenomiali, cromosomi lineari, concatamers lineari e strutture ramificate 10 . L'assemblaggio di genomi organellari vegetali è ulteriormente complicato dalle loro dimensioni relativamente grandi e dalle sostanziali ripetizioni invertite e dirette.

Protocolli tradizionali per l'isolamento organellare, la purificazione del DNA e il genoma successivo I sequenziamenti sono spesso ingombranti e richiedono grandi volumi di input tissutale, con diversi grammi in aumento di centinaia di grammi di tessuti fogliari giovani necessari come punto di partenza 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Questo rende il sequenziamento del genoma organellare inaccessibile quando il tessuto è limitato. In alcune situazioni, gli importi dei semi sono limitati, ad esempio quando è necessario sequenziare su base generazionale o in linee sterili maschili che devono essere mantenute attraverso l'attraversamento. In queste situazioni, il DNA organellare può essere purificato e quindi sottoposto ad amplificazione del genoma intero. Tuttavia, l'amplificazione del genoma intero può introdurre significative bias di sequenziamento, che costituisce un problema particolare nella valutazione della variazione strutturale, delle strutture subgenomiche e dei livelli di eteroplasmi> 18. I recenti progressi nella preparazione della biblioteca per le tecnologie di sequenza brevettate hanno superato le barriere a basso input per evitare l'amplificazione del genoma intero. Ad esempio, il kit di preparazione alla libreria Illumina Nextera XT consente di utilizzare fino a 1 ng di DNA come input 19 . Tuttavia, le preparazioni standard di libreria per applicazioni di sequenziamento a lungo lette, come le tecnologie di sequenziamento PacBio o Oxford Nanopore, richiedono ancora una quantità relativamente elevata di DNA di input, che può rappresentare una sfida per il sequenziamento del genoma organellare. Recentemente, sono stati sviluppati nuovi protocolli di sequencing realizzati a livello manuale per ridurre gli importi e contribuire a facilitare il sequenziamento dei genomi nei campioni in cui è difficile ottenere quantità di DNA di microgrammi 20 , 21 . Tuttavia, ottenendo frazioni organolari puri ad alto peso molecolare per alimentare questi preparati alla libreria rimane una sfida.

Abbiamo cercato tO confrontare e ottimizzare i metodi di arricchimento e isolamento del DNA organellare adatti a NGS senza la necessità di amplificazione del genoma intero. In particolare, il nostro obiettivo era quello di determinare le migliori pratiche per arricchire il DNA organellare a peso molecolare dai materiali di partenza limitati, ad esempio un sottoinsieme di foglia. Questo lavoro presenta un'analisi comparativa dei metodi da arricchire per il DNA organellare: (1) un protocollo di centrifugazione differenziale tradizionale modificato rispetto a (2) un protocollo di frazionamento del DNA basato sull'uso di un approccio pulldown di proteine ​​del dominio di DNA di CpG 22 applicato al tessuto vegetale 23 . Raccomandiamo le migliori pratiche per l'isolamento del DNA organellare da tessuti di foglie di grano, che possono essere facilmente estesi ad altre piante e tipi di tessuti.

Protocollo

1. Generazione di materiali vegetali per l'isolamento organico e l'estrazione del DNA

  1. Crescita standard dei semenzali di frumento
    1. Sementi vegetali in vermiculite in piccoli vasi quadrati con 4 - 6 semi per angolo. Trasferire in serra o in camera di crescita con un ciclo leggero da 16 h, 23 ºC giorno / 18 ºC notte.
    2. Acqua le piante ogni giorno. Fertilizzare le piante con ¼ di cucchiaino di fertilizzante granulare 20-20-20 NPK alla germinazione ea 7 giorni dopo la germinazione.
  2. Eziolazione alternativa delle piantagioni di frumento
    1. Seguire il passo 1.1, ma mettere le pentole in una camera di crescita scura, 23 ° C per 16 h / 18 ºC per 8 ore. In alternativa, coprire le piante nella serra ( ad esempio, con un contenitore di stoccaggio, tuttavia, deve essere mantenuta una corretta ventilazione).
  3. Crescita e raccolta dei tessuti
    1. Coltivi le piante per 12 - 14 giorni. Per la maggior parte del genotipo del granoS, 75 - 100 piantine producono circa 10 - 12 g di tessuto, che è sufficiente per due estratti organellari utilizzando il metodo di centrifugazione differenziale (sezione 2); Solo una pianta è necessaria se si utilizza l'approccio pulldown a base di DNA CpG-metilazione per frazionare l'organellare dal DNA nucleare (sezione 3).
    2. Se si utilizza l'approccio di centrifugazione differenziale, raccogliere il tessuto fresco e procedere immediatamente alla lavorazione dei campioni, come descritto nella sezione 2.
    3. Se si utilizza l'approccio pulldown CpG-metil, raccogliere le sezioni di tessuto giovanile da 20 mg in tubi di microcentrifuga (utilizzare i tessuti standardizzati o etiolati, vedere i risultati rappresentativi ). Snap-freeze sull'azoto liquido e congelare a -80 ºC fino all'uso. Procedere alla frazionamento a distanza del DNA, come descritto nella sezione 3.

