Analyse d'immunofluorescence de la formation de granules de stress après le dépistage bactérien des cellules de mammifères

Résumé

Nous décrivons une méthode pour l'analyse qualitative et quantitative de la formation de granules de stress dans des cellules de mammifères après que les cellules sont confrontées à des bactéries et à un certain nombre de contraintes différentes. Ce protocole peut être appliqué pour étudier la réponse des granules de stress cellulaire dans une large gamme d'interactions hôtes-bactéries.

Résumé

L'imagerie fluorescente des composants cellulaires est un outil efficace pour étudier les interactions hôte-pathogène. Les agents pathogènes peuvent affecter de nombreuses caractéristiques différentes des cellules infectées, y compris l'ultrastructure des organelles, l'organisation du réseau cytosquelettique, ainsi que les processus cellulaires tels que la formation du granulé du stress (SG). La caractérisation de la façon dont les agents pathogènes subversent les processus hôtes est une partie importante et intégrante du domaine de la pathogenèse. Bien que les phénotypes variables puissent être facilement visibles, l'analyse précise des différences qualitatives et quantitatives dans les structures cellulaires induites par le défi des agents pathogènes est essentielle pour définir des différences statistiquement significatives entre les échantillons expérimental et les témoins. La formation du SG est une réponse au stress évolutive qui conduit à des réponses antivirales et a longtemps été étudiée en utilisant des infections virales ¹ . La formation SG affecte également les cascades de signalisation et peut avoir d'autres conséquences encore inconnues² . La caractérisation de cette réponse au stress par des agents pathogènes autres que les virus, tels que les agents pathogènes bactériens, est actuellement un domaine émergent de recherche ³ . Pour l'instant, l'analyse quantitative et qualitative de la formation SG n'est pas encore utilisée de manière routinière, même dans les systèmes virales. Nous décrivons ici une méthode simple pour induire et caractériser la formation de SG dans les cellules non infectées et dans les cellules infectées par un agent pathogène bactérien cytosolique, ce qui affecte la formation de SG en réponse à divers contraintes exogènes. L'analyse de la formation et de la composition du SG est obtenue en utilisant un certain nombre de marqueurs SG différents et le plug-in détecteur spot de ICY, un outil d'analyse d'image open source.

Introduction

La visualisation des interactions hôte-pathogène au niveau cellulaire est une méthode puissante pour obtenir des idées sur les stratégies pathogènes et pour identifier les voies cellulaires clés. En effet, les agents pathogènes peuvent être utilisés comme outils pour identifier des cibles ou des structures cellulaires importantes, car les agents pathogènes ont évolué pour subvertir les processus cellulaires centraux en tant que stratégie pour leur propre survie ou propagation. La visualisation des composants cellulaires peut être obtenue par l'expression recombinante de protéines hôtes marquées par fluorescence. Bien que cela permette une analyse en temps réel, la génération de lignées cellulaires avec des protéines hôtes spécifiquement étiquetées est très laborieuse et peut entraîner des effets secondaires indésirables. Plus pratique est la détection de facteurs cellulaires à l'aide d'anticorps spécifiques, car plusieurs facteurs d'hôte peuvent être analysés simultanément et l'un n'est pas limité à un type de cellule particulier. Un inconvénient est que seule une vue statique peut être capturée car l'analyse d'immunofluorescence nécessite une fixation de cellule hôteion. Cependant, un avantage important de l'imagerie immunofluorescente est qu'il se prête facilement à l'analyse qualitative et quantitative. Ceci à son tour peut être utilisé pour obtenir des différences statistiquement significatives pour fournir de nouvelles idées sur les interactions hôte-pathogène.

Les programmes d'analyse d'image fluorescente sont des outils analytiques puissants pour effectuer des analyses 3D et 4D. Cependant, le coût élevé du logiciel et de sa maintenance rend les méthodes basées sur des logiciels open source gratuits plus largement attrayantes. Une analyse d'image minutieuse utilisant un logiciel de bioannalyse est précieuse car elle confirme l'analyse visuelle et, lorsqu'on attribue des significations statistiques, augmente la confiance dans l'exactitude d'un phénotype donné. Auparavant, les SG ont été analysés à l'aide du logiciel ImageJ gratuit, ce qui nécessite l'identification manuelle des SG individuels ⁴ . Ici, nous fournissons un protocole pour l'induction et l'analyse de la formation de SG cellulaire dans le contexte du bacInfections tertiaires en utilisant le logiciel d'analyse de bio-image libre open source ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). Le logiciel d'analyse de bio-image dispose d'un programme intégré de détection de points qui est très adapté à l'analyse SG. Il permet le réglage précis du processus de détection automatisé dans les régions d'intérêt spécifiées (ROI). Cela surmonte la nécessité d'une analyse manuelle des SG individuels et supprime le biais d'échantillonnage.

