Analisi dell'immunofluorescenza della formazione di granuli di stress dopo la sfida batterica delle cellule dei mammiferi

Riepilogo

Descriviamo un metodo per l'analisi qualitativa e quantitativa della formazione di granuli di stress nelle cellule dei mammiferi dopo che le cellule sono sfidate con batteri e una serie di sollecitazioni diverse. Questo protocollo può essere applicato per indagare la risposta del granulo di stress cellulare in una vasta gamma di interazioni ospedaliere-batteriche.

Abstract

L'imaging fluorescente dei componenti cellulari è uno strumento efficace per indagare le interazioni host-patogeno. I patogeni possono influenzare molteplici caratteristiche delle cellule infette, tra cui l'organologia ultrastruttiva, l'organizzazione della rete citoscheletrica, nonché i processi cellulari come la formazione di Stress Granule (SG). La caratterizzazione di come i patogeni subiscono i processi dell'host è una parte importante e integrale del campo della patogenesi. Mentre i fenotipi variabili possono essere facilmente visibili, l'analisi precisa delle differenze qualitative e quantitative nelle strutture cellulari indotte dalla sfida patogena è essenziale per definire differenze statisticamente significative tra i campioni sperimentali e quelli di controllo. La formazione di SG è una risposta a stress evolutivamente conservata che conduce alle risposte antivirali e è stata da tempo studiata usando infezioni virali ¹ . La formazione di SG influenza anche le cascate di segnalazione e possono avere altri conseq ancora sconosciuti² . La caratterizzazione di questa risposta allo stress a patogeni diversi dai virus, come gli agenti patogeni batterici, è attualmente un'area emergente di ricerca ³ . Per ora, l'analisi quantitativa e qualitativa della formazione SG non è ancora abitualmente usata, anche nei sistemi virali. Qui descriviamo un metodo semplice per indurre e caratterizzare la formazione di SG in cellule non infettate e in cellule infettate da un patogeno batterico citosolico, che influenza la formazione di SG in risposta a varie sollecitazioni esogene. L'analisi della formazione e della composizione SG è ottenuta utilizzando un certo numero di differenti marcatori SG e il plug-in del rilevatore spot di ICY, uno strumento di analisi delle immagini open source.

Introduzione

Visualizzare le interazioni host-patogeni a livello cellulare è un metodo potente per ottenere approfondimenti sulle strategie patogene e per identificare i principali percorsi cellulari. Infatti, gli agenti patogeni possono essere utilizzati come strumenti per individuare importanti bersagli o strutture cellulari, in quanto gli agenti patogeni si sono evoluti per subire i processi cellulari centrali come una strategia per la loro sopravvivenza o la loro propagazione. La visualizzazione dei componenti cellulari può essere ottenuta mediante espressione recombinante di proteine ​​ad oscillazioni fluorescenti. Mentre questo consente l'analisi in tempo reale, la generazione di linee cellulari con proteine ​​ad hoc specifiche tagliate è altamente laboriosa e può causare effetti indesiderati indesiderati. Più conveniente è la rilevazione di fattori cellulari che utilizzano anticorpi specifici, in quanto possono essere analizzati simultaneamente più fattori host e non si limitano ad un particolare tipo di cellula. Un inconveniente è che solo una visione statica può essere catturata in quanto l'analisi dell'immunofluorescenza richiede il fixat delle cellule hostionico. Tuttavia, un importante vantaggio dell'immagine di immunofluorescenza è che si presta facilmente ad analisi qualitative e quantitative. Questo a sua volta può essere utilizzato per ottenere differenze statisticamente significative per fornire nuove conoscenze sulle interazioni host-patogeno.

I programmi di analisi fluorescenti delle immagini sono potenti strumenti analitici per eseguire analisi 3D e 4D. Tuttavia, l'elevato costo del software e la sua manutenzione fanno dei metodi basati sul libero software open source più ampiamente attraenti. L'analisi approfondita dell'immagine usando il software di bioanalisi è preziosa in quanto dimostra l'analisi visiva e, quando assegna significati statistici, aumenta la fiducia nella correttezza di un determinato fenotipo. In precedenza, gli SG sono stati analizzati utilizzando il software gratuito ImageJ, che richiede l'identificazione manuale dei singoli SG4. Qui forniamo un protocollo per l'induzione e l'analisi della formazione cellulare SG nel contesto di bacLe infezioni da virus utilizzando il software gratuito di analisi bio-immagine open source ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). Il software per l'analisi bio-image è dotato di un programma di rivelatore spot che è adatto per l'analisi SG. Consente di ottimizzare il processo di rilevamento automatico in specifiche aree di interesse (ROI). Ciò supera la necessità di analisi manuale dei singoli SG e rimuove la bias di campionamento.