2. Metodo # 1: Estrazione del DNA mediante centrifugazione differenziale (DC)

NOTA: il diffIl protocollo di centrifugazione erenziale è stato modificato da due pubblicazioni che ottimizzano le condizioni per isolare entrambi gli organelli ma arricchire per i mitocondri 17 , 24 . Il protocollo risultante è meno intensivo e utilizza meno sostanze chimiche tossiche rispetto ai metodi precedenti. In particolare, abbiamo apportato modifiche ai buffer e ai passaggi di lavaggio, compreso l'aggiunta di polivinilpirrolidone (PVP) al tampone di estrazione STE e l'eliminazione del passaggio finale di lavaggio in buffer NETF, che contiene fluoruro di sodio (NaF).

Attenzione: La preparazione e l'uso del tampone STE deve essere eseguita sotto una cappa chimica chimica con adeguata attrezzatura per la protezione personale, in quanto questo tampone contiene 2-mercaptoetanolo (BME).

  1. Cose da fare prima di iniziare
    1. Assicurarsi che tutte le apparecchiature siano estremamente pulite e autoclave tutte le apparecchiature autoclavabili ( ad esempio, cilindri di macinazione , centri ad alta velocitàTubi flessibili, ecc .).
      NOTA: Consigli di filtro sono consigliati per tutti i passaggi che richiedono pipettature per evitare contaminazioni incrociate.
    2. Vedere l'elenco delle attrezzature e dei reagenti necessari e preparare i buffer e le scorte richieste per il metodo # 1 ( tabella 1 ). Far raffreddare i blocchi criogenici a -20 ºC ei rotori e tamponi a 4 ºC, impostare la microcentrifuga a 4 ºC e accendere un bagno d'acqua a 37 ºC.
  2. Isolamento di organelli
    1. Raccogliete 5 g di tessuto fresco e sciacqualo in acqua fredda e sterile in un bicchiere raffreddato sul ghiaccio.
      NOTA: Tenere sempre i campioni in ghiaccio durante tutte le operazioni e trasporti da e verso le centrifughe, le cappe di fumi, ecc. In alternativa, lavorare in una stanza fredda se è possibile accedere a sufficienti spazi e attrezzature per eseguire il protocollo.
    2. Usando le forbici, tagliare il tessuto delle foglie in pezzi di ~ 1 cm direttamente in un tubo da 50 ml contenente due macinature ceramichecilindri.
      NOTA: Pulire o cambiare le forbici tra i campioni per evitare contaminazioni incrociate.
    3. Se non vi è alcun omogeneizzatore di tessuti, utilizzare un mortaio e un pestello e seguire per sostituire i punti 2.2.4 - 2.2.9.
      1. Tagliare il tessuto foglia in un mortaio pre-raffreddato sul ghiaccio. Mescolare i campioni per 2 - 3 minuti in 15 ml di STE (nella cappa).
      2. Versare il tampone (lasciare il tessuto nella malta) attraverso un imbuto contenente uno strato di panno di filtrazione pre-bagnato e sterile (~ 22 a 25 μm di pori, vedere il protocollo principale per i dettagli) in un altro tubo da 50 ml . Aggiungere un ulteriore 10 mL di STE alla mortaia e pestello e nuovamente omogeneizzare.
      3. Versare il tessuto omogeneizzato e il tampone nello stesso imbuto. Sciacquare il mortaio e pestarli con 10 ml di STE e versarlo nell'imbuto. Strizzare e strizzare il panno di filtrazione nell'imbuto per recuperare il più liquido possibile.
        NOTA: Cambiare guanti tra i campioni per evitare contaminazioni incrociate. Continuare con il proTocol al punto 2.2.10.
    4. Aggiungere 20 ml di STE (nella cappa di fumo) ad ogni tubo da 50 ml.
    5. Posizionare i campioni in blocchi criogenici pre-refrigerati in un dispositivo di macinazione tessuto e macinare i campioni per 2 x 30 s a 1.750 giri / min. Ruotare le posizioni del campione e posizionare i campioni sul ghiaccio per circa 1 min tra le macine.
      NOTA: in questo passaggio può essere utilizzato un mortaio e un pestello, un frullatore o un altro dispositivo di macinazione / omogeneizzazione dei tessuti. Tuttavia, ogni metodo influirà sulla qualità risultante del DNA a gradi diversi e pertanto la lunghezza e la qualità del DNA devono essere valutati prima di continuare con le applicazioni a valle.
    6. Inserire un imbuto in un tubo pulito da 50 ml posto in ghiaccio. Posizionare uno strato di panno di filtrazione nell'imbuto e pre-bagnarlo con 5 ml di STE. Non scartare il flusso.
    7. Versare il tessuto omogeneizzato nell'imbuto. Sciacquare il tubo di macinazione con 15 ml di STE, raccogliere e invertire il tubo per sciacquare le pareti e il coperchio e versare nel funnEL.
    8. Rimuovere con cautela le pietre ceramiche e poi spremere e strizzare il panno di filtrazione nell'imbuto.
      NOTA: Cambiare guanti tra i campioni per evitare contaminazioni incrociate.
    9. Avvolgere i tappi del tubo con il parafilm per evitare lo spargimento. Centrifugare a 2000 xg per 10 min a 4 ºC.
    10. Aspirare con cautela il surnatante usando una pipetta serologica (evitare di disturbare il pellet) e collocarlo in un tubo centrifugo ad alta velocità da 50 ml (se i tubi non hanno guarnizioni di tenuta strette, avvolgere i tappi di tubo con parafilm per evitare lo spargimento). Scartare i pellet.
    11. Bilanciare i tubi fino a 0,1 g utilizzando STE e centrifugare il supernatante risultante per 20 minuti a 18,000 xg e 4 ºC. Per equilibrare i tubi, posizionare un piccolo bicchiere di ghiaccio sul bilanciere, tirare la bilancia e pesare i campioni sul ghiaccio per tenerli freddi. In alternativa, utilizzare un equilibrio e una cappa di fumo in una stanza fredda.
    12. Scartare il surnatante. Aggiungere 1 ml di ST alla pellicola e riposaldare delicatamenteUn pennello morbido. Aggiungere 24 ml di ST (volume finale di 25 ml) e mescolare / turbare ( cioè, premere il pennello sul lato del tubo per rimuovere tutto il liquido).
