تحليل المناعي من الإجهاد الحبيبية تشكيل بعد تحدي البكتيريا من خلايا الثدييات

Summary

نحن تصف طريقة للتحليل النوعي والكمي لتشكيل الحبيبة الإجهاد في خلايا الثدييات بعد تحدي الخلايا مع البكتيريا وعدد من الضغوط المختلفة. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول للتحقيق في الاستجابة الحبيبية الإجهاد الحبيبية في مجموعة واسعة من التفاعلات المضيف البكتيرية.

Abstract

التصوير الفلورسنت من المكونات الخلوية هو أداة فعالة للتحقيق التفاعلات المضيف الممرض. يمكن أن تؤثر العوامل المسببة للأمراض على العديد من الخصائص المختلفة للخلايا المصابة، بما في ذلك بنية الخلايا العضوية، وتنظيم الشبكة الخلوية الهيكلية، فضلا عن العمليات الخلوية مثل تشكيل الإجهاد الحبيبي (سغ). توصيف كيفية مسببات الأمراض تخريب العمليات المضيف هو جزء مهم ومتكامل من مجال التسبب. في حين أن المظاهر المتغيرة قد تكون مرئية بسهولة، والتحليل الدقيق للاختلافات النوعية والكمية في الهياكل الخلوية الناجمة عن التحدي الممرض ضروري لتحديد الاختلافات ذات دلالة إحصائية بين العينات التجريبية والسيطرة. تشكيل سغ هو استجابة الإجهاد الحفاظ على التطور الذي يؤدي إلى ردود الفعل المضادة للفيروسات، وقد تم التحقيق منذ فترة طويلة باستخدام العدوى الفيروسية ¹ . كما يؤثر تشكيل سغ على شلالات التشوير وقد يكون له تأثير آخر غير معروف² . إن توصيف هذه الاستجابة للإجهاد لمسببات الأمراض الأخرى غير الفيروسات، مثل مسببات الأمراض البكتيرية، يعد حاليا مجالا ناشئا للبحوث ³ . في الوقت الراهن، لم يتم بعد استخدام التحليل الكمي والنوعي لتشكيل سغ بشكل روتيني، حتى في النظم الفيروسية. نحن هنا وصف طريقة بسيطة لإحداث وتوصيف تكوين سغ في الخلايا غير المصابة وفي الخلايا المصابة مع الممرض البكتيري عصاري خلوي، مما يؤثر على تشكيل سغس ردا على الضغوط الخارجية المختلفة. ويتحقق تحليل تشكيل سغ وتكوينها باستخدام عدد من علامات سغ مختلفة وكاشف بقعة المكونات في من إيسي، أداة تحليل صورة مفتوحة المصدر.

Introduction

تصور التفاعلات الممرض المضيف على مستوى الخلوية هو وسيلة قوية للحصول على رؤى في الاستراتيجيات المسببة للأمراض وتحديد مسارات الخلوية الرئيسية. في الواقع، يمكن استخدام مسببات الأمراض كأدوات لتحديد الأهداف الخلوية الهامة أو الهياكل، كما تطورت مسببات الأمراض لتخريب العمليات الخلوية المركزية كاستراتيجية لبقائهم أو نشرهم. التصور من المكونات الخلوية لا يمكن أن يتحقق من خلال إعادة التعبير عن كومبوتانتلي فلورزنتلي الموسومة المضيف البروتينات. في حين أن هذا يسمح للتحليل في الوقت الحقيقي، وتوليد خطوط الخلايا مع البروتينات المضيف الموسومة على وجه التحديد هو شاقة للغاية وقد يؤدي إلى آثار جانبية غير مرغوب فيها. أكثر ملاءمة هو الكشف عن العوامل الخلوية باستخدام أجسام مضادة محددة، لأن العوامل المضيفة متعددة يمكن تحليلها في وقت واحد واحد لا يقتصر على نوع معين من الخلايا. العيب هو أنه يمكن التقاط فقط عرض ثابت كما تحليل المناعي يستلزم الخلية المضيفة فيكاتأيون. ومع ذلك، فإن ميزة هامة للتصوير المناعي هو أنه يفسح المجال بسهولة لكلا التحليل النوعي والكمي. وهذا بدوره يمكن أن تستخدم للحصول على فروق ذات دلالة إحصائية لتوفير رؤى جديدة في التفاعلات الممرض المضيف.

برامج تحليل الصور الفلورية هي أدوات تحليلية قوية لأداء تحليل 3D و 4 D. ومع ذلك، فإن ارتفاع تكلفة البرمجيات وصيانة لها جعل الأساليب على أساس البرمجيات الحرة مفتوحة المصدر أكثر جاذبية على نطاق واسع. تحليل الصور بعناية باستخدام برنامج التحليل الحيوي هو قيمة كما أنه يدعم التحليل البصري، وعند تعيين دلالات إحصائية، يزيد من الثقة في صحة النمط الظاهري معين. في السابق، تم تحليل سغس باستخدام برنامج إيماجيج مجانا، الأمر الذي يتطلب تحديد اليدوي من سغس الفردية ⁴ . هنا نحن نقدم بروتوكول لتحريض وتحليل تشكيل سغ الخلوية في سياق باكالالتهابات الشريانية باستخدام الحرة المصدر المفتوح برنامج تحليل الصور الحيوية إيسي (http://icy.bioimageanalysis.org). برنامج تحليل الصور الحيوية لديه برنامج الكشف عن بقعة المدمج الذي هو مناسبة للغاية لتحليل سغ. فإنه يسمح لصقل عملية الكشف الآلي في مناطق محددة من الفائدة (روي). وهذا يتغلب على الحاجة إلى التحليل اليدوي لفرادى لجان الدراسات ويزيل التحيز في أخذ العينات.