Molte sollecitazioni ambientali inducono la formazione di SG, che sono strutture fisiologiche citocholiciche, non membranose di 0,2-5 μm di diametro ^{5 , 6} . Questa risposta cellulare è evolutamente conservata in lieviti, piante e mammiferi e si verifica quando la traduzione globale delle proteine ​​è inibita. Comprende l'aggregazione di complessi di iniziazione di traduzione bloccati in SG, considerati come luoghi di detenzione per mRNA traslazionale-inattivi, consentendo la traduzione selettiva di un sottoinsieme di mRNA cellulari.Dopo la rimozione dello stress, SG si dissolvono e il tasso globale di sintesi proteica riprende. Gli SG sono composti da fattori di innesco di allungamento della traduzione, proteine ​​coinvolte nel metabolismo RNA, proteine ​​legate all'RNA, nonché proteine ​​di ponteggio e fattori coinvolti nella segnalazione delle cellule ospite ² , anche se la composizione esatta può variare a seconda dello stress applicato. I fattori ambientali che inducono la formazione di SG includono la fame di aminoacidi, irraggiamento UV, shock termico, shock osmotico, stress reticolare endoplasmatico, ipossia e infezione virale ^{2 , 7 , 8} . Molti progressi sono stati fatti per comprendere come i virus inducano e sovvertire la formazione di SG, mentre poco si sa ancora su come altri agenti patogeni, quali batteri, funghi o patogeni protozoi, influenzino questa risposta cellulare ^{1 , 7} .

ShigeLla flexneri è un patogeno citosolico facoltativo Gram-negativo di esseri umani e l'agente causale di grave diarrea o shigellosis. La Shigellosis è un grave onere della sanità pubblica e porta a 28.000 morti ogni anno nei bambini di età inferiore ai 5 anni ^{9 , 10 anni} . S. flexneri infetta l'epitelio colonico e si diffonde da cellula a cellula perrottando i componenti citoscheletrici dell'host ^{11 , 12} . L'infezione dell'epitelio supporta la replica di S. flexneri all'interno del citosolo, ma i macrofagi infetti muoiono attraverso un processo di morte delle cellule infiammatorie chiamato pyroptosis. L'infezione porta ad un massiccio reclutamento di neutrofili e infiammazioni gravi che sono accompagnate da calore, stress ossidativo e distruzione dei tessuti. Pertanto, mentre le cellule infette sono soggette a sollecitazioni interne indotte dall'infezione, come la disfunzione di Golgi, lo stress genotossico e il riarrangiamento citoscheletricoLe cellule infette sono sottoposte anche a stress ambientali dovuti al processo infiammatorio.

La caratterizzazione dell'effetto dell'infezione di S. flexneri sulla capacità delle cellule di rispondere alle sollecitazioni ambientali con un numero di marcatori SG ha dimostrato che l'infezione porta a differenze qualitative e quantitative nella composizione SG ³ . Tuttavia, poco si sa di altri patogeni batterici. Qui descriviamo una metodologia per l'infezione di cellule ospitanti con il patogeno citosolico S. flexneri , l'accentuazione delle cellule con differenti sollecitazioni ambientali, l'etichettatura dei componenti SG e l'analisi qualitativa e quantitativa della formazione e della composizione SG nel contesto di infetti E le cellule non infette. Questo metodo è ampiamente applicabile ad altri patogeni batterici. Inoltre, l'analisi delle immagini della formazione SG può essere utilizzata per infezioni da virus o da altri agenti patogeni. Può essere utilizzato per analizzare SGFormazione sull'infezione o sull'effetto dell'infezione sulla formazione di SG in risposta a sollecitazioni esogene.