    13. Bilanciare i tubi fino a 0,1 g utilizzando ST. Centrifugare per 20 minuti a 18.000 xg e 4 ºC. Nel frattempo, preparate la soluzione DNaseI (vedere la Tabella 1 per le ricette di magazzino e di lavorazione). Per ogni campione, fare una aliquota da 200 μL in un tubo da 1,5 ml.
    14. Scartare il supernatante, sbucciare il tubo e riposizionare il pellet (ancora in un tubo centrifugo ad alta velocità) in 300 μL di ST utilizzando un pennello morbido. Posizionare il pennello nel tubo da 1,5 ml precedentemente preparato contenente 200 μL di soluzione DNaseI e avvolgere il pennello per rimuovere qualsiasi pellet residuo bloccato nella spazzola. Pipettare la soluzione DNaseI nel tubo centrifuga ad alta velocità e mescolare delicatamente per mescolare.
    15. Incubare a 37 ° C per 30 minuti in un bagno d'acqua (avvolgere il parafilm intorno alla parte superiore del tubo per evitare la formazione di condensaG nel cappuccio). Mescolare delicatamente scorrendo due volte durante l'incubazione.
    16. Pipettare delicatamente la miscela di pellet fuori dal tubo usando una punta pipetta con un ampio orifizio e collocarla in un tubo a bassa tenuta da 1,5 ml. Aggiungere 500 μl di 400 mM EDTA, pH 8,0, al tubo di centrifuga ad alta velocità e pipetta delicatamente per ottenere tutto il pellet residuo fuori dal tubo. Trasferire l'EDTA allo stesso tubo da 1,5 ml di bassa legatura come la miscela di pellet e mescolare delicatamente per inversione.
    17. Centrifugare a 18.000 xg per 20 minuti a 4 ºC. Scartare il supernatante, macchiare il tubo e utilizzare immediatamente per l'isolamento del DNA. Se necessario, congelare i pellet a -20 ºC, ma questo può comportare una riduzione del rendimento, in quanto il residuo DNaseI può degradare il DNA campione se non viene immediatamente elaborato.
  3. Estrazione del DNA da organelli isolati utilizzando un approccio basato sulla colonna commerciale
    NOTA: vedere il manuale del kit per il protocollo completo 25 e vedere di seguito le modifiche. PrÈ preferibile passare direttamente dall'isolamento organellare all'estrazione del DNA. Il congelamento e lo scongelamento ripetuti riducono le dimensioni del frammento del DNA e portano al degrado del DNA da DNaseI residuo. Limitare vortexing o pipettature vigorose, in quanto questo può tagliare il DNA. Si raccomanda l'uso di tubi di microcentrifuga a basso tenore per massimizzare il recupero del DNA.
    1. Procedura di estrazione del DNA
      NOTA: Leggere il protocollo commerciale dettagliato 25 prima di iniziare a garantire che i buffer siano correttamente realizzati / memorizzati e che le procedure di spin-colonna siano comprese.
      1. Aggiungere 180 μL di Tampone ATL direttamente nel tubo con il pellet (scongelato se precedentemente congelato e equilibrato a temperatura ambiente sul banco).
      2. Procedere con la fase 3 del protocollo "Purificazione dei tessuti del DNA" nel manuale del kit, con le seguenti modifiche: una lisi di 30 minuti nel passaggio 3 comprende la digestione opzionale di RNasi A e eluisce in 3 x 200 μL di AE ( Ciascuno in un seTubo del parato e quindi combinare le eluzioni).
      3. Salvare una aliquota (almeno 20 μL) per qPCR (vedere la fase 4.1). Per quantificare prima di concentrarsi, salvare un ulteriore 1 μL per la quantificazione ad alta sensibilità.
      4. Se si desidera, procedere con la concentrazione del campione.
  4. Concentrazione di campione con unità di filtraggio commerciale
    NOTA: per maggiori dettagli vedere il protocollo commerciale 26 . A seconda dell'uso a valle, potrebbe non essere necessario eseguire la concentrazione del campione ( ad esempio, per applicazioni PCR e qPCR a fine punto). Tuttavia, per la costruzione della libreria NGS, sarà probabilmente necessario concentrare il DNA diluito organellare ottenuto dopo l'estrazione del DNA.
    1. Procedura della colonna di concentrazione
      1. Pesare con precisione (vedi tabella 2 ) l'unità filtro vuota (senza tubo) su un pezzo pulito di carta di pesata su un bilanciamento analitico digitale. Registra il peso.
      2. PiPettinare le eluzioni combinate nell'unità filtrante e pesare nuovamente con attenzione.
        NOTA: Il manuale commerciale 26 afferma che il volume massimo del filtro è di 500 μL, ma può essere aggiunto fino a 575 μL all'unità contemporaneamente senza overflow.
      3. Posizionare con cautela l'unità filtrante riempita in un tubo (fornito con le colonne). Centrifugare a 500 xg per il tempo desiderato per ottenere il volume di concentrato richiesto. Per un volume di campione di ~ 575 μL, una spin di 20 minuti di solito provoca un volume di concentrato di 15 - 30 μL.
      4. Rimuovere l'unità filtrante dal tubo e pesare di nuovo. Utilizzare la tabella per determinare se il volume di concentrato desiderato è stato raggiunto. In caso contrario, centrifugare nuovamente a 500 xg per un tempo più breve e pesare di nuovo; Ripetere fino a raggiungere il volume concentrato desiderato.
      5. Inserire un nuovo tubo (fornito con le colonne) sopra la parte superiore dell'unità filtrante e invertire. Centrifugare per 3 minuti a 1.000 xg per trasferire il coCentrare il tubo.
      6. Determinare il volume recuperato. Questo sarà di solito ~ 3 - 5 μL di meno del volume calcolato, a causa della ritenzione del filtro. Se è troppo concentrato, diluire con acqua sterile o TE per ottenere il volume desiderato.
      7. Quantificare il DNA usando la quantificazione ad alta sensibilità (per istruzioni del produttore).