العديد من الضغوط البيئية تحفز تشكيل سغس، والتي هي مرحلة عصاري خلوي كثيفة، والهياكل غير غشائية من 0.2 - 5 ميكرون في القطر ^{5 ، 6} . يتم الحفاظ على هذه الاستجابة الخلوية بشكل تطوري في الخميرة والنباتات والثدييات ويحدث عندما يتم تثبيط ترجمة البروتين العالمية. أنه ينطوي على تجميع مجمعات بدء الترجمة المتوقفة في سغس، والتي تعتبر أماكن عقد ل مرناس ترانزلاتيونالي-إناكتيف، مما يتيح الترجمة الانتقائية لمجموعة فرعية من مرناس الخلوية.عند إزالة الإجهاد، سغس تذوب والأسعار العالمية لاستئصال البروتين استئناف. وتتكون سغس من عوامل بدء استطالة الترجمة والبروتينات المشاركة في استقلاب الحمض النووي الريبي، والبروتينات ملزمة رنا، وكذلك البروتينات السقالات والعوامل التي تشارك في إشارة الخلية المضيفة ² ، على الرغم من أن التكوين الدقيق يمكن أن تختلف اعتمادا على الإجهاد المطبق. العوامل البيئية التي تحفز تشكيل سغ تشمل الجوع الحمضي الأميني، الأشعة فوق البنفسجية التشعيع، صدمة الحرارة، صدمة تناضحي، التوتر الشبكة إندوبلازميك، نقص الأكسجة والعدوى الفيروسية ^{2 ، 7 ، 8} . وقد تم إحراز تقدم كبير في فهم كيفية تحريض الفيروسات وتهريب أيضا تشكيل سغ، في حين لا يزال قليلا لا يزال يعرف عن كيفية مسببات الأمراض الأخرى، مثل مسببات الأمراض البكتيرية، الفطرية أو بروتوزوان، تؤثر على هذه الاستجابة الإجهاد الخلوي ^{1 ، 7} .

شيجيلا فليكسنيري هو سلبي غرام سلبية الممرض خلوي خلوي للبشر والعامل المسبب للإسهال الشديد أو شيجيلوسيس. ويشكل الشيغلوسيس عبئا رئيسيا على الصحة العامة ويؤدي إلى وفاة 000 28 طفل سنويا دون سن الخامسة من العمر ^{9 سنوات} . S. فليكسنيري يصيب ظهارة القولون وينتشر خلية إلى خلية عن طريق اختراق مكونات الهيكل الخلوي المضيف ^{11 ، 12} . العدوى من ظهارة يدعم تكرار S. فليكسنيري داخل السيتوسول ولكن الضامة المصابة يموت من خلال عملية موت الخلايا الالتهابية يسمى بايروبتوسيس. العدوى يؤدي إلى تجنيد واسعة من العدلات والالتهاب الحاد الذي يرافقه الحرارة والإجهاد التأكسدي وتدمير الأنسجة. وهكذا، في حين أن الخلايا المصابة عرضة للضغوط الداخلية الناجمة عن العدوى، مثل اضطراب جولجي، والإجهاد السامة للخلايا وإعادة ترتيب الهيكل الخلويs، والخلايا المصابة تتعرض أيضا للضغوط البيئية بسبب العملية الالتهابية.

توصيف تأثير العدوى S. فليكسنيري على قدرة الخلايا على الاستجابة للضغوط البيئية باستخدام عدد من علامات سغ أثبتت أن العدوى يؤدي إلى الاختلافات النوعية والكمية في تكوين سغ ³ . ومع ذلك، لا يعرف سوى القليل عن مسببات الأمراض البكتيرية الأخرى. نحن هنا وصف منهجية للعدوى من الخلايا المضيفة مع الممرض عصاري خلوي S. فليكسنيري ، وتشديد الخلايا مع الضغوط البيئية المختلفة، ووضع العلامات من مكونات سغ، والتحليل النوعي والكمي لتشكيل سغ وتكوينها في سياق المصابين والخلايا غير المصابة. هذا الأسلوب ينطبق على نطاق واسع لمسببات الأمراض البكتيرية الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام تحليل الصورة لتشكيل سغ للعدوى عن طريق الفيروسات أو مسببات الأمراض الأخرى. ويمكن استخدامه لتحليل سغتشكيل على العدوى أو تأثير العدوى على تشكيل سغ ردا على الضغوط الخارجية.