Protocollo

1. Preparazione dei batteri e delle cellule ospitanti

1. Trasferimento di coperture in vetro da 12 o 14 mm, rispettivamente, in lastre da 24 o 12 pozzetti, con pinze sterili, contando un pozzetto per condizione sperimentale. Sterilizzare questi con trattamento UV in un cofano di tessuto per 15 minuti.
   NOTA: includere i pozzetti di controllo per la sfida batterica e per l'induzione di SG da sollecitazioni esogene.
2. Per una piastra a 24 pozzetti con copertine da 12 mm, sementi da 1 x 10 ⁵ cellule di mammiferi ( ad es., Cellule HeLa) sui coperchi; Premere i coperchietti con una punta pipetta sterile. Lasciare che le cellule si aderiscano per una notte a 37 ° C in un incubatore di coltura di tessuto di CO _{2 del} 5% in terreno di coltura adatto a ciascun tipo di cellula.
   NOTA: Celle di piastre in modo che la confluenza delle cellule sia tra il 40 e il 60% il giorno successivo.
   1. Per le cellule HeLa, incubare in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con Amino Acidi Non Essenziali (NEAA) e 10% di Vitamina Fetale Vitellata (FCS).Decomplementare FCS riscaldandosi per 30 minuti in un bagno d'acqua di 56 ° C, swirling il siero una volta dopo 15 min.
3. Per estrarre i batteri, utilizzare una punta sterile per pipettare per rimuovere una piccola quantità da un glicerolo batterico (20% di glicerolo) immagazzinato in un congelatore -80 ° C e metterlo su una piastra etichettata. Utilizzare un ciclo sterile per diffondere i batteri in circa il 10% della piastra. Utilizzare un nuovo ciclo sterile e trascinarlo attraverso la striscia per fare 3 linee parallele, mezzo piatto lungo. Striate attraverso queste linee che coprono il resto della piastra. Incubare la piastra O / N a 37 ° C.
   1. Selezionare una singola colonia batterica ( ad esempio, S. flexneri ) dalla piastra appena striata. Evitare di lavorare con colonie batteriche superiori a 1 settimana.
   2. Per il ceppo S. flexneri M90T, inoculare una colonia rossa da una piastra rossa agarica Tryptic Soy Agar-0,1% Congo rosso in 8 ml di brodo Tryptic Soy in un tubo da 15 ml; Stringere il coperchio e incubare agitazione a 222 giri / min6; C.
      ATTENZIONE: non utilizzare grandi colonie bianche perché hanno perso il plasmide di virulenza e non sono infettive.

2. Sfida batterica delle cellule ospitanti

1. Preparare batteri per massimizzare il potenziale di infezione.
   1. Per S. flexneri , batteri di subcultura aggiungendo 150 μl di coltura O / N a 8 mL di Tryptic Soy Agar e incubare agitando 222 giri / min a 37 ° C fino alla fase tardiva esponenziale (~ 2 h) per indurre espressione genica virulenza e aumentare l'infezione.
      1. Quando la coltura è a densità ottica compresa tra 0,6 e 0,9 (misurata a 600 nm), trasferire 1 ml di coltura in un tubo da 1,5 ml. Pellet batteri per 2 min a 8000 xg e risospendere in mezzo infezione (DMEM con NEAA, privo di FCS) a OD ₆₀₀ = 1. Quindi, se l'OD ₆₀₀ è 0,85, risospendere in 850 μL.
         NOTA: Per S. flexneri, a OD ₆₀₀ = 1, saranno 8 x 10 ⁸ batteri per ml quandoColtivata in mezzo di 8 mL. Una molteplicità di infezione (MOI) di 20 è appropriata. Per altri agenti patogeni è necessario determinare empiricamente il numero di batteri per ml ad un OD ₆₀₀ e l'opportuno MOI.
   2. Per migliorare le interazioni batteri-host, coprire i batteri con Poly-L-Lysine (PLL).
      NOTA: Il trattamento PLL di S. flexneri non ha avuto alcun effetto sulla dinamica SG. Altri agenti patogeni devono essere valutati per la loro amenabilità al trattamento PLL.
      1. Per coprire i batteri con PLL, centrifugare 1 ml di coltura batterica per 2 minuti a 8000 xg e quindi risospendere il pellet in 10 μg / mL PLL in salina fosfata-bufferizzata (PBS) ad un OD ₆₀₀ = 1.
      2. Aggiungere la soluzione batterica ad un piccolo piatto, come un pozzetto all'interno di una piastra a 12 pozzetti, e incubare a RT (~ 20 ° C) per 10 minuti con agitazione leggera su un agitatore a piastre.
      3. Pellet batteri per 2 minuti a 8.000 xg, rimuovere l'eccesso PLL. Resuspendere il pellet in 1 ml di PBSD ripetere due volte questo passaggio di lavaggio. Dopo il lavaggio finale, risospendere nel mezzo di infezione a OD ₆₀₀ = 1.
         NOTA: qui, il mezzo di infezione per S. flexneri è un mezzo di cellule host con 20 mM di HEPES senza FCS.
2. Preparare le cellule per la sfida batterica.
   1. Rimuovere il mezzo dalle cellule HeLa da mammiferi usando una pompa di aspirazione. Aggiungere 500 μL di cellule RT HeLa per lavare le cellule, turbinare, rimuovere il mezzo usando una pompa di aspirazione e sostituire con 500 μl di RT appropriato mezzo di infezione ( ad esempio , mezzo di cellule host con 20 mM HEPES senza FCS).
   2. NOTA: Per tutti i passaggi di lavaggio, lavorare in modo rapido e lavorare fino a 4 coperchi per volta per evitare l'essiccazione delle celle.
3. Challenge ha preparato le cellule HeLa con batteri per infettare il 20-50% delle cellule.
   NOTA: Per ogni specie batterica è necessario determinare il tempo e il MOI appropriati. In generale, un buon inizio è 30 minuti a 37° C con un MOI di 10.
   1. Per S. flexneri, sfida le cellule di cellule HeLa usando uno dei due metodi (punto 2.3.1.1 o 2.3.1.2).
      1. Spin non trattati con PLL trattati con batteri (20 μL di OD ₆₀₀ = 1 / pozzetto di 24 pozzetti in 500 micron di mezzo) sulle cellule per 10 minuti a 13000 x g.
      2. Aggiungere batteri rivestiti con PLL (15 μL di OD ₆₀₀ = 1 / pozzetto di una piastra a 24 pozzetti in 500 μl di mezzo) per 15 minuti a RT per consentire ai batteri di saltare sulle cellule.
   2. Lasciare che l'infezione si verifichi collocando le cellule con batteri regolati in un incubatore di coltura tissutale a 37 ° C per 30 min.
      NOTA: Per i tempi brevi, sincronizzare l'infezione da S. flexneri , posizionando le piastre in un bagno d'acqua di 37 ° C per 15 minuti anziché nell'incubatrice di coltura tissutale.
4. Interrompere l'infezione da celle di lavaggio.
   1. Per lavare le cellule e rimuovere batteri in eccesso, rimuovere il mezzo usando una pompa di aspirazione, aggiungere 1 mlCampione di coltura HeLa preriscaldato (37 ° C) fresco (DMEM, 10% FCS, NEAA). Girare il mezzo, rimuovere e sostituire con il mezzo fresco. Ripetere due volte e lasciare il mezzo fresco sulle cellule.
      1. Per S. flexneri o altri batteri intracellulari, dopo l'infezione di cellule HeLa e le lavaggi, sostituire il mezzo con un campione di coltura tissutale standard contenente gentamicina da 50 μg / mL per uccidere i batteri extracellulari e prevenire ulteriori invasioni di cellule.
         NOTA: Non aggiungere antibiotici nel mezzo per i batteri extracellulari.
5. Incubare i batteri con le cellule per la quantità desiderata di tempo in un incubatore di coltura tissutale.
   NOTA: Per S. flexneri , l'infezione può durare fino a 6 h a seconda del tipo di cellula. Per le cellule HeLa, lasciare che l'infezione proceda per 1,5 - 2 ore prima di aggiungere stress esogeni per indurre la formazione SG. Per le infezioni Caco-2, in cui Shigella si diffonde da cellule a cellule, infetta per 30 minuti a 6 ore prima di aggiungere lo stress esogeno. CePossono essere fissate a questo punto senza aggiungere sollecitazioni esogene per valutare la formazione di SG come conseguenza dell'infezione batterica (in questo caso procedere alla sezione 4).