3. Metodo n ° 2: Metodo di frazionamento (MF) per arricchire il DNA organellare del DNA genomico totale

NOTA: Questo protocollo è stato modificato da un protocollo di estrazione del DNA Genomic Tip Kit sviluppato dall'utente per piante e funghi 27 e il protocollo commerciale del kit di arricchimento del DNA Microbiome 28 . In teoria, qualsiasi protocollo di isolamento del DNA che produce un DNA ad alto peso molecolare può essere utilizzato per il pulldown. Per la sequenza di brevi letture, qualsiasi estrazione che produce prevalentemente> frammenti di 15 kb è sufficiente per l'uso nel pulldown. Per loNg-read la sequenza, i frammenti più grandi possono essere desiderabili. Pertanto, abbiamo ottimizzato questo protocollo per ottenere DNA ad alto peso molecolare.

  1. Isolamento del DNA totale
    NOTA: Vedere l'elenco delle attrezzature e dei reagenti necessari e preparare i buffer e le scorte richieste per il metodo # 2 ( Tabella 1 ). Aggiungere gli enzimi di lysing allo stock di tampone di lisi per rendere la soluzione di lavoro del tampone di lisi. Accendere il termometro e impostarlo a 37 ° C. Accendere il bagno d'acqua a 50 ° C e collocare il tampone QF nel bagno. Mettere il 70% di EtOH nel congelatore e impostare la microcentrifuga a 4 ° C.
    1. Estrazione totale del DNA utilizzando colonne di estrazione del DNA commerciale
      NOTA: Prima di iniziare, leggere il manuale commerciale 29 per informazioni dettagliate sull'utilizzo delle colonne di scambio anionico a flusso di gravità. Le colonne possono essere impostate utilizzando un rack specializzato o posizionato sopra i tubi utilizzando gli anelli di plastica forniti. Tutti i passaggi, inclusi i gSi dovrebbe permettere di procedere con il flusso di gravità e il liquido residuo NON deve essere forzato.
      1. Mescolare 20 mg di tessuto congelato in azoto liquido in un tubo a basso rilascio di 2 mL utilizzando pestelli di macinazione a mano progettati per tubi da 2 ml.
      2. Aggiungere 2 ml di soluzione di lavoro per tampone di lisi (i tubi saranno molto pieni).
      3. Incubare in un termomexer a 37 ° C per 1 h con agitazione leggera a 300 giri / min. Se non è disponibile un termomixer, l'incubazione su un blocco termico e la miscelazione con una leggera scorrimento ogni 15 minuti è un'alternativa appropriata.
      4. Aggiungere 4 μL di RNasi A (100 mg / mL, concentrazione finale di 200 μg / mL). Inverti per mescolare e incubare in un termomixer per 30 minuti a 37 ° C, con agitazione leggera a 300 giri / min.
      5. Aggiungere 80 μl di proteinasi K (20 mg / ml, concentrazione finale di 0,8 mg / ml), invertire per mescolare e incubare in un termomexer per 2 ore a 50 ° C, con agitazione leggera a 300 giri / min.
      6. Centrifugare per 20 minuti a 4 ° C e 1 °5.000 xg per far pelliccare i detriti insolubili.
      7. Mentre i campioni vengono centrifugati, bilanciare le colonne con 1 mL di Tampone QBT e lasciare che la colonna si svuota dal flusso di gravità.
      8. Utilizzare una punta di pipetta largo per applicare tempestivamente il campione (evitare il pallone) alla colonna equilibrata e lasciarla passare completamente attraverso la colonna. Se il campione diventa nuvoloso, filtrare o centrifugare nuovamente prima dell'applicazione alla colonna (vedere il manuale commerciale per i dettagli 29 ).
      9. Una volta che il campione è entrato pienamente nella resina, lavare la colonna con 4 x 1 ml di Tampone QC.
      10. Sospendere la colonna sopra un tubo di microcentrifuga a bassa tenuta da 2 ml. Eluire il DNA genomico con 0,8 mL di Tampone QF preriscaldato a 50 ° C.
      11. Precipitare il DNA aggiungendo 0,56 mL (0,7 volumi di tampone di eluizione) di isopropanolo a temperatura ambiente al DNA eluito.
      12. Mescolare per inversione (10X) e centrifugare immediatamente per 20 minuti a 15.000 xg e 4 ° C. CuraRimuovere completamente il surnatante senza pregiudicare il pellet vetroso e leggermente attaccato.
      13. Lavare il pellet di DNA centrifugo con 1 ml di etanolo a freddo del 70%. Centrifugare per 10 minuti a 15.000 xg e 4 ° C.