Protocol

1. إعداد البكتيريا والخلايا المضيفة

1. نقل 12 أو 14 ملم غطاء الزجاج زلات في أي لوحات 24- أو 12 جيدا، على التوالي، مع ملاقط معقمة، عد بئر واحد في حالة تجريبية. تعقيم هذه عن طريق العلاج بالأشعة فوق البنفسجية في هود ثقافة الأنسجة لمدة 15 دقيقة.
   ملاحظة: تشمل آبار التحكم للتحدي البكتيري ولتحريض سغ عن طريق الضغوط الخارجية.
2. للحصول على لوحة 24 جيدا مع كوفرسليبس 12 مم، البذور 1 × 10 ⁵ خلايا الثدييات (على سبيل المثال، خلايا هيلا) على كوفرسليبس. اضغط كوفرسليبس أسفل مع طرف ماصة العقيمة. السماح الخلايا تلتزم بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 5٪ كو ₂ حاضنة زراعة الأنسجة في وسط الثقافة المناسبة لكل نوع من الخلايا.
   ملاحظة: خلايا لوحة بحيث التقاء الخلايا بين 40-60٪ في اليوم التالي.
   1. لخلايا هيلا، احتضان في دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دمم) مع الأحماض الأمينية غير الأساسية (نيا) و 10٪ مصل الجنين تفكيك (فس).ديكومبليمنت فس عن طريق التدفئة لمدة 30 دقيقة في حمام مائي 56 درجة مئوية، ودوامة المصل مرة واحدة بعد 15 دقيقة.
3. لانتشار البكتيريا، واستخدام طرف ماصة معقمة لإزالة كمية صغيرة من الأسهم الجلسرين البكتيرية (20٪ الجلسرين) المخزنة في الفريزر -80 درجة مئوية ووضعه على لوحة المسمى. استخدام حلقة معقمة لنشر البكتيريا أكثر من حوالي 10٪ من لوحة. استخدام حلقة معقمة جديدة وسحبه من خلال تشويه لجعل 3 خطوط متوازية، نصف لوحة طويلة. انتصارات من خلال هذه الخطوط التي تغطي بقية لوحة. احتضان لوحة O / N عند 37 درجة مئوية.
   1. حدد مستعمرة بكتيرية واحدة (على سبيل المثال، S. فليكسنيري ) من لوحة شاردة خارج الطازجة. تجنب العمل مع المستعمرات البكتيرية أقدم من 1 أسبوع.
   2. ل S. فليكسنيري سلالة M90T، تطعيم مستعمرة حمراء من طازج من تريبتيك الصويا أجار 0.1٪ الكونغو لوحة أجار الأحمر إلى 8 مل من مرق الصويا تريبتيك في أنبوب 15 مل. تشديد الغطاء واحتضان تهتز في 222 دورة في الدقيقة O / N في 306؛ C.
      تنبيه: لا تستخدم مستعمرات بيضاء كبيرة لأنها فقدت البلازميد الفوعة وغير المعدية.