3. Indurre la formazione di granuli di stress mediante l'aggiunta di stress esogeni

1. Rimuovere il mezzo dalle cellule HeLa infette e non infette usando una pompa di aspirazione, sostituire il mezzo con 500 μl di mezzo appropriato con o senza stressore e incubare.
   NOTA: Le condizioni che inducono stress includono le seguenti (vedi sotto). Per ulteriori trattamenti vedi Kedersha et al . ¹³ .
   1. Per il trattamento con shock termico, usare un mezzo regolare contenente 20 mM HEPES e posizionare la piastra in bagno d'acqua a 44 ° C per 30 min.
   2. Per il trattamento con clotrimazolo (indotta da stress mitocondriale), utilizzare un mezzo regolare senza FCS con 20 μM di clotrimazolo e incubare in un incubatore di coltura per 1 h.
      NOTA: Conservare aliquote monouso di 20 mM clotrimazolo in dimetilsolfossido (DMSO) a -20 ° C per un massimo di 4 mesi. Utilizzare il veicolo DMSO per le celle di controllo.
   3. Per l'arsenite (induce stress ossidativo), utilizzare un mezzo regolare con arsenito 0,5 μM e incubare in incubatore di coltura tissutale per 1 h.
      NOTA: Conservare le aliquote monouso di 0,5 mM di arsenite a -20 ° C per un massimo di 6 mesi.
      ATTENZIONE: Clotrimazolo e arsenito sono dannosi e pericolosi per l'ambiente e devono essere smaltiti in modo appropriato.
   4. Per il trattamento con Desamethyl Des-Amino (DMDA) -patilamina (inibisce l'iniziazione della traduzione eucariotica), utilizzare un mezzo regolare con 50-200 nM di DMDA-pateamine e incubare in incubatore di coltura tissutale per 1 h.
      NOTA: Conservare DMA-pateamine a -80 ° C. Conservare i reagenti come piccole aliquote per evitare lo scioglimento congelato.