      14. Rimuovere con cautela il surnatante (essere cauto anche con questo passaggio) senza disturbare il pellet. Asciugare in aria per 5-10 min e risospendere il DNA in 0,1 mL di tampone di eluizione (EB). Sciogliere il DNA per una notte a temperatura ambiente. Evitare di pipettare, che può tagliare il DNA.
      15. Quantificare i campioni usando un test di quantificazione del DNA ad alta sensibilità (per istruzioni del produttore).
  2. Frazionamento a base di branco di DNA metilato e non metilato
    NOTA: Una recente pubblicazione ha dimostrato l'uso di un kit 28 commercialmente disponibile che sfrutta un approccio a distanza che utilizza una proteina del dominio di legame di metil-legame FP-fusione fusione con il frammento Fc umano IgG (proteina MBD2-Fc)Hanno mangiato genomi organellari vegetali (nonmetilati) dal contenuto del genoma nucleare (altamente metilato) 23 . L'efficienza di frazionamento nei campioni di grano non è stata precedentemente testata utilizzando questo kit commerciale MF 28 .
    1. Cose da fare prima di iniziare
      1. Preparare di recente l'etanolo al 80% (almeno 800 μL per reazione). Impostare il tampone di legame / lavaggio 5x a scongelare sul ghiaccio e preparare 5 mL di tampone 1x per campione (diluire il tampone 5X con acqua sterile e priva di nucleasi e mantenerlo su ghiaccio durante il protocollo).
    2. Preparare MBD2-Fc perline magnetiche legate alla proteina
      1. Preparare il numero di set di branelli richiesti. Scale le reazioni per utilizzare tra 1 e 2 μg di DNA totale di input, richiedendo 160 - 320 μL di perline. Si noti che le reazioni elencate di seguito sono per 1 μg di DNA totale in ingresso, quindi richiedono 160 μL di perline. Scala le reazioni secondo le esigenze.
      2. Utilizzando punte larghe, pipettare delicatamente la Proteina A Magnetica BEad slurry su e giù per creare una sospensione omogenea. In alternativa, ruotare delicatamente il tubo di perline per 15 minuti a 4 ° C.
        NOTA: Non vortexare le perle.
      3. Procedere con le istruzioni per le istruzioni del produttore 28 .
    3. Cattura DNA nucleare metilato
      1. Per ogni campione individuale, aggiungere 1 μg di DNA in ingresso a un tubo contenente 160 μL di perline magnetiche MBD2-Fc.
      2. Aggiungere un tampone di legame / lavaggio da 5x a seconda del volume del campione di ingresso del DNA per una concentrazione finale di 1x (volume di legame di 5x / tampone di lavaggio per aggiungere (μL) = volume di DNA in ingresso (μL) / 4). Pipette il campione su e giù alcune volte per mescolare usando una punta pipetta largo-bore.
      3. Ruotare i tubi a temperatura ambiente per 15 min. Pipettate con delicatezza i campioni con una punta di pipetta largo e fate scorrere i campioni 2-3 volte per tutta l'incubazione per evitare che si blocchi il tallone.
        NOTA: la pipettazione e il flickiNg è fondamentale per garantire un pulldown efficiente del DNA metilato.
    4. Raccogli il DNA organellare arricchito e non metilato
      1. Girare brevemente il tubo contenente la miscela magnetica del tallone magnetico del DNA e MBD2-Fc. Mettere il tubo su un rack magnetico per almeno 5 min per raccogliere le perle sul lato del tubo. La soluzione dovrebbe apparire chiara.
      2. Utilizzando punte a forare larghe, rimuovete con attenzione il supernatante eliminato senza disturbare le perle. Trasferire il surnatante (contiene DNA non arricchito, organizzato), in un tubo di microcentrifuga a basso tenore di 2 mL. Conservare questo campione a -20 o -80 ° C, oppure procedere direttamente alla fase 3.2.6 per la purificazione.
    5. Elute ha catturato il DNA nucleare dalle perle magnetiche MBD2-Fc
      1. Se si desidera anche la frazione nucleare, seguire le istruzioni del produttore 28 per eluire il DNA nucleare dalle perle magnetiche legate a MBD2-Fc; Purificare come descritto nel passaggio 3.2.7.
    6. Purificazione di acido nucleico a base di branelli
      1. Assicurarsi che le perline di purificazione siano a temperatura ambiente e siano accuratamente mescolate. Procedere con il protocollo per le istruzioni contenute nel manuale del kit MF 28 .
        NOTA: il campione può ora essere utilizzato per la costruzione della libreria NGS o un'altra analisi a valle.