2. تحدي البكتيريا من الخلايا المضيفة

1. إعداد البكتيريا لتعظيم إمكانية العدوى.
   1. ل S. فليكسنيري ، البكتيريا الفرعية عن طريق إضافة 150 ميكرولتر O / N الثقافة إلى 8 مل تريبتيك الصويا أجار واحتضان تهتز 222 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية إلى مرحلة الأسية المتأخرة (~ 2 ساعة) للحث على الفوعة التعبير الجيني وتعزيز العدوى.
      1. عندما تكون الثقافة في كثافة بصرية بين 0.6 و 0.9 (تقاس في 600 نانومتر)، ونقل 1 مل من الثقافة في أنبوب 1.5 مل. بيليه البكتيريا لمدة 2 دقيقة في 8000 زغ و ريسوسبيند في المتوسطة العدوى (دمم مع نيا، تفتقر فس) في أود ₆₀₀ = 1. وهكذا، إذا كان أود ₆₀₀ هو 0.85، ريسوسبيند في 850 ميكرولتر.
         ملاحظة: ل S. فليكسنيري، في أود ₆₀₀ = 1، سيكون هناك 8 × 10 ⁸ البكتيريا في مل عندمامثقف في 8 مل المتوسطة. عدوى العدوى (موي) من 20 هو المناسب. بالنسبة لمسببات الأمراض الأخرى، عدد البكتيريا لكل مل في أود ₆₀₀ و وزارة الداخلية المناسبة تحتاج إلى تحديد تجريبيا.
   2. لتعزيز التفاعلات البكتيرية المضيف، والبكتيريا معطف مع بولي L- يسين (بل).
      ملاحظة: بل علاج S. فليكسنيري كان له أي تأثير على ديناميات سغ. وهناك مسببات الأمراض الأخرى تحتاج إلى تقييم مدى قابليتها للعلاج بل.
      1. لبكتيريا معطف مع بل، أجهزة الطرد المركزي 1 مل من ثقافة البكتيرية لمدة 2 دقيقة في 8000 x ج ثم ريسوسبيند بيليه في 10 ميكروغرام / مل بل في الفوسفات مخزنة المالحة (بس) في أود ₆₀₀ = 1.
      2. إضافة الحل البكتيرية إلى طبق صغير، مثل جيدا داخل لوحة 12 جيدا، واحتضان في رت (~ 20 درجة مئوية) لمدة 10 دقيقة مع التحريض لطيف على شاكر لوحة.
      3. بيليه البكتيريا لمدة 2 دقيقة في 8000 x ج، إزالة بل زائد. ريسوسبيند بيليه في برنامج تلفزيوني 1 مل لد تكرار هذه الخطوة الغسيل مرتين. بعد غسل النهائي، ريسوسبيند في وسط العدوى في أود ₆₀₀ = 1.
         ملاحظة: هنا، وسط العدوى ل S. فليكسنيري هو وسط الخلية المضيفة مع 20 ملي هيبيس ث / س فس.
2. إعداد الخلايا للتحدي البكتيري.
   1. إزالة المتوسطة من خلايا هيلا الثدييات باستخدام مضخة الشفط. إضافة 500 ميكرولتر رت هيلا خلية المتوسطة لغسل الخلايا ودوامة، وإزالة المتوسطة باستخدام مضخة شفط، واستبدالها مع 500 ميكرولتر رت المتوسطة المتوسطة المناسب (على سبيل المثال ، وسط الخلية المضيفة مع 20 ملي هيبيس ث / س فس).
   2. ملاحظة: لجميع خطوات الغسيل، والعمل بسرعة ومعالجة ما يصل إلى 4 كوفرسليبس في وقت واحد لتجنب تجفيف من الخلايا.
3. تحدي أعدت خلايا هيلا مع البكتيريا لتصيب 20 - 50٪ من الخلايا.
   ملاحظة: الوقت المناسب ووزارة الداخلية تحتاج إلى تحديد لكل الأنواع البكتيرية. عموما، بداية جيدة هي 30 دقيقة في 37° C مع وزارة الداخلية من 10.
   1. ل S. فليكسنيري، تحدي خلايا الخلايا هيلا باستخدام إحدى الطريقتين (الخطوة 2.3.1.1 أو 2.3.1.2).
      1. تدور البكتيريا المعالجة غير بل (20 ميكرولتر من أود ₆₀₀ = 1 / جيدا من 24 لوحة جيدا في 500 ميكرولتر المتوسطة) على الخلايا لمدة 10 دقيقة في 13000 x ز.
      2. إضافة البكتيريا المغلفة بل (15 ميكرولتر من أود ₆₀₀ = 1 / جيدا من لوحة 24 جيدا في 500 ميكرولتر المتوسطة) لمدة 15 دقيقة في رت للسماح للبكتيريا لتسوية على الخلايا.
   2. السماح للعدوى تحدث عن طريق وضع الخلايا مع البكتيريا استقر في 37 درجة مئوية الأنسجة حاضنة ثقافة لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: لنقاط زمنية قصيرة، مزامنة العدوى S. فليكسنيري عن طريق وضع لوحات في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة بدلا من في حاضنة ثقافة الأنسجة.
4. وقف العدوى عن طريق غسل الخلايا.
   1. لغسل الخلايا وإزالة البكتيريا الزائدة، وإزالة المتوسطة باستخدام مضخة الشفط، إضافة 1 ملبريوارمد الطازجة (37 درجة مئوية) ثقافة ثقافة هيلا (دمم، 10٪ فس، نيا). دوامة المتوسطة، وإزالة واستبدال مع المتوسطة الطازجة. كرر مرتين وترك المتوسطة الطازجة على الخلايا.
      1. ل S. فليكسنيري ، أو غيرها من البكتيريا داخل الخلايا، بعد العدوى من خلايا هيلا والغسيل، واستبدال المتوسطة مع معيار مستنبت الأنسجة المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين لقتل البكتيريا خارج الخلية ومنع مزيد من الغزو الخلية.
         ملاحظة: لا تضيف المضادات الحيوية في الوسط للبكتيريا خارج الخلية.
5. احتضان البكتيريا مع الخلايا للحصول على المبلغ المطلوب من الوقت في حاضنة زراعة الأنسجة.
   ملاحظة: ل S. فليكسنيري ، قد تكون العدوى ما دام 6 ساعات اعتمادا على نوع الخلية. لخلايا هيلا، والسماح العدوى المضي قدما لمدة 1.5-2 ساعة قبل إضافة الضغوط الخارجية للحث على تشكيل سغ. ل كاكو-2 الالتهابات، التي الشيغيلا ينتشر خلية إلى خلية، تصيب لمدة 30 دقيقة إلى 6 ساعات قبل إضافة التوتر الخارجي. مقد تكون ثابتة لس في هذه المرحلة دون إضافة الضغوط الخارجية لتقييم تشكيل سغس نتيجة العدوى البكتيرية (في هذه الحالة، انتقل إلى القسم 4).

3. تحريض الإجهاد الحبيبية تشكيل من قبل إضافة الإجهاد الخارجية

1. إزالة المتوسطة من خلايا هيلا المصابة وغير المصابة باستخدام مضخة شفط، واستبدال المتوسطة مع 500 ميكرولتر من الوسط المناسب مع أو بدون الإجهاد واحتضان.
   ملاحظة: تشمل الظروف المحفزة للضغط ما يلي (انظر أدناه). لمزيد من العلاجات انظر كيديرشا وآخرون . ^13-
   1. لعلاج صدمة الحرارة، واستخدام المتوسطة العادية التي تحتوي على 20 ملي هيبيس ووضع لوحة في 44 درجة مئوية حمام الماء لمدة 30 دقيقة.
   2. ل كلوتريمازول (يدفع الإجهاد الميتوكوندريا) العلاج، واستخدام المتوسطة العادية دون فس مع 20 ميكرومتر كلوتريمازول واحتضان في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 1 ساعة.
      ملاحظة: تخزين أليكوتس واحد الاستخدام من 20 مM كلوتريمازول الأسهم في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (دمسو) في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 4 أشهر. استخدام سيارة دمسو لخلايا السيطرة.
   3. لالزرنيت (يدفع الإجهاد التأكسدي) العلاج، واستخدام المتوسطة العادية مع 0.5 ميكرومتر الزرنيخ واحتضان في زراعة الأنسجة حاضنة لمدة 1 ساعة.
      ملاحظة: تخزين أليكوتس ذات الاستخدام الواحد من 0.5 ملم الأسهم زرنيخ في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
      تنبيه: كلوتريمازول والأرسنيت ضارة وخطرة على البيئة ويجب التخلص منها بشكل مناسب.
   4. ل ديس-ميثيل ديس الأمينية (دمدا) العلاج -Pateamine (يمنع بدء ترجمة حقيقيات النواة)، واستخدام المتوسطة العادية مع 50-200 نانومتر دمدا-باتيامين واحتضان في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 1 ساعة.
      ملاحظة: تخزين دمدا-باتيامين في -80 درجة مئوية. تخزين الكواشف كما أليكوتس صغيرة لتجنب تجميد الذوبان.