4. Analisi della fissazione e immunofluorescenza della formazione di granuli di stress

NOTA: elaborare il controllo eLe copertine sperimentali contemporaneamente per evitare che le differenze di colorazione possano influenzare l'analisi delle immagini nei passaggi successivi. I campioni di controllo non includono infezioni con e senza trattamento indottante SG e campioni infetti con o senza trattamento indotto da SG.

1. Rimuovere completamente il mezzo utilizzando una pompa di aspirazione e fissare i campioni aggiungendo 0.5 ml di RT 4% di paraformaldeide (PFA) in PBS. Incubare per 30 minuti a RT.
   ATTENZIONE: PFA è dannoso per il gestore e per l'ambiente. Prendere misure adeguate per proteggere il manipolatore e smaltire con i rifiuti chimici.
   NOTA: In alternativa, fissare per 15 minuti e poi sostituire con metanolo prechillato -20 ° C per 10 minuti per mantenere la localizzazione più citoplasmatica dei marcatori SG13.
2. Rimuovere il PFA con una pipetta e smaltire il liquido in un apposito contenitore di rifiuti. Lavare la copertura con 1 ml di Tris-Buffered Saline (TBS: 25 mM Tris, pH 7,3, 15 mM NaCl). Incubare il coperchio per 2 minuti con una leggera scossaSu un agitatore a piastra durante il lavaggio.
3. Rimuovere completamente TBS utilizzando una pompa di aspirazione e aggiungere 500 μl di 0,3% di Triton-X100 in TBS per 10 minuti per permeabilizzare le cellule.
4. Rimuovere la soluzione permeabilizzante con una pompa di aspirazione. Sostituire con 1 mL di TBS, ruotare leggermente la piastra, rimuovere TBS per aspirazione e aggiungere 1 mL di soluzione bloccante (5% FCS in TBS) per 1 h a RT.
5. Preparare la soluzione anticorpale primaria (1: 300 diluizione) nel 5% FCS in TBS. Calcolare 50 μL per coperchio da 12 mm e fare abbastanza per tutti i coperchi in un unico pezzo.
   NOTA: Gli anticorpi primari comuni utilizzati sono i target G3BP1, eIF3b e TIA1.
6. Posizionare 50 μL di miscela anticorpale primaria su un film paraffina di plastica (parafilm) saldamente fissato sulla panca o sulla camera.
   NOTA: Un elenco di marcatori canonici SG è fornito nella tabella dei materiali , ma la composizione degli SG può dipendere dalla tensione applicata. Altri marcatori SG sono elencati in Kedersha et al. ¹³ I risultati attesi per un certo numero di marcatori SG per l'infezione S. flexneri sono elencati nella Tabella 1 .
7. Sollevare la copertura con le pinzette, applicare il bordo del coperchio sul tessuto, rilasciando brevemente le pinzette per rimuovere il liquido in eccesso e collocare delicatamente la faccia in giù sulla goccia. Incubare i coperchi per 1,5 ore a RT o per una notte a 4 ° C in una camera umida.
   NOTA: Per preparare una camera umida, posizionare i tessuti prewetted lungo i bordi di una camera chiusa e chiusa rivestita con parafilm in plastica.
8. Trasferire ciascuna copertina con le pinzette in un pozzo di una nuova piastra a 24 pozzetti riempita di 1 mL di TBS; Incubare con agitazione leggera su un agitatore a piastra per 5 min. Aspirare TBS in ogni pozzetto usando una pompa di aspirazione, sostituire con 1 mL TBS e riposizionare su agitatore a piastra per 5 min. Ripetere la lavata ancora una volta.
   NOTA: riutilizzare il parafilm rimuovendo il liquido in eccesso con un tessuto e lavando la superficie con acqua. Assicurarsi che la pellicola paraffina sia completamente asciutta prima di usinG per la successiva fase di colorazione.
9. Preparare la soluzione anticorpale secondaria in TBS (diluizione 1: 500 - 1: 2.000). Per macchiare il nucleo ei batteri, aggiungere 2 μg / mL DAPI al mix. Per macchiare l'actina, aggiungete phalloidin fluorescente. Pipettare 50 μL di miscele secondarie anticorpali sulla pellicola di paraffina di plastica.
   NOTA: Si raccomanda l'uso di anticorpi secondari secondari ad alta trasparenza cross-assorbiti per studi di co-localizzazione di differenti marcatori SG quando viene utilizzato G3BP1 (anticorpi caprini). Scegli gli anticorpi secondari etichettati con fluorescenza con spettri non sovrapposti. EIF3b chiaramente macchia il citoplasma delle cellule ed è quindi un buon marcatore per delineare le cellule. La macchia di actina aiuta ulteriormente a delineare le cellule nei siti di contatto cellulare e nelle aree di ingresso batterico.
10. Prendete la copertura con le pinzette, schiacciando il bordo del coperchio sul tessuto, rilasciando brevemente le pinzette, per rimuovere il liquido in eccesso. Posizionare delicatamente il coperchio rivolto verso il basso sulla goccia e incubare le copertineAl buio per 1 ora a RT.
11. Usate le pinzette per posizionare la copertura nel piatto da 24 pozzetti riempiti di PBS fresco da 1 ml. Assicurarsi che il coperchio sia completamente coperto dal PBS. Lavare le celle 3x con una leggera scossa per 5 minuti ciascuna.
    NOTA: tenere la piastra durante i lavaggi sotto una copertura per proteggere dalla luce come i fluorofori dell'anticorpo secondario sono sensibili alla luce.
12. Inserire brevemente la copertura in acqua deionizzata per rimuovere il sale, asciugare dal bordo su un tessuto e montare la copertura in 5 μl di supporto di fluorescenza su una lastra di vetro. Sigillare la copertina prima dell'immagine con smalto. Mantenere le diapositive a 4 ° C per una breve durata (settimana) oa -20 ° C per l'immagazzinamento a lungo termine (mese).
    NOTA: Evitare le bolle d'aria durante la sigillatura in quanto ciò ostacola la qualità dell'immagine.