4. Quantificazione del campione e controllo della qualità

  1. QPCR per valutare l'arricchimento organellare
    NOTA: i parametri di reazione e parametri del test qPCR elencati qui sono stati progettati per essere utilizzati su un Roche LightCycler 480 e potrebbero essere necessari aggiustamenti per apparecchiature e reagenti diversi. Se qPCR non è disponibile, la PCR finale e la visualizzazione su un gel agarosio possono essere utilizzati come misura qualitativa della purezza del campione, utilizzando gli stessi primer e le condizioni qui descritte. Le dimensioni Amplicon saranno ~ 150 bp per tutti i set di primer. Vedere la Tabella 3 per il sequente primerE le accoppiamenti.
    1. Impostazione della reazione qPCR
      1. Per impostare una reazione individuale di 20 μL di qPCR, pipettare con attenzione quanto segue in un unico pozzetto di una piastra qPCR a 96 pozzetti: 10 μL di 2x SYBR Green I Master; 2 μl del mix di primer 10 μM in avanti e invertito (per una concentrazione finale di 0,5 μM); 2 μl di template (all'interno della gamma della curva standard); E 6 μl di H 2 O sterile senza nucleasi. Per ridurre gli errori di pipettazione, è preferibile effettuare un mix master con tutti i componenti di reazione eccetto il template. Aggiungere il master mix alla piastra qPCR e quindi aggiungere il modello di interesse a ciascun pozzetto. Tre repliche tecniche per ciascun campione devono essere eseguite per ridurre al minimo gli effetti dell'errore di pipettamento.
        NOTA: In ultima analisi, il rapporto tra cicli di quantificazione nucleare e organellare viene confrontato tra i campioni, per cui sono accettabili minime differenze di concentrazione. Tuttavia, le concentrazioni di DNA dovrebbero essere approssimativamente nell'ambito della eaCh altro.
      2. Sigillare la lastra con una pellicola di sigillatura qPCR di alta qualità. Vorticare delicatamente i campioni, facendo attenzione a evitare la creazione di bolle. Girare brevemente il piatto giù per 2 min a 4 ° C per raccogliere il campione e eliminare le piccole bolle.
      3. Caricare la piastra nella macchina. Eseguire il programma qPCR per le linee guida elencate di seguito.
    2. QPCR parametri di reazione
      NOTA: sono parametri predefiniti, ad eccezione del ciclo di ricottura della fase di amplificazione. Regolare questa impostazione per ospitare primer specifici se quelli utilizzati differiscono dai primer presentati in questo protocollo.
      1. Pre-incubare a 95 ° C per 5 min, con una velocità di rampa di 4,4 ° C / s.
      2. Eseguire 45 cicli di amplificazione di (1) 95 ° C per 10 s, con una velocità di rampa di 4,4 ° C / s; (2) 60 ° C per 20 s, con una velocità di rampa di 2,2 ° C / s; E (3) 72 ° C per 10 s, con una velocità di rampa di 4,4 ° C / s (dati acquisiti durante (3)).
      3. Usare un'opzioneIl ciclo della curva di fusione di 95 ° C per 5 s con una velocità di rampa di 4,4 ° C / s; 65 ° C per 1 min, con una velocità di rampa di 2,2 ° C / s; E 97 ° C, con modalità di acquisizione continua.
      4. Utilizzare un ciclo di raffreddamento di 40 ° C per 30 s, con una velocità di rampa di 1,5 ° C / s.
    3. Parametri di analisi
      1. Selezionare il modello SYBR. Controllare i parametri del programma nel pulsante Esperimento. Una volta caricata la lastra, il saggio può essere avviato e le impostazioni possono essere regolate mentre il saggio è in esecuzione.
      2. Assegnare i campioni utilizzando l'editor di esempio. Seleziona Abs Quant come flusso di lavoro e designi i campioni come sconosciuti, standard o controlli negativi. Designare replica e compilare i nomi di esempio del primo di ogni replica. Aggiungere concentrazioni e unità alle norme.
      3. Impostazione di sottogruppi per l'analisi; Questi vengono assegnati nell'editor di sottoinsieme.
      4. Per l'analisi, selezionare Abs Quant / 2nd Derivative Max dall'elenco "create new analysis".Importa la curva standard salvata esternamente (se applicabile) e quindi colpire il calcolo; Il report contiene le informazioni selezionate.