Beaucoup de contraintes environnementales induisent la formation de SG, qui sont des structures cytosoliques, non membranées densément denses, de 0,2 à 5 μm de diamètre ^{5 , 6} . Cette réponse cellulaire est évolutive conservée dans les levures, les plantes et les mammifères et se produit lorsque la traduction globale des protéines est inhibée. Il implique l'agrégation des complexes d'initiation de traduction bloqués en SG, qui sont considérés comme des lieux de maintien pour les ARNm traductionnellement inactifs, permettant la traduction sélective d'un sous-ensemble d'ARNm cellulaires.Après élimination du stress, les SG se dissolvent et les taux globaux de synthèse des protéines reprennent. Les SG sont composés de facteurs d'initiation à l'allongement de la traduction, des protéines impliquées dans le métabolisme de l'ARN, des protéines liées à l'ARN, ainsi que des protéines d'échafaudages et des facteurs impliqués dans la signalisation ^{2 de la} cellule hôte, bien que la composition exacte puisse varier en fonction du stress appliqué. Les facteurs environnementaux qui induisent la formation de SG comprennent la famine des acides aminés, l'irradiation UV, les chocs thermiques, le choc osmotique, le stress du réticulum endoplasmique, l'hypoxie et l'infection virale ^{2 , 7 , 8} . De nombreux progrès ont été réalisés dans la compréhension de la façon dont les virus induisent et subent également la formation de SG, alors que peu de choses sont encore connues sur la façon dont d'autres agents pathogènes, tels que les agents pathogènes bactériens, fongiques ou protozoaires, affectent cette réponse de stress cellulaire ^{1 , 7} .

ShigeLla flexneri est un agent pathogène cytosolique facultatif gram-négatif des humains et l'agent causal de la diarrhée sévère ou de la shigellose. La shigellose est un fardeau majeur de la santé publique et entraîne 28 000 décès par année chez les enfants de moins de 5 ans ^{9 , 10 ans} . S. flexneri infecte l'épithélium colique et se propage de cellule à cellule en détournant les composants cytosquelettiques de l'hôte ^{11 , 12} . L'infection de l'épithélium soutient la réplication de S. flexneri dans le cytosol, mais les macrophages infectés meurent à travers un processus de mort inflammatoire cellulaire appelé pyroptose. L'infection entraîne un recrutement massif de neutrophiles et une inflammation sévère accompagnée de chaleur, de stress oxydatif et de destruction des tissus. Ainsi, alors que les cellules infectées sont soumises à des contraintes internes induites par une infection, telles que la perturbation de Golgi, le stress génotoxique et le réarrangement cytosquelettiqueS, les cellules infectées sont également soumises à des contraintes environnementales dues au processus inflammatoire.

La caractérisation de l'effet de l'infection par S. flexneri sur la capacité des cellules à répondre aux contraintes environnementales en utilisant un certain nombre de marqueurs SG a démontré que l'infection entraîne des différences qualitatives et quantitatives dans la composition SG ³ . Cependant, on connaît peu d'autres agents pathogènes bactériens. Nous décrivons ici une méthodologie pour l'infection des cellules hôtes avec le pathogène cytosolique S. flexneri , le stress des cellules avec différents contraintes environnementales, l'étiquetage des composants SG et l'analyse qualitative et quantitative de la formation et de la composition du SG dans le contexte des infections Et des cellules non infectées. Cette méthode est largement applicable à d'autres agents pathogènes bactériens. En outre, l'analyse d'image de la formation SG peut être utilisée pour les infections par des virus ou d'autres agents pathogènes. Il peut être utilisé pour analyser SGFormation sur l'infection ou l'effet de l'infection sur la formation de SG en réponse à des contraintes exogènes.