4. تثبيت و المناعي تحليل الإجهاد الحبيبية تشكيل

ملاحظة: معالجة عنصر التحكم وكوفرسليبس التجريبية في نفس الوقت لتجنب تلطيخ الاختلافات التي قد تؤثر على تحليل الصور في الخطوات اللاحقة. وتشمل عينات السيطرة أي عدوى مع وبدون سغ العلاج المحفز، وعينات مصابة مع وبدون سغ تحفيز العلاج.

1. إزالة المتوسطة تماما باستخدام مضخة شفط وإصلاح العينات عن طريق إضافة 0.5 مل رت 4٪ بارافورمالدهيد (بفا) في برنامج تلفزيوني. احتضان لمدة 30 دقيقة في رت.
   تنبیھ: بفا یضر بالمعالج والبیئة. اتخاذ التدابير المناسبة لحماية المعالج والتخلص من النفايات الكيميائية.
   ملاحظة: بدلا من ذلك، إصلاح لمدة 15 دقيقة ثم استبدال مع -20 درجة مئوية الميثانول بريشيلد لمدة 10 دقيقة للاحتفاظ توطين أكثر سيتوبلازمية من علامات سغ ¹³ .
2. إزالة بفا مع ماصة والتخلص من السائل في حاوية النفايات المناسبة. غسل ساترة مع 1 مل تريس مخزنة المالحة (تبس: 25 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.3، 15 ملي كلوريد الصوديوم). احتضان ساترة لمدة 2 دقيقة مع اهتزاز لطيفعن، أداة تعريف إنجليزية غير معروفة، تصفيح، شاكر، إبان، واشينغ.
3. إزالة تبس تماما باستخدام مضخة شفط وإضافة 500 ميكرولتر 0.3٪ تريتون-X100 في تبس لمدة 10 دقيقة ل بيرمابيليز الخلايا.
4. إزالة حل بيرمابيليزينغ مع مضخة الشفط. استبدال مع 1 مل تبس، دوامة لوحة بلطف، وإزالة تبس عن طريق الشفط، وإضافة حل 1 مل حجب (5٪ فس في تبس) لمدة 1 ساعة في رت.
5. إعداد حل الأجسام المضادة الأولية (1: 300 التخفيف) في 5٪ فس في تبس. حساب 50 ميكرولتر لكل ساترة 12 ملم وجعل ما يكفي لجميع كوفرسليبس في دفعة واحدة.
   ملاحظة: الأجسام المضادة الأولية المشتركة التي يتم استخدامها الهدف G3BP1، eIF3b، و TIA1.
6. بقعة 50 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة الأولية على فيلم البارافين البلاستيك (بارافيلم) مسجلة بقوة على مقاعد البدلاء أو غرفة.
   ملاحظة: توجد قائمة بمؤشرات سغ الأساسية في جدول المواد ، غير أن تكوين لجان الدراسات قد يعتمد على الإجهاد المطبق. علامات سغ أخرى مدرجة في كيديرشا وآخرون. ¹³ وترد النتائج المتوقعة لعدد من علامات سغ للعدوى S. فليكسنيري في الجدول 1 .
7. التقاط ساترة مع ملاقط، داب حافة ساترة على الأنسجة، وإطلاق سراح لفترة وجيزة ملاقط لإزالة السائل الزائد، ووضع بلطف وجهه لأسفل على قطرة. احتضان كوفرسليبس لمدة 1.5 ساعة في رت أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في غرفة رطبة.
   ملاحظة: لإعداد غرفة رطبة، مكان الأنسجة بريويتد على طول حواف غرفة مغلقة بإحكام واصطف مع بارافيلم البلاستيك.
8. نقل كل ساترة مع ملاقط في بئر من لوحة جديدة 24 جيدا مليئة تبس 1 مل. احتضان مع هز لطيف على لوحة شاكر لمدة 5 دقائق. شفط قبالة تبس في كل بئر باستخدام مضخة شفط، واستبدال مع تبس 1 مل والعودة مرة أخرى على شاكر لوحة لمدة 5 دقائق. كرر غسل مرة أخرى.
   ملاحظة: إعادة استخدام بارافيلم عن طريق إزالة السائل الزائد مع الأنسجة وغسل السطح بالماء. ضمان فيلم البارافين جافة تماما قبل أوسينg ذلك لخطوة تلطيخ لاحقة.
9. إعداد حل الأجسام المضادة الثانوية في تبس (التخفيف 1: 500 - 1: 2،000). لصمة نواة والبكتيريا، إضافة 2 ميكروغرام / مل دابي إلى المزيج. لصمة أكتين، إضافة الفلويدين الفلورسنت. ماصة 50 ميكرولتر مزيج الأجسام المضادة الثانوية على فيلم البارافين البلاستيك.
   ملاحظة: ينصح باستخدام عالية النقاء عبر امتصاص الأجسام المضادة حمار الثانوية للدراسات المشاركة في توطين علامات سغ مختلفة عندما يتم استخدام G3BP1 (الأجسام المضادة الماعز). اختيار فلورزنتلي المسمى الأجسام المضادة الثانوية مع أطياف غير متداخلة. eIF3b بوضوح البقع السيتوبلازم الخلايا، وبالتالي هو علامة جيدة لتحديد الخلايا. يساعد اللطخة أكتين كذلك على تحديد الخلايا في مواقع الاتصال من خلية إلى خلية ومناطق دخول البكتيريا.
10. التقاط ساترة مع ملاقط، داب حافة ساترة على الأنسجة، والإفراج لفترة وجيزة ملاقط، لإزالة السائل الزائد. وضع بلطف ساترة الوجه لأسفل على قطرة واحتضان كوفرسليبسفي الظلام لمدة 1 ساعة في رت.
11. استخدام ملاقط لوضع ساترة مرة أخرى إلى لوحات 24 جيدا مليئة الطازجة 1 مل بس. ضمان ساترة مغطاة بالكامل من قبل برنامج تلفزيوني. غسل الخلايا 3X مع هز لطيف لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    ملاحظة: الحفاظ على لوحة خلال غسل تحت غطاء لحماية من الضوء كما فلوروفوريس من الأجسام المضادة الثانوية حساسة للضوء.
12. تراجع لفترة وجيزة ساترة في الماء منزوع الأيونات لإزالة الملح، داب الجافة من الحافة على الأنسجة وجبل ساترة على 5 ميكرولتر من مضان تصاعد المتوسطة على شريحة زجاجية. ختم ساترة قبل التصوير باستخدام طلاء الأظافر. إبقاء الشرائح في 4 درجات مئوية لمدة قصيرة (أسبوع) أو في -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل (الشهر).
    ملاحظة: تجنب فقاعات الهواء عند الختم لأن هذا سوف يضر جودة الصورة.