      5. Per eseguire una precisa quantificazione assoluta per la determinazione del numero di copie o della concentrazione, utilizzare una curva standard rappresentativa del campione in esame ( ad esempio, DNA organellare isolato dai metodi di cui sopra). Poiché la quantità di DNA mitocondriale richiesto per la preparazione di una curva standard è troppo elevata per essere raggiunta con una quantità ragionevole di tessuti, non utilizzare i calcoli del numero di copie forniti dal software, ma invece esaminare i valori di punto di attraversamento (Cp) per determinare l'arricchimento relativo Di organellare rispetto al DNA nucleare nei campioni. Confrontare questi valori relativi a quelli del DNA totale genomico (vedere i risultati rappresentativi ). Applicare efficienze del primer di test su cinque diluizioni 1:10 di DNA genomico totale da seminativi di grano di due settimane (le efficienze rappresentative riportate inE leggenda della Figura 2 ).
  2. Elettroforesi a gel pulsata (PFGE)
    NOTA: Questo protocollo si basa sulle linee guida del produttore per eseguire PFGE per risolvere il DNA ad alto peso molecolare. Vedere la tabella dei materiali.
    1. Preparazione del gel e dei campioni
      1. Seguire le linee guida per la preparazione del gel e del campione e adattarle al sistema disponibile.
    2. Eseguire i parametri
      1. Seguire le linee guida per l'impostazione del sistema di elettroforesi e utilizzare i seguenti parametri: tempo di commutazione iniziale di 2 s, intervallo finale di 13 s, durata di esercizio di 15 h e 16 min, V / cm di 6 e angolo incluso di 120 ° .
    3. Macchiare e immaginare il gel
      1. Macchiare il gel con un colorante di scelta ( ad esempio, bromuro di etidio o un'alternativa appropriata) e l'immagine con un idoneo sistema di documentazione del gel.
  3. NGS e analisi
    1. Utilizzare 1 ng di DNA come input per il kit DNA Prep Kit, secondo le istruzioni del produttore.
    2. Barcode e pool i campioni per sequenziare in una singola corsa. Eseguire la sequenza secondo le linee guida del produttore.
      NOTA: i parametri di raggruppamento e sequenza possono essere modificati a seconda della specie di interesse, del livello di copertura desiderato e della piattaforma utilizzata per sequire le librerie. Ad esempio, una corsia HiSeq ha una produzione sostanzialmente maggiore di una corsia MiSeq, in modo che molti altri campioni possono essere multipli. Sequenza di un sottogruppo più piccolo di campioni per determinare se i livelli di copertura dei genomi organellari sono adeguati per l'analisi a valle.
    3. Esaminare la qualità di lettura usando FastQC 31 per determinare l'estensione del taglio e del filtraggio richiesti per i dati.
    4. Tagliare e filtrare le letture raw utilizzando Trimmomatic 32 o un altro programma comparabile. Utilizzare le seguenti impostazioni: ILLUMINACLIP 2:30:10 (per rimuovere gli adattatori), LEADING 3, TRAILING 3, SLIDINGWINDOW 4:10 e MINLEN 100.
    5. Carteggiare le coppie di terminali (PE) con filtri qualitativamente filtrati e con adattatore (NC) alla cifra mitocondriale cinese (NCBI Sequenza di riferimento NC_007579.1 33 ), cloroplasti (NCBI Sequenza di riferimento NC_002762.1 34 ) e nuclei di riferimento nucleari 35 usando Bowtie2 36 , Con le seguenti impostazioni: -I 0 -X 800 - sensibile.
    6. Convertire i file di allineamento sam in formato bam (samtools) e ordinare i file bam. Utilizzare i file bam per calcolare la copertura genoma-wide e la copertura per-base con le utensili da letto. Visualizzare i risultati con la funzione R-plot.

Risultati

I protocolli presentati in questo manoscritto descrivono due metodi distinti per arricchire il DNA organellare dai tessuti vegetali. Le condizioni qui presentate riflettono l'ottimizzazione del tessuto di grano. Un confronto tra i passaggi chiave nei protocolli, l'input richiesto e l'output del DNA sono descritti in Figura 1 . Le fasi del protocollo DC che abbiamo testato seguono condizioni simili a quelle descritte in precedenza (

Discussione

Ad oggi, la maggior parte degli studi organizzativi di sequenziamento si concentra sui metodi DC tradizionali per arricchire il DNA specifico. Sono stati descritti metodi per isolare gli organelli da diverse piante, tra cui il muschio 40 ; Monocots come il grano 15 e l'avena 11 ; E dicoti come arabidopsis 11 , girasole 17 e colza 14 . La maggior parte dei protocolli si conce...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.