Protocole

1. Préparation des bactéries et des cellules hôtes

1. Remettre le couvercle de verre de 12 ou 14 mm dans des plaques de 24 ou 12 puits, respectivement, avec une pince stérile, en comptant un puits par état expérimental. Stérilisez-les par traitement UV dans un capuchon de culture tissulaire pendant 15 min.
   REMARQUE: Inclure les puits de contrôle pour la provocation bactérienne et pour l'induction SG par des contraintes exogènes.
2. Pour une plaque de 24 puits avec des lamelles de 12 mm, semer 1 x 10 ⁵ cellules de mammifères ( par exemple, cellules HeLa) sur des lamelles; Appuyez sur les lamelles vers le bas avec une pointe de pipette stérile. Laisser les cellules adhérer pendant une nuit à 37 ° C dans un incubateur à 5% de culture de tissus de CO ₂ dans un milieu de culture approprié pour chaque type de cellule.
   REMARQUE: les cellules de plaques de sorte que la confluence des cellules soit entre 40 et 60% le lendemain.
   1. Pour les cellules HeLa, incuber dans le milieu d'aigle modifié modifié (DMEM) de Dulbecco avec des acides aminés non essentiels (NEAA) et 10% de sérum de veau fœtal décomplé (FCS).Décomposer FCS par chauffage pendant 30 min dans un bain d'eau à 56 ° C, tourbillonner le sérum une fois après 15 min.
3. Pour éliminer les bactéries, utilisez une pointe de pipette stérile pour enlever une petite quantité d'un stock de glycérol bactérien (20% de glycérol) stocké dans un congélateur de -80 ° C et placez-le sur une plaque étiquetée. Utilisez une boucle stérile pour étaler les bactéries sur environ 10% de la plaque. Utilisez une nouvelle boucle stérile et faites-la glisser dans le frottis pour faire 3 lignes parallèles, une demi-plaque de longueur. Parcourez ces lignes couvrant le reste de la plaque. Incuber la plaque O / N à 37 ° C.
   1. Sélectionnez une seule colonie bactérienne ( p. Ex., S. flexneri ) à partir de la plaque fraîchement striée. Évitez de travailler avec des colonies bactériennes d'une durée supérieure à 1 semaine.
   2. Pour la souche M90T de S. flexneri , inoculer une colonie rouge à partir d'une gélose rouge au Congo à 0,1% d'agar agar tryptique et à 8 ml de bouillon Tryptic de soja dans un tube de 15 ml; Serrer le couvercle et incuber tremper à 222 tr / min O / N à 306; C.
      ATTENTION: Ne pas utiliser de grandes colonies blanches car elles ont perdu le plasmide de virulence et ne sont pas infectieuses.

2. Défi bactérien des cellules hôtes

1. Préparez les bactéries pour maximiser le potentiel d'infection.
   1. Pour S. flexneri , bactéries de sous-culture en ajoutant 150 μL de culture O / N à 8 mL Tryptic Soy Agar et incuber en agitant 222 tr / min à 37 ° C jusqu'à une phase exponentielle tardive (~ 2 h) pour induire l'expression du gène de la virulence et améliorer l'infection.
      1. Lorsque la culture est à une densité optique comprise entre 0,6 et 0,9 (mesurée à 600 nm), transférer 1 mL de culture dans un tube de 1,5 ml. Bactérie de pastilles pendant 2 min à 8 000 xg et ressuspendre dans le milieu d'infection (DMEM avec NEAA, dépourvu de FCS) à OD ₆₀₀ = 1. Ainsi, si la DO ₆₀₀ est de 0,85, ré-endigurez en 850 μL.
         NOTE: Pour S. flexneri, à OD ₆₀₀ = 1, il y aura 8 x 10 ⁸ bactéries par mL lorsqueCultivé dans 8 mL de milieu. Une multiplicité d'infection (MOI) de 20 est appropriée. Pour d'autres agents pathogènes, le nombre de bactéries par ml à une DO ₆₀₀ et le MOI approprié doivent être déterminés empiriquement.
   2. Pour améliorer les interactions bactérienne-hôte, couvrir les bactéries avec la Poly-L-Lysine (PLL).
      NOTE: Le traitement PLL de S. flexneri n'a eu aucun effet sur la dynamique des SG. D'autres agents pathogènes doivent être évalués pour leur facilité au traitement PLL.
      1. Pour enrober les bactéries avec PLL, centrifuger 1 mL de culture bactérienne pendant 2 min à 8 000 xg, puis remettre à nouveau le culot dans 10 μg / mL de PLL dans une solution salée tamponnée au phosphate (PBS) à une DO ₆₀₀ = 1.
      2. Ajouter la solution bactérienne dans un petit plat, comme un puits dans une plaque de 12 puits, et incuber à la température ambiante (~ 20 ° C) pendant 10 minutes avec une agitation douce sur un agitateur à plaques.
      3. Pellet bactéries pendant 2 min à 8 000 xg, éliminer l'excès de PLL. Remettre en suspension la pastille dans 1 mL de PBS etD répétez cette étape de lavage deux fois. Après le lavage final, ré-endiguer dans le milieu d'infection à la DO ₆₀₀ = 1.
         NOTE: Ici, le milieu d'infection pour S. flexneri est un milieu cellulaire hôte avec HEPES 20 mM sans FCS.
2. Préparer les cellules pour la provocation bactérienne.
   1. Retirer le milieu des cellules HeLa de mammifères en utilisant une pompe d'aspiration. Ajouter 500 μL de milieu cellulaire RT HeLa pour laver les cellules, tourbillonner, enlever le milieu à l'aide d'une pompe d'aspiration et le remplacer par 500 μL de milieu d'infection approprié RT ( par exemple , milieu cellulaire hôte avec HEPES 20 mM sans FCS).
   2. REMARQUE: pour toutes les étapes de lavage, travaillez rapidement et ne procédez que jusqu'à 4 lamelles à la fois pour éviter de vous sécher des cellules.
3. Défi a préparé des cellules HeLa avec des bactéries pour infecter 20 à 50% des cellules.
   NOTE: Le temps approprié et le MOI doivent être déterminés pour chaque espèce bactérienne. Généralement, un bon départ est de 30 min à 37° C avec un MOI de 10.
   1. Pour S. flexneri, testez les cellules des cellules HeLa en utilisant l'une des deux méthodes (étape 2.3.1.1 ou 2.3.1.2).
      1. Traverser des bactéries non traitées par PLL (20 μL de DO ₆₀₀ = 1 / puits de plaque de 24 puits dans 500 μL de milieu) sur des cellules pendant 10 min à 13000 x g.
      2. Ajouter des bactéries enduites de PLL (15 μL de DO ₆₀₀ = 1 / puits de plaque de 24 puits sur 500 μL de milieu) pendant 15 min à la RT pour permettre aux bactéries de s'installer sur les cellules.
   2. Laisser l'infection se produire en plaçant les cellules avec des bactéries installées dans un incubateur de culture tissulaire à 37 ° C pendant 30 minutes.
      REMARQUE: pour les courts instants, synchroniser l'infection par S. flexneri en plaçant des plaques dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 15 minutes au lieu de l'incubateur de culture tissulaire.
4. Arrêtez l'infection en lavant les cellules.
   1. Pour laver les cellules et éliminer les excès de bactéries, retirer le milieu à l'aide d'une pompe d'aspiration, ajouter 1 mLMilieu de culture HeLa pré-humidifié (37 ° C) (DMEM, 10% FCS, NEAA). Faire tourner le milieu, retirer et remplacer par un moyen frais. Répétez deux fois et laissez le moyen frais sur les cellules.
      1. Pour S. flexneri , ou d'autres bactéries intracellulaires, après l'infection des cellules HeLa et les lavages, remplacer le milieu par un milieu de culture tissulaire standard contenant 50 μg / mL de gentamicine pour tuer les bactéries extracellulaires et prévenir d'autres invasions cellulaires.
         REMARQUE: Ne pas ajouter d'antibiotiques dans le milieu pour les bactéries extracellulaires.
5. Incuber les bactéries avec des cellules pendant la durée souhaitée dans un incubateur de culture tissulaire.
   NOTE: Pour S. flexneri , l'infection peut durer jusqu'à 6 h selon le type de cellule. Pour les cellules HeLa, laisser l'infection se poursuivre pendant 1,5 à 2 h avant d'ajouter des contraintes exogènes pour induire une formation de SG. Pour les infections Caco-2, dans lesquelles Shigella se propage cellulaire à cellule, infecter pendant 30 min à 6 h avant d'ajouter un stress exogène. CeLl peut être fixé à ce stade sans ajouter de contraintes exogènes pour évaluer la formation de SG à la suite de l'infection bactérienne (dans ce cas, passez à la section 4).