5. التصوير مضان

ملاحظة: الرجوع إلى دليل المستخدم من المجهر لتحسين الإعداد.

1. الحصول على الصور باستخدام المجهر مبائر باستخدام إما 40 أو 63X عدسة الغمر النفط. حدد قنوات الفلورسنت المطلوبة للحصول على الصور. عند استخدام قنوات الفلورسنت متعددة، حدد وضع الاستحواذ متتابعة.
   ملاحظة: تبدأ مع العينات التجريبية حيث سغس تم تحريض أقوى لتجنب التعرض المفرط على عينات لاحقة. تأكد من عدم وجود سغس تعريض طوال العمق بأكمله من الخلية.
   1. تعيين حجم بت 12 أو أعلى داخل إعدادات المجهر لضمان دقة تحليل الصورة.
   2. تعيين مداخن الصورة لتغطية عمق الخلية بأكملها. تحقق في قنوات مختلفة وعلامات سغ مختلفة لضمان أن يتم تضمين مجموعة كاملة. تعيين بداية المكدس في قاعدة الخلايا وأعلى من الأكوام في الارتفاع في الجزء العلوي من الخلايا التي لا لوحظ المزيد من علامات سغ.
   3. الحصول على كومة. الحفاظ على ارتفاع كومة نفسه لجميع الصور.
      ملاحظة: لاتغيير إعدادات اكتساب بين السيطرة والعينات التجريبية التي سوف تستخدم للمقارنة اللاحقة.

6. تحليل الصورة

ملاحظة: هنا، يتم وصف تحليل سغ على مداخن انهار باستخدام إيسي مجانية. ويمكن أيضا أن يتم تحليل الصورة من إعادة البناء 3D باستخدام البرمجيات المتخصصة الأخرى. ويمكن إجراء كشف سغ عن طريق سير عمل مؤتمت بالكامل أنشئ لهذا البروتوكول (متاح على الموقع http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/Stress_granule_detection_in_fluorescence_imaging). لاستخدام هذا البروتوكول، تحتاج نوى لتكون ملطخة وصمة عار الحمض النووي للبرنامج للعثور على مركز كل خلية، والحواف الخلية تحتاج إلى أن تكون علامة إما علامة السيتوبلازمية (مثل eIF3b) أو وصمة عار أكتين للبرنامج لتحديد حدود الخلية. ويمكن استخدام سير العمل التلقائي للتحقق من صحة النتائج المشتقة يدويا أو مباشرة للتحليل عندما يتم الكشف عن حدود الخلية مع الثقة العالية، والتي سوف موتعتمد بشدة على كثافة الخلايا وعلامة تستخدم للكشف عن حدود الخلية.