La menzione dei nomi commerciali o dei prodotti commerciali della presente pubblicazione è esclusivamente ai fini della fornitura di informazioni specifiche e non implica raccomandazione o approvazione da parte del Dipartimento dell'agricoltura USA. USDA è un fornitore di pari opportunità e datore di lavoro.

Riconoscimenti

Vorremmo riconoscere i finanziamenti del Dipartimento per l'Agricoltura-Agricoltura del Dipartimento degli Stati Uniti e della National Science Foundation (IOS 1025881 e IOS 1361554). Ringraziamo R. Caspers per la manutenzione delle serre e la cura delle piante. Ringraziamo anche l'Università del Minnesota Genomics Center, dove sono stati eseguiti i preparativi e la sequenza delle biblioteche Illumina. Siamo anche grati per i commenti dei redattori e dei quattro recensori anonimi che hanno ulteriormente rafforzato il nostro manoscritto. Ringraziamo anche l'OCSE per una borsa di studio alla SK per integrare questi protocolli per progetti di collaborazione con i colleghi in Giappone.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol; BME)Sigma AldrichM3148-100ml
2-propanol (Isopropyl alcohol/isopropanol), bioreagentSigma AldrichI9516
agarose, Bio-Rad Cetified Megabase agaroseBio-Rad1613108
analytical balanceMettler ToledoAB54-S
balanceMettler ToledoPB1502-S
bovine serum albumin (BSA)Sigma AldrichB4287-25G
Ceramic grinding cylinders, 3/8in x 7/8inSPEX SamplePrep2183
Cryogenic Blocks compatible with tissue homogenizer for holding 50 ml tubesSPEX SamplePrep2664
DNaseISigmaDN25
ethanol, absoluteDecon Laboratories2716
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), 0.5M Solution, pH8.0FisherBP2482-500
gel imaging system
gel stainSuch as GelRed or Ethidium Bromide
grinding pestle, wide tip for 2 ml conical tubes
Guanidine-HCl, 8M solutionThermoFisher24115
LightCycler 480 SYBR Green I MasterRoche4707516001
liquid nitrogen
Lysing enzymes from Trichoderma harzianumSigmaL1412
Magnesium ChlorideG Bioscience24115
magnetic rackThermoFisherA13346
microcentrifuge tubes, LoBind 1.5 ml Eppendorf22431021
microcentrifuge tubes, standard nuclease-free 1.5 mlEppendorf
microcentrifuge, refrigeratedSorvall Legend X1ROr equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotors for 50 ml tubes, Oak Ridge tubes, and 1.5 ml tubes
microcentrifuge, room temperatureEppendorf5424Or equivalent product, must be capable of reaching at least 18,000 x g with rotor for 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes
Microcon DNA Fast Flow Centrifugal Filter UnitsEMD MilliporeMRCFOR100
Miracloth, 1 square per sample cut to fit funnelEMD Millipore475855
NEBNext Microbiome DNA Enrichment KitNew England BiolabsE2612L
parafilmParafilm MPM992
plastic pots and trays
polyvinylpyrrolidone (PVP)FisherBP431-100
Proteinase KQiagen19131
Pulsed-Field Gel Electrophoresis rig (e.g. CHEF DR III)Bio-Rad1703697
purification beads, Agencourt AMpureXP beadsBeckman CoulterA63881
QIAamp DNA Mini KitQiagen51304
Qiagen 20/g Genomic Tip DNA Extraction KitQiagen10223
Qiagen Buffer EB (elution buffer)Qiagen19086
Qiagen DNA Extraction Buffer SetQiagen19060
QiaRackQiagen19015
qPCR machine (e.g. Roche Light Cycler 480)Roche
qPCR plate sealing filmRoche4729757001
qPCR plate, 96 well plateRoche4729692001
Qubit assay tubesLife TechnologiesQ32856
Qubit Broad Spectrum assay kitLife TechnologiesQ32850
Qubit High Sensitivity assay kitLife TechnologiesQ32851
RNaseAQiagen19101
Serological pipettes (20 ml) and pipet-aidFisher13-678-11
Small funnels, 1 per sample
Sodium ChlorideAmbionAM9759
Soft paintbrush, 2 per sample
SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder or another type of tissue homogenizerSPEX SamplePrepOr another comparable tissue homogenizer. If you do not have access to a tissue homogenizer, then grinding in a pre-chilled mortar and pestle will suffice (see protocol for details). However, a homogenizer will give more consistent results and total homogenization time is reduced.
SucroseOmnipure8550
TBE
thermomixer
TrisSigmaT2819-100ml
Triton X-100PromegaH5142
tube rotater
tubes, 50 mL conical polypropyleneCorning352070
tubes, 50 ml high-speed polypropylene ThermoScientific/Nalgene3119-0050e.g. Nalgene Oakridge tubes or equivalent
vermiculite
water bath
water, sterile and certified Nuclease-free Fisher1481
water, sterile milliQ

Riferimenti

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