3. Induire la formation de granulés de stress par addition de facteurs de stress exogènes

1. Retirez le milieu des cellules HeLa infectées et non infectées à l'aide d'une pompe d'aspiration, remplissez le milieu avec 500 μL de milieu approprié avec ou sans le facteur de stress et incupez.
   REMARQUE: Les conditions inductrices de stress comprennent les éléments suivants (voir ci-dessous). Pour des traitements supplémentaires, voir Kedersha et al . ¹³ .
   1. Pour un traitement par choc thermique, utilisez un milieu régulier contenant HEPES 20 mM et placez la plaque dans un bain d'eau à 44 ° C pendant 30 minutes.
   2. Pour le traitement au clotrimazole (induit le stress mitochondrial), utiliser un milieu régulier sans FCS avec du clotrimazole 20 uM et incuber dans un incubateur à culture tissulaire pendant 1 h.
      REMARQUE: conserver des aliquotes à usage unique de 20 mM de stock de clotrimazole dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) à -20 ° C pendant 4 mois. Utilisez un véhicule DMSO pour les cellules témoins.
   3. Pour le traitement par arsénite (induit un stress oxydatif), utiliser un milieu régulier avec de l'arsénite 0,5 μM et incuber dans un incubateur de culture tissulaire pendant 1 h.
      REMARQUE: conservez des aliquotes à usage unique de 0,5 mM d'arsénite à -20 ° C pendant 6 mois.
      ATTENTION: Le clotrimazole et l'arsénite sont nocifs et dangereux pour l'environnement et doivent être éliminés de manière appropriée.
   4. Pour le traitement par Des-Methyl Des-Amino (DMDA) -pateamine (inhibe l'initiation de la traduction eucaryote), utilisez un milieu régulier avec 50 à 200 nM de DMDA-pateamine et incubez dans un incubateur de culture tissulaire pendant 1 h.
      REMARQUE: Conserver la DMDA-pateamine à -80 ° C. Stocker les réactifs sous forme de petites aliquotes pour éviter le gel de la décongélation.