1. استخدام إيماجيج أو فيجي، وانهيار مداخن الصورة (صورة> مداخن> Z الإسقاط)، وحفظ كملفات .tiff.
   ملاحظة: إنشاء مجلد جديد لكل صورة لأن برنامج تحليل الصور سوف يربط نتائجها إلى موقع الصورة الأصلية.
2. تحميل عنصر تحكم وصورة تجريبية .tiff إلى منصة تحليل الصور (ملف> فتح). انتقل إلى نافذة تسلسل. مرر لأسفل في "جدول البحث" إلى معلمات القناة.
3. يمكنك إلغاء تنشيط جميع القنوات من خلال النقر على مربع الاختيار لجميع علامات تبويب القناة. انقر على القناة 0 ثم حدد اللون المفضل من خلال النقر على شريط الألوان أعلاه. زيادة كثافة القناة حسب الحاجة لرؤية جميع الهياكل عن طريق النقر وتحريك خط في مجال كثافة. كرر ذلك لجميع القنوات.
   ملاحظة: إلغاء تنشيط القنوات غير المطلوبة لمهمة معينة لتقليل التحيز في تحليل العينة.
4. التمريرضمن علامة التبويب كانفاس، يمكنك التكبير إلى حوالي 10 خلايا لكل حقل عن طريق ضبط علامة التبويب التكبير / التصغير.
5. استخدم أدوات وظيفة المضلع (في الشريط العلوي) لتعيين حدود الخلايا للخلايا في الصورة. استخدام وصمة عار أكتين أو علامة عصاري خلوي للحدود الخلية ترسيم (على سبيل المثال eIF3b).
   1. انقر على وظيفة المضلع ضمن أدوات "فيل & روي". بدء ترسيم من خلال النقر على الخلية ومن ثم تمديد خط عن طريق جعل المراسي من خلال النقر المتكرر حول حدود الخلية. لإنهاء عائد الاستثمار، انقر مرة أخرى على وظيفة المضلع ضمن أدوات "فيل & روي".
      ملاحظة: تحديد الفئات الفرعية من الخلايا المرسومة التي هي مصابة. تتكون العينة من مزيج من الخلايا المصابة وغير المصابة. لتحديد البكتيريا، إما استخدام وصمة عار دابي أو البكتيريا الفلورية (مثل غفب معربا عن البكتيريا). زيادة كثافة لضمان أن ينظر إلى جميع البكتيريا.
   2. لتسمية عائد استثمار، انتقل إلى نافذة عائد الاستثمار على اليمين و كليسك على الخلية التي تهم الصورة. سيؤدي ذلك إلى تسليط الضوء على عائد الاستثمار المقابل في علامة التبويب عائد الاستثمار. انقر نقرا مزدوجا على اسم عائد الاستثمار وتعديل الاسم (على سبيل المثال الخلية المصابة رقم 1).
      ملاحظة: إذا كانت صورة واحدة لاستخدامها لتحليل كل من الخلايا المصابة وغير المصابة، فمن الأسهل لحفظ الصورة في مجلدين منفصلين وتعيين الخلايا المصابة وغير المصابة بشكل منفصل، وتوليد اثنين من جداول البيانات المختلفة، مما سيسهل التحليل في وقت لاحق.
6. فتح التطبيق كاشف بقعة ضمن "كشف وتتبع" علامة التبويب (الشريط العلوي). ضمن علامة التبويب الإدخال، سيتم تحديد الصورة الحالية. لا تغير أي شيء. ضمن علامة التبويب المعالجة المسبقة، حدد القناة المراد تحليلها.
   ملاحظة: قناة واحدة فقط يمكن تحليلها في أي وقت معين. ويمكن اختيار تحليل دفعة هنا إذا كان واحد يستخدم تسلسل التحليل الآلي بالكامل المعلمات التي تم فحصها لإعطاء نتائج مرضية.
   1. ضمن علامة التبويب الكاشف، اختار "ديالبقع المضيئة على خلفية مظلمة "، ثم حدد المقياس المناسب والحساسية، قم بذلك من خلال اختبار إعدادات مختلفة والتحقق من الكشف عن البقع في كل من عنصر التحكم والعينات التجريبية.
      ملاحظة: بالنسبة للصورة ذات 2،048 × 2،048 قرار وحجم بكسل 0.12 ميكرون ² ، عتبة المستوى 2 مع حساسية من 25 إلى 100 هي مناسبة عموما ولكن كل علامة سغ لابد من اختبار تجريبيا. إعداد الكشف عن بقعة بحيث في عينة السيطرة غير المعالجة، لا يتم الكشف عن البقع، بينما في العينة التجريبية مع سغس، يتم احتساب كل سغس الصغيرة والكبيرة.
   2. ضمن علامة التبويب عائد الاستثمار، حدد عائد الاستثمار المقترح من التسلسل. ضمن علامة التبويب تصفية، حدد لا تصفية. في علامة التبويب إخراج، اختر الإخراج المناسب.
      ملاحظة: اختيار تمكين ملف معين هو مفيد لحفظ ظروف الكشف مختلفة أو قنوات مختلفة. اختيار لتصدير الصورة الثنائية والصورة الأصلية مع روي واكتشاف هيلبوفول لتحليل مراقبة الجودة.
   3. حدد "إزالة النقاط السابقة التي تم عرضها كعائد استثمار". اختر المجلد لحفظ الملف من خلال النقر على الزر "لا يوجد ملف محدد". ضمن علامة التبويب عرض، حدد الخيارات المطلوبة.انقر على "بدء الكشف".
      ملاحظة: سيتم إنشاء مجلد مع الاسم والموقع المختار الذي يحتوي على خيارات التصوير التي تم تصديرها. سيتم استبدال هذه الصور لكل حالة جديدة تم اختبارها. للحفاظ على الصور، إما إعادة تسمية المجلد بحيث سيتم إنشاء مجلد جديد أو نقل الصور من مجلد حفظ إلى مجلد جديد. لمراقبة الجودة من الصور، فمن المفيد لتحديد علامة الكشف عن العرض، وعدد من الكشف عن عائد الاستثمار ورقم روي والاسم.
7. قم بتوحيد وحفظ البيانات الخاصة بالمعلمات المختلفة باستخدام جدول البيانات الذي تم إنشاؤه لكل صورة أو حالة تم اختبارها.
   ملاحظة: تشمل المعلمات التي يتعين تحليلها عدد سغس لكل عائد استثمار، والمناطق السطحية سغ، و سغ ماكسإيموم، المتوسط ​​والدنيا.
8. نقل البيانات وتحليلها باستخدام برنامج تحليل قادر على تحليل الرسوم البيانية وتحديد الدلالة الإحصائية.