5. Fluorescenza Imaging

NOTA: fare riferimento al manuale utente del microscopio per ottimizzare l'impostazione.

1. Acquisire le immagini usando un microscopio confocale usando una lente di immersione a olio 40 o 63X. Selezionare i canali fluorescenti desiderati per l'acquisizione di immagini. Quando si utilizzano più canali fluorescenti, selezionare la modalità di acquisizione sequenziale.
   NOTA: Iniziare con i campioni sperimentali in cui gli SG sono stati indotti il ​​più forte per evitare sovraesposizione nei campioni successivi. Assicurarsi di non avere SG sovraesposti per tutta la profondità della cella.
   1. Impostare la dimensione del bit di 12 o superiore nelle impostazioni del microscopio per garantire la precisione dell'analisi delle immagini.
   2. Impostare le pile di immagini per coprire l'intera profondità della cella. Controllare i diversi canali e per i diversi marcatori SG per assicurare che l'intera gamma sia inclusa. Impostare l'inizio dello stack alla base delle celle e la parte superiore degli stack all'altezza nella parte superiore delle celle in cui non vengono osservati più marcatori SG.
   3. Acquisizione dello stack. Tenere l'altezza dello stack uguale per tutte le immagini.
      NOTA: non farloModificare le impostazioni di acquisizione tra controlli e campioni sperimentali utilizzati per il confronto successivo.

6. Analisi delle immagini

NOTA: Qui viene descritta l'analisi SG sulle pile crollate usando freeware ICY. L'analisi delle immagini delle ricostruzioni 3D può essere effettuata anche utilizzando altri software specializzati. Il rilevamento SG può essere eseguito tramite un flusso di lavoro completamente automatizzato stabilito per questo protocollo (disponibile all'indirizzo http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/Stress_granule_detection_in_fluorescence_imaging). Per utilizzare questo protocollo, i nuclei devono essere macchiati con una macchia di DNA per il software per trovare il centro di ciascuna cella e i bordi delle cellule devono essere contrassegnati da un marcatore citoplasmatico (come ad esempio eIF3b) o da una colorazione attinica per il software Per identificare i confini delle cellule. Il flusso di lavoro automatico può essere utilizzato per convalidare i risultati derivanti manualmente o direttamente per l'analisi quando i limiti delle cellule sono rilevati con alta fiducia,Dipendono dalla densità delle cellule e dal marker utilizzato per rilevare i limiti delle cellule.