4. Fixation et analyse de l'immunofluorescence de la formation de granules de stress

REMARQUE: Traiter le contrôle etDes lamelles expérimentales en même temps pour éviter de colorer des différences qui peuvent avoir une incidence sur l'analyse d'image dans les étapes suivantes. Les échantillons de contrôle ne comprennent pas d'infection avec et sans traitement générateur de SG, et des échantillons infectés avec et sans SG induisant un traitement.

1. Enlever complètement le milieu à l'aide d'une pompe d'aspiration et réparer les échantillons en ajoutant 0,5 mL de TA 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS. Incuber pendant 30 min à la température ambiante.
   ATTENTION: PFA est dangereux pour le gestionnaire et l'environnement. Prenez les mesures appropriées pour protéger le manipulateur et éliminer les déchets chimiques.
   REMARQUE: Alternativement, réparer pendant 15 minutes, puis remplacer par du methanol préchauffé de -20 ° C pendant 10 minutes pour conserver plus de localisation cytoplasmique des marqueurs SG ¹³ .
2. Retirez le PFA avec une pipette et disposez le liquide dans un récipient de déchets approprié. Laver la lamelle avec 1 ml de solution saline tamponnée au Tris (TBS: Tris 25 mM, pH 7,3, NaCl 15 mM). Incuber le lamelle pendant 2 min avec un tremblement douxSur un agitateur pendant le lavage.
3. Retirez complètement le TBS à l'aide d'une pompe d'aspiration et ajoutez 500 μL de Triton-X100 à 0,3% dans le TBS pendant 10 minutes pour perméabiliser les cellules.
4. Retirer la solution de perméabilisation avec une pompe d'aspiration. Remplacez-le par 1 ml de TBS, tournez doucement la plaque, retirez TBS par aspiration et ajoutez 1 ml de solution bloquant (5% de FCS dans TBS) pendant 1 h à la température ambiante.
5. Préparer la solution d'anticorps primaire (dilution 1: 300) dans 5% de FCS dans du SCT. Calculez 50 μL par lamelle de 12 mm et faites assez pour tous les lamelles dans un lot.
   NOTE: Les anticorps primaires communs utilisés sont G3BP1, eIF3b et TIA1.
6. Présentez 50 μL du mélange d'anticorps primaire sur un film de paraffine en plastique (parafilm) fixé fermement sur le banc ou la chambre.
   REMARQUE: Une liste de marqueurs SG canoniques est fournie dans la table des matières , mais la composition des SG peut dépendre du stress appliqué. D'autres marqueurs SG sont listés dans Kedersha et al. ¹³ Les résultats escomptés pour un certain nombre de marqueurs SG pour l'infection à S. flexneri sont listés dans le tableau 1 .
7. Prenez le couvre-lit avec des pincettes, enfoncez le bord de la lamelle sur un tissu, relâchez brièvement la pincette pour enlever l'excès de liquide et placez délicatement la face vers le bas sur la goutte. Incuber les lamelles pendant 1,5 h à la température ambiante ou pendant une nuit à 4 ° C dans une chambre humide.
   REMARQUE: Pour préparer une chambre humide, placez les tissus pré-humidifiés le long des bords d'une chambre fermement fermée doublée d'un parafil plastique.
8. Transférer chaque couvre-lit avec une pincette dans un puits d'une nouvelle plaque de 24 puits remplie de 1 ml de TBS; Incuber avec un tremblement doux sur un agitateur de plaques pendant 5 min. Succez le TBS dans chaque puits à l'aide d'une pompe d'aspiration, remplacez-le par 1 mL de TBS et placez-le sur le sélecteur de plaques pendant 5 min. Répétez le lavage une fois de plus.
   REMARQUE: Réutiliser le parafilm en enlevant l'excès de liquide avec un tissu et en lavant la surface avec de l'eau. Assurez-vous que le film de paraffine est complètement sec avant nousG pour l'étape de coloration suivante.
9. Préparer la solution d'anticorps secondaire dans le SCT (dilution 1: 500 - 1: 2 000). Pour tacher le noyau et les bactéries, ajouter 2 μg / mL de DAPI au mélange. Pour tacher l'actine, ajouter une phalloidine fluorescente. Pipetter 50 μL de mélange d'anticorps secondaires sur le film de paraffine en plastique.
   REMARQUE: L'utilisation d'anticorps secondaires d'âne absorbés par voie croisée hautement purifiée est recommandée pour les études de co-localisation de différents marqueurs de SG lorsque le G3BP1 (anticorps de chèvre) est utilisé. Choisissez des anticorps secondaires marqués par fluorescence avec des spectres non chevauchants. EIF3b tache clairement le cytoplasme des cellules et est donc un bon marqueur pour délimiter les cellules. La tache d'actine contribue également à délimiter les cellules dans les sites de contact cellulaire à cellulaire et les zones d'entrée bactérienne.
10. Ramassez la lamelle avec des pinces, enfoncez le bord de la lamelle sur les tissus, relâchez brièvement les pinces, afin d'enlever l'excès de liquide. Collez délicatement la lamelle sur la goutte et incupez les lamellesDans l'obscurité pendant 1 h à la RT.
11. Utilisez une pincette pour remettre la lamelle dans les plaques de 24 puits remplies de 1 ml de PBS frais. Assurez-vous que la lamelle couvre entièrement le PBS. Laver les cellules 3x avec un secousses douces pendant 5 minutes chacune.
    REMARQUE: conservez la plaque pendant les lavages sous un couvercle pour protéger de la lumière car les fluorophores de l'anticorps secondaire sont sensibles à la lumière.
12. Enlevez brièvement le lamelleau dans de l'eau désionisée pour enlever le sel, séchez-le du bord sur un tissu et montez le lamelle sur 5 μL de support de fluorescence sur une glissière en verre. Scellez la lamelle avant l'imagerie à l'aide de vernis à ongles. Gardez les diapositives à 4 ° C à court terme (semaine) ou à -20 ° C pour un stockage à long terme (mois).
    REMARQUE: Évitez les bulles d'air lors de l'étanchéité car cela nuira à la qualité de l'image.