النتائج

لشرح وإثبات البروتوكول الموصوفة في هذه المخطوطة، وصفنا صورة سغس كلوتريمازول الناجم عن خلايا هيلا المصابة أم لا مع الممرض عصاري خلوي S. فليكسنيري . يتم عرض مخطط من هذا الإجراء في الشكل 1 ، ويشمل الفوعة ومضطربة S. فليكسنيري شدد...

Discussion

بروتوكول موجزة هنا يصف تحريض، توطين، وتحليل سغس في الخلايا غير المصابة والخلايا المصابة مع الممرض عصاري خلوي S. فليكسنيري في وجود أو عدم وجود إجهاد خارجي. باستخدام برامج التصوير مجانا، والبروتوكولات يسمح للتحليل النوعي والكمي الدقيق لتشكيل سغ لتحديد وإحصائيا م...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary Antibodies
eIF3b (N20), origin goat	Santa Cruz	sc-16377	Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1 in 300
eIF3b (A20), origin goat	Santa Cruz	sc-16378	Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1 in 300
eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal)	Cell Signaling	3411	Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1 in 800
eIF4AI, origin goat	Santa Cruz	sc-14211	Recommended by (Ref # 13). Dilution 1 in 200
eIF4B, origin rabbit	Abcam	ab186856	Good stress granule marker in our hands. Dilution 1 in 300
eIF4B, origin rabbit	Cell Signaling	3592	Recommended by Ref # 13. Dilution 1 in 100
eIF4G, origin rabbit	Santa Cruz	sc-11373	Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1 in 300
G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal)	BD Biosciences	611126	Widely used SG marker. Dilution 1 in 300
Tia-1, origin goat	Santa Cruz	sc-1751	Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1 in 300
Alexa-conjugated Secondary Antibodies
A488 anti-goat , origin donkey	Thermo Fisher	A-11055	Cross absorbed. Dilution 1 in 500
A568 anti-goat, origin donkey	Thermo Fisher	A-11057	Cross absorbed. Dilution 1 in 500
A488 anti-mouse, origin donkey	Thermo Fisher	A-21202	Dilution 1 in 500
A568 anti-mouse, origin donkey	Thermo Fisher	A10037	Dilution 1 in 500
A647 anti-mouse, origin donkey	Thermo Fisher	A31571	Dilution 1 in 500
A488 anti-rabbit, origin donkey	Thermo Fisher	A-21206	Dilution 1 in 500
A568 anti-rabbit, origin donkey	Thermo Fisher	A10042	Dilution 1 in 500
Other Reagents
Shigella flexneri			Available from various laboratories by request
Tryptone Casein Soya (TCS) broth	BD Biosciences	211825	Standard growth medium for Shigella, application - bacterial growth
TCS agar	BD Biosciences	236950	Standard growth agar for Shigella, application - bacterial growth
Congo red	SERVA Electrophoresis GmbH	27215.01	Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application - bacterial growth
Poly L lysine	Sigma-Aldrich	P1274	Useful to coating bacteria to increase infection, application - infection
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397	Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application - infection
HEPES	Life Technologies	15630-056	PH buffer useful when cells are incubated at room-temperature, application - cell culture
DMEM	Life Technologies	31885	Standard culture medium for HeLa cells, application - cell culture
Fetal calf serum	Biowest	S1810-100	5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application - cell culture
Non-essential amino acids	Life Technologies	11140	1/100 dilution used for HeLa cell culture medium, application - cell culture
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650	Reagent diluent, application - cell culture
Sodium arsenite	Sigma-Aldrich	S7400	Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application - stress inducer
Clotrimazole	Sigma-Aldrich	C6019	Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application - stress inducer
PFA	Electron Microscopy Scences	15714	4% PFA is used for standard fixation of cells, application - fixation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application - permeabilization
A647-phalloidin	Thermo Fisher	A22287	Dilution is at 1/40, best added during 2ary antibody staining, application - staining
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application - staining
Parafilm	Sigma-Aldrich	BR701501	Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application - staining
Prolong Gold	Thermo Fisher	36930	Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application - mounting
Mowiol	Sigma-Aldrich	81381	Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting
24-well cell culture plate	Sigma-Aldrich	CLS3527	Standard tissue culture plates, application - cell culture
12-mm glass coverslips	NeuVitro	1001/12	Cell culture support for immunofluorescent applications, application - cell support
forceps	Sigma-Aldrich	81381	Cheap and obust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting
Programs and Equipment
Prism	GraphPad Software		Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application - data analysis
Leica SP5	Leica Microsystems		Confocal microsope, application - image acquisition
Imaris	Bitplane		Professional image analysis program, application - data analysis
Excel	Microsoft		Data analysis and graphing program, application - data analysis