1. Utilizzando ImageJ o Fiji, comprimere gli stack di immagini (Image> Stacks> Projection Z) e salvare come file .tiff.
   NOTA: Crea una nuova cartella per ogni immagine poiché il software di analisi delle immagini legherà i suoi risultati al sito dell'immagine originale.
2. Carica un'immagine di controllo e sperimentale .tiff alla piattaforma di analisi delle immagini (File> Apri). Vai alla finestra Sequenza. Scorri verso il basso nella "Tabella di ricerca" i parametri del canale.
3. Disattiva tutti i canali facendo clic sulla casella di controllo di tutte le schede del canale. Fai clic sul canale 0 e seleziona il colore preferito facendo clic sulla barra di colore qui sopra. Aumenta l'intensità del canale come necessario per vedere tutte le strutture facendo clic e spostando la riga nel campo di intensità. Ripetere questo per tutti i canali.
   NOTA: Disattivare i canali che non sono necessari per una determinata attività per ridurre al minimo le anomalie nell'analisi dei campioni.
4. ScorrereUp e all'interno della scheda Canvas, ingrandire fino a circa 10 celle per campo regolando la scheda zoom.
5. Utilizza gli strumenti della funzione poligonale (nella barra superiore) per delineare i limiti delle cellule delle celle nell'immagine. Utilizzare la macchia actina o un marcatore citosolico per la delimitazione del contorno cellulare ( ad es. EIF3b).
   1. Fai clic sulla funzione poligonale all'interno degli strumenti "File & ROI". Inizia la delineazione cliccando sulla cella e poi estendi la linea facendo gli ancoraggi ripetuti cliccando attorno al limite della cella. Per terminare un ROI, fare nuovamente clic sulla funzione poligonale all'interno degli strumenti "File & ROI".
      NOTA: Identificare le sotto-popolazioni delle celle delineate che sono infette. Il campione è costituito da un mix di cellule infette e non infette. Per identificare i batteri, utilizzare la macchia DAPI oi batteri fluorescenti (come i batteri esprimenti GFP). Aumenta l'intensità per assicurare che tutti i batteri siano visibili.
   2. Per denominare un ROI, andare alla finestra ROI a destra e cliCk sulla cella di interesse nell'immagine. Ciò evidenzierà il ROI corrispondente nella scheda ROI. Fare doppio clic sul nome ROI e modificare il nome ( ad esempio, cellula infetta # 1).
      NOTA: se si desidera utilizzare un'immagine per analizzare le celle infette e non infette, è più facile salvare l'immagine in due cartelle separate e delineare separatamente le cellule infette e non infette, generando due fogli di calcolo diversi, che facilitano l'analisi dopo.
6. Aprire l'applicazione rivelatore spot all'interno della scheda "Rilevamento e monitoraggio" (barra superiore). All'interno della scheda Input, verrà selezionata l'immagine corrente. Non cambiare nulla. All'interno della scheda Pre-Processing, selezionare il canale da analizzare.
   NOTA: Solo un canale può essere analizzato in un determinato momento. Qui è possibile selezionare un'analisi batch se si utilizza la sequenza di analisi completamente automatizzata i cui parametri sono stati controllati per dare risultati soddisfacenti.
   1. All'interno della scheda Detector, scegliete "DeSeleziona la scala e la sensibilità appropriata. Esegue questa operazione testando diverse impostazioni e controllando il punto di rilevamento spot nei controlli e nei campioni sperimentali.
      NOTA: Per un'immagine con una risoluzione di 2.048 x 2.048 e una dimensione di pixel di 0.12 μm ² , è generalmente adatta una soglia di livello 2 con una sensibilità da 25 a 100, ma ciascun marker SG deve essere testato empiricamente. Impostare il rilevamento del punto in modo che nel campione di controllo non trattato non siano rilevati spot, mentre nel campione sperimentale con SG, vengono conteggiati tutti i SG piccoli e grandi.
   2. All'interno della scheda ROI, selezionare il ROI suggerito dalla sequenza. All'interno della scheda Filtro, selezionare No Filtering. Nella scheda Output, scegliere l'output appropriato.
      NOTA: la scelta di Abilita file specifico è utile per il salvataggio di differenti condizioni di rilevamento o di diversi canali. Selezionando per esportare l'immagine binaria e l'immagine originale con i ROI e il rilevamento è helPful per l'analisi di controllo di qualità.
   3. Seleziona "Rimuovi punti precedenti resi come ROI". Scegliere la cartella per salvare il file facendo clic sul pulsante "nessun file selezionato". Nella scheda Display, selezionare le opzioni desiderate. Fare clic su "Avvia rilevamento".
      NOTA: Verrà creata una cartella con il nome e la località scelta che contiene le opzioni di imaging esportate. Queste immagini verranno sovrascritte per ogni nuova condizione testata. Per mantenere le immagini, rinominare la cartella in modo che crei una nuova cartella o trasferisca le immagini dalla cartella di salvataggio in una nuova cartella. Per il controllo della qualità delle immagini, è utile selezionare il segno di rilevazione del display, il numero di rilevamento del ROI e del ROI numero e nome.
7. Consolidare e salvare i dati per i diversi parametri utilizzando il foglio di calcolo generato per ogni immagine o condizione testata.
   NOTA: I parametri da analizzare includono il numero di SG per ROI, le superfici SG e la SG maxImman, intensità media e minima.
8. Trasferire i dati e analizzare usando un programma di analisi in grado di analizzare, analizzare e determinare la significatività statistica.