5. Imagerie en fluorescence

REMARQUE: Reportez-vous au mode d'emploi du microscope pour l'optimisation de la configuration.

1. Acquérir des images à l'aide d'un microscope confocal en utilisant une lentille d'immersion à l'huile 40 ou 63X. Sélectionnez les canaux fluorescents souhaités pour l'acquisition de l'image. Lorsque vous utilisez plusieurs canaux fluorescents, sélectionnez le mode d'acquisition séquentielle.
   REMARQUE: commencez avec les échantillons expérimentaux où les SG ont été induits le plus fort pour éviter une surexposition sur les échantillons suivants. Assurez-vous de ne pas avoir des SG surexposés sur toute la profondeur de la cellule.
   1. Définissez une taille de bit de 12 ou plus dans les paramètres du microscope pour assurer la précision de l'analyse de l'image.
   2. Réglez les piles d'image pour couvrir toute la profondeur de la cellule. Vérifiez les différents canaux et les différents marqueurs SG pour vous assurer que toute la gamme est incluse. Réglez le début de la pile à la base des cellules et le haut des piles à la hauteur en haut des cellules où plus de marqueurs SG sont observés.
   3. Acquérir la pile. Gardez la hauteur de la pile identique pour toutes les images.
      REMARQUE: Ne pasModifier les paramètres d'acquisition entre le contrôle et les échantillons expérimentaux qui seront utilisés pour une comparaison ultérieure.

6. Analyse d'image

REMARQUE: Ici, l'analyse SG sur les piles effondrées utilisant le freeware ICY est décrite. L'analyse d'image des reconstructions en 3D peut également être effectuée à l'aide d'autres logiciels spécialisés. La détection SG peut être effectuée via un flux de travail entièrement automatisé établi pour ce protocole (disponible sur http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/Stress_granule_detection_in_fluorescence_imaging). Pour utiliser ce protocole, les noyaux doivent être colorés avec une tache d'ADN pour que le logiciel trouve le centre de chaque cellule et les bords des cellules doivent être marqués soit par un marqueur cytoplasmique (tel que eIF3b), soit par une tache d'actine pour le logiciel Pour identifier les limites des cellules. Le flux de travail automatique peut être utilisé pour valider les résultats dérivés manuellement ou directement pour l'analyse lorsque les limites des cellules sont détectées avec une grande confiance, qui sera moStly dépend de la densité des cellules et du marqueur utilisé pour détecter les limites des cellules.

1. À l'aide d'ImageJ ou de Fidji, effacez les piles d'image (Image> Stacks> projection Z) et enregistrez les fichiers .tiff.
   REMARQUE: créez un nouveau dossier pour chaque image, car le logiciel d'analyse d'image reliera ses résultats au site de l'image originale.
2. Chargez un contrôle et une image expérimentale sur la plate-forme d'analyse d'image (Fichier> Ouvrir). Passez à la fenêtre Séquence. Faites défiler vers le bas dans la "Table de recherche" aux paramètres du canal.
3. Désactivez toutes les chaînes en cliquant sur la case à cocher de tous les onglets de la chaîne. Cliquez sur le canal 0, puis sélectionnez la couleur préférée en cliquant sur la barre de couleurs ci-dessus. Augmentez l'intensité du canal si nécessaire pour voir toutes les structures en cliquant et en déplaçant la ligne dans le champ d'intensité. Répétez ceci pour tous les canaux.
   REMARQUE: désactivez les canaux qui ne sont pas nécessaires pour une tâche donnée afin de minimiser les biais dans l'analyse des échantillons.
4. RouleauVers le haut et dans l'onglet Toile, zoomer vers environ 10 cellules par champ en ajustant l'onglet de zoom.
5. Utilisez les outils de la fonction polygone (dans la barre supérieure) pour délimiter les limites cellulaires des cellules de l'image. Utilisez la tache d'actine ou un marqueur cytosolique pour la délimitation des limites cellulaires ( p. Ex . EIF3b).
   1. Cliquez sur la fonction polygone dans les outils "Fichier et ROI". Commencez la délimitation en cliquant sur la cellule, puis étendez la ligne en faisant des ancres en cliquant de manière répétée autour de la limite de la cellule. Pour terminer un ROI, cliquez de nouveau sur la fonction polygone dans les outils "Fichier et ROI".
      REMARQUE: Identifiez les sous-populations des cellules délimitées qui sont infectées. L'échantillon consiste en un mélange de cellules infectées et non infectées. Pour identifier les bactéries, utilisez soit la tache DAPI ou les bactéries fluorescentes (telles que les bactéries exprimant la GFP). Augmenter l'intensité pour s'assurer que toutes les bactéries sont vues.
   2. Pour nommer un ROI, accédez à la fenêtre ROI à droite et à droiteCk sur la cellule d'intérêt dans l'image. Cela mettra en évidence le ROI correspondant dans l'onglet ROI. Double-cliquez sur le nom de ROI et modifiez le nom ( p . Ex . Cellule infectée n ° 1).
      REMARQUE: si une image doit être utilisée pour analyser les cellules infectées et non infectées, il est plus facile de sauvegarder l'image dans deux dossiers distincts et de délimiter séparément les cellules infectées et non infectées, en générant deux feuilles de calcul différentes, ce qui facilitera l'analyse plus tard.
6. Ouvrez l'application détecteur spot dans l'onglet "Détection et suivi" (barre supérieure). Dans l'onglet Entrée, l'image actuelle sera sélectionnée. Ne change rien. Dans l'onglet Pré-traitement, sélectionnez le canal à analyser.
   REMARQUE: Un seul canal peut être analysé à tout moment donné. Une analyse par lots peut être sélectionnée ici si l'on utilise la séquence d'analyse entièrement automatisée dont les paramètres ont été vérifiés pour donner des résultats satisfaisants.
   1. Dans l'onglet Détecteur, choisissez "DeTect des points lumineux sur un fond sombre ". Sélectionnez ensuite l'échelle et la sensibilité appropriées. Effectuez ceci en testant différents paramètres et en vérifiant de manière croisée la détection des taches à la fois dans le contrôle et dans les échantillons expérimentaux.
      REMARQUE: pour une image d'une résolution de 2,048 x 2,048 et d'une taille de pixel de 0,12 μm ² , un seuil de niveau 2 avec une sensibilité de 25 à 100 est généralement approprié, mais chaque marqueur SG doit être testé de manière empirique. Configurez la détection des points afin que, dans l'échantillon de contrôle non traité, les taches ne soient pas détectées, tandis que dans l'échantillon expérimental avec SG, tous les SG petits et grands sont comptés.
   2. Dans l'onglet ROI, sélectionnez le ROI suggéré à partir de la séquence. Dans l'onglet Filtrage, sélectionnez Non Filtrage. Dans l'onglet Sortie, choisissez la sortie appropriée.
      REMARQUE: Choisir un fichier spécifique permet d'enregistrer différentes conditions de détection ou différents canaux. Sélectionner pour exporter l'image binaire et l'image originale avec des ROI et la détection est helPour une analyse de contrôle de qualité.
   3. Sélectionnez "Supprimer les spots précédents rendus en ROI". Choisissez le dossier pour enregistrer le fichier en cliquant sur le bouton "aucun fichier sélectionné". Dans l'onglet Affichage, sélectionnez les options souhaitées. Cliquez sur "Démarrer la détection".
      REMARQUE: Un dossier contenant le nom et l'emplacement choisi sera créé qui contient les options d'imagerie exportées. Ces images seront écrasées pour chaque nouvelle condition testée. Pour conserver les images, renommez le dossier afin qu'un nouveau dossier soit créé ou transférez les images du dossier de sauvegarde vers un nouveau dossier. Pour le contrôle de qualité des images, il est utile de sélectionner la marque de détection d'affichage, le nombre de détection de ROI et le numéro de ROI et le nom.
7. Consolidez et enregistrez les données pour les différents paramètres à l'aide de la feuille de calcul générée pour chaque image ou condition testée.
   NOTE: Les paramètres à analyser comprennent le nombre de SG par ROI, les surfaces SG et le SG maxDes intensités moyennes et minimales.
8. Transférer les données et analyser à l'aide d'un programme d'analyse capable d'analyser, de représenter graphiquement et de déterminer la signification statistique.