Risultati

Per spiegare e dimostrare il protocollo descritto in questo manoscritto abbiamo caratterizzato l'immagine di SGs indotti da clotrimazolo nelle cellule HeLa infette o non con il patogeno citosolico S. flexneri . Una descrizione del procedimento è presentata in figura 1 e comprende la virulenza e avirulente S. flexneri su piastre rosse di Congo, preparazione dei batteri, infezione, aggiunta di stress ambientali, fissazione e colorazione ...

Discussione

Il protocollo descritto qui descrive l'induzione, la localizzazione e l'analisi di SG in cellule non infette e nelle cellule infette con il patogeno citosolico S. flexneri in presenza o in assenza di stress esogeno. Utilizzando il software di imaging gratuito, i protocolli consentono l'analisi precisa qualitativa e quantitativa della formazione SG per individuare e confrontare statisticamente le differenze in determinati fenotipi.

Ci sono diversi passaggi critici all'...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary Antibodies
eIF3b (N20), origin goat	Santa Cruz	sc-16377	Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1:300
eIF3b (A20), origin goat	Santa Cruz	sc-16378	Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1:300
eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal)	Cell Signaling	3411	Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1:800
eIF4AI, origin goat	Santa Cruz	sc-14211	Recommended by (Ref # 13). Dilution 1:200
eIF4B, origin rabbit	Abcam	ab186856	Good stress granule marker in our hands. Dilution 1:300
eIF4B, origin rabbit	Cell Signaling	3592	Recommended by Ref # 13. Dilution 1:100
eIF4G, origin rabbit	Santa Cruz	sc-11373	Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1:300
G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal)	BD Biosciences	611126	Widely used SG marker. Dilution 1:300
Tia-1, origin goat	Santa Cruz	sc-1751	Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1:300
Alexa-conjugated Secondary Antibodies
A488 anti-goat , origin donkey	Thermo Fisher	A-11055	Cross absorbed. Dilution 1:500
A568 anti-goat, origin donkey	Thermo Fisher	A-11057	Cross absorbed. Dilution 1:500
A488 anti-mouse, origin donkey	Thermo Fisher	A-21202	Dilution 1:500
A568 anti-mouse, origin donkey	Thermo Fisher	A10037	Dilution 1:500
A647 anti-mouse, origin donkey	Thermo Fisher	A31571	Dilution 1:500
A488 anti-rabbit, origin donkey	Thermo Fisher	A-21206	Dilution 1:500
A568 anti-rabbit, origin donkey	Thermo Fisher	A10042	Dilution 1:500
Other Reagents
Shigella flexneri			Available from various laboratories by request
Tryptone Casein Soya (TCS) broth	BD Biosciences	211825	Standard growth medium for Shigella, application - bacterial growth
TCS agar	BD Biosciences	236950	Standard growth agar for Shigella, application - bacterial growth
Congo red	SERVA Electrophoresis GmbH	27215.01	Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application - bacterial growth
Poly-L-Lysine (PLL)	Sigma-Aldrich	P1274	Useful to coating bacteria to increase infection, application - infection
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397	Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application - infection
HEPES	Life Technologies	15630-056	PH buffer useful when cells are incubated at RT, application - cell culture
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	31885	Standard culture medium for HeLa cells, application - cell culture
Fetal Calf Serum (FCS)	Biowest	S1810-100	5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application - cell culture
Non-Essential Amino Acids (NEAA)	Life Technologies	11140	1:100 dilution used for HeLa cell culture medium, application - cell culture
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650	Reagent diluent, application - cell culture
Sodium arsenite	Sigma-Aldrich	S7400	Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application - stress inducer
Clotrimazole	Sigma-Aldrich	C6019	Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application - stress inducer
Paraformaldehyde (PFA	Electron Microscopy Scences	15714	4% PFA is used for standard fixation of cells, application - fixation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application - permeabilization
A647-phalloidin	Thermo Fisher	A22287	Dilution is at 1:40, best added during secondary antibody staining, application - staining
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application - staining
Parafilm	Sigma-Aldrich	BR701501	Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application - staining
Prolong Gold	Thermo Fisher	36930	Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application - mounting
Mowiol	Sigma-Aldrich	81381	Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting
24-well cell culture plate	Sigma-Aldrich	CLS3527	Standard tissue culture plates, application - cell culture
12 mm  glass coverslips	NeuVitro	1001/12	Cell culture support for immunofluorescent applications, application - cell support
forceps	Sigma-Aldrich	81381	Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting
Programs and Equipment
Prism	GraphPad Software		Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application - data analysis
Leica SP5	Leica Microsystems		Confocal microsope, application - image acquisition
Imaris	Bitplane		Professional image analysis program, application - data analysis
Excel	Microsoft		Data analysis and graphing program, application - data analysis