Résultats

Pour expliquer et démontrer le protocole décrit dans ce manuscrit, nous avons caractérisé l'image des SGs induites par le clotrimazole dans les cellules HeLa infectées ou non avec le pathogène cytosolique S. flexneri . Un schéma de la procédure est présenté dans la figure 1 , et comprend S. flexneri virulent et avirulent rayé sur les plaques rouges du Congo, la préparation des bactéries, l'infection, l'ajout de stre...

Discussion

Le protocole décrit ici décrit l'induction, la localisation et l'analyse des SG dans les cellules non infectées et les cellules infectées par le pathogène cytosolique S. flexneri en présence ou en l'absence de stress exogène. En utilisant un logiciel d'imagerie gratuit, les protocoles permettent une analyse qualitative et quantitative précise de la formation SG pour identifier et analyser statistiquement les différences dans les phénotypes donnés.

Il exist...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary Antibodies
eIF3b (N20), origin goat	Santa Cruz	sc-16377	Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1 in 300
eIF3b (A20), origin goat	Santa Cruz	sc-16378	Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1 in 300
eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal)	Cell Signaling	3411	Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1 in 800
eIF4AI, origin goat	Santa Cruz	sc-14211	Recommended by (Ref # 13). Dilution 1 in 200
eIF4B, origin rabbit	Abcam	ab186856	Good stress granule marker in our hands. Dilution 1 in 300
eIF4B, origin rabbit	Cell Signaling	3592	Recommended by Ref # 13. Dilution 1 in 100
eIF4G, origin rabbit	Santa Cruz	sc-11373	Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1 in 300
G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal)	BD Biosciences	611126	Widely used SG marker. Dilution 1 in 300
Tia-1, origin goat	Santa Cruz	sc-1751	Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1 in 300
Alexa-conjugated Secondary Antibodies
A488 anti-goat , origin donkey	Thermo Fisher	A-11055	Cross absorbed. Dilution 1 in 500
A568 anti-goat, origin donkey	Thermo Fisher	A-11057	Cross absorbed. Dilution 1 in 500
A488 anti-mouse, origin donkey	Thermo Fisher	A-21202	Dilution 1 in 500
A568 anti-mouse, origin donkey	Thermo Fisher	A10037	Dilution 1 in 500
A647 anti-mouse, origin donkey	Thermo Fisher	A31571	Dilution 1 in 500
A488 anti-rabbit, origin donkey	Thermo Fisher	A-21206	Dilution 1 in 500
A568 anti-rabbit, origin donkey	Thermo Fisher	A10042	Dilution 1 in 500
Other Reagents
Shigella flexneri			Available from various laboratories by request
Tryptone Casein Soya (TCS) broth	BD Biosciences	211825	Standard growth medium for Shigella, application - bacterial growth
TCS agar	BD Biosciences	236950	Standard growth agar for Shigella, application - bacterial growth
Congo red	SERVA Electrophoresis GmbH	27215.01	Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application - bacterial growth
Poly L lysine	Sigma-Aldrich	P1274	Useful to coating bacteria to increase infection, application - infection
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397	Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application - infection
HEPES	Life Technologies	15630-056	PH buffer useful when cells are incubated at room-temperature, application - cell culture
DMEM	Life Technologies	31885	Standard culture medium for HeLa cells, application - cell culture
Fetal calf serum	Biowest	S1810-100	5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application - cell culture
Non-essential amino acids	Life Technologies	11140	1/100 dilution used for HeLa cell culture medium, application - cell culture
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650	Reagent diluent, application - cell culture
Sodium arsenite	Sigma-Aldrich	S7400	Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application - stress inducer
Clotrimazole	Sigma-Aldrich	C6019	Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application - stress inducer
PFA	Electron Microscopy Scences	15714	4% PFA is used for standard fixation of cells, application - fixation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application - permeabilization
A647-phalloidin	Thermo Fisher	A22287	Dilution is at 1/40, best added during 2ary antibody staining, application - staining
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application - staining
Parafilm	Sigma-Aldrich	BR701501	Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application - staining
Prolong Gold	Thermo Fisher	36930	Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application - mounting
Mowiol	Sigma-Aldrich	81381	Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting
24-well cell culture plate	Sigma-Aldrich	CLS3527	Standard tissue culture plates, application - cell culture
12-mm glass coverslips	NeuVitro	1001/12	Cell culture support for immunofluorescent applications, application - cell support
forceps	Sigma-Aldrich	81381	Cheap and obust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting
Programs and Equipment
Prism	GraphPad Software		Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application - data analysis
Leica SP5	Leica Microsystems		Confocal microsope, application - image acquisition
Imaris	Bitplane		Professional image analysis program, application - data analysis
Excel	Microsoft		Data analysis and graphing program, application - data analysis