포유류 세포의 박테리아 감염 후 스트레스 과립 형성의 면역 형광 분석

요약

우리는 세포가 박테리아와 여러 가지 스트레스에 도전을받은 후 포유류 세포에서 스트레스 과립 형성의 정성 및 정량 분석 ​​방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 광범위한 호스트 - 박테리아 상호 작용에서 세포 스트레스 과립 반응을 조사하는 데 적용 할 수 있습니다.

초록

세포 구성 요소의 형광 이미징은 숙주 - 병원체 상호 작용을 조사하는 효과적인 도구입니다. 병원균은 세포 소기관의 초 미세 구조, 세포 골격 네트워크 조직 및 스트레스 과립 (SG) 형성과 같은 세포 과정을 포함하여 감염된 세포의 다양한 특성에 영향을 줄 수 있습니다. 어떻게 병원균이 숙주 과정을 파괴하는지에 대한 특성 규명은 발병 기전의 중요하고 필수적인 부분이다. 다양한 표현형이 쉽게 볼 수 있지만, 병원균 공격에 의해 유발 된 세포 구조의 질적 및 양적 차이에 대한 정확한 분석은 실험 및 대조군 시료간에 통계적으로 중요한 차이를 정의하는 데 필수적입니다. SG 형성은 항 바이러스 반응을 유도하는 진화론 적으로 보전 된 스트레스 반응이며, 바이러스 감염을 이용하여 오랫동안 연구되어왔다. SG 형성은 또한 신호 계통에 영향을 미치고 다른 아직 알려지지 않은 conseq² . 박테리아 병원균과 같은 바이러스 이외의 병원균에 대한 스트레스 반응의 특성화는 현재 연구의 새로운 영역 ³ 입니다. 현재 바이러스 성 시스템에서도 SG 형성에 대한 정량 분석과 정성 분석은 아직 일상적으로 사용되지 않고 있습니다. 여기서 우리는 다양한 외인성 응력에 대응하여 SGs의 형성에 영향을주는 세포 독성 세균 병원체에 감염된 세포 및 감염되지 않은 세포에서 SG 형성을 유도하고 특징 화하기위한 간단한 방법을 기술한다. SG 생성 및 구성 분석은 다양한 SG 마커와 오픈 소스 이미지 분석 도구 인 ICY의 스팟 디텍터 플러그인을 사용하여 이루어집니다.

서문

세포 수준에서 숙주 - 병원체 상호 작용을 시각화하는 것은 병원성 전략에 대한 통찰력을 얻고 주요 세포 경로를 확인하는 강력한 방법입니다. 사실 병원균은 중요한 세포 표적이나 구조를 정확히 찾아내는 도구로 사용될 수 있습니다. 병원균은 생존이나 번식을위한 전략으로 중앙 세포 과정을 파괴하기 위해 진화했습니다. 형광 성분을 가진 숙주 단백질을 재조합 적으로 발현시킴으로써 세포 성분의 시각화를 달성 할 수 있습니다. 이것은 실시간 분석을 가능하게하지만, 특이 적으로 표지 된 숙주 단백질을 갖는 세포주의 생성은 매우 힘들고 바람직하지 않은 부작용을 초래할 수있다. 다중 항원 인자를 동시에 분석 할 수 있고 특정 세포 유형에만 국한되지 않기 때문에 특정 항체를 사용하여 세포 인자를 검출하는 것이 더 편리합니다. 단점은 immunofluorescence 분석은 숙주 세포 고정을 필요로하기 때문에 고정보기 만 캡처 할 수 있다는 것입니다이온. 그러나, immunofluorescence 이미징의 중요한 장점은 쉽게 질적 및 양적 분석 모두에 도움이된다는 것입니다. 이것은 차례로 호스트 - 병원체 상호 작용에 대한 새로운 통찰력을 제공하기 위해 통계적으로 중요한 차이를 얻는 데 사용될 수 있습니다.

형광 이미지 분석 프로그램은 3D 및 4D 분석을 수행하는 강력한 분석 도구입니다. 그러나 소프트웨어 및 유지 보수 비용이 높기 때문에 무료 오픈 소스 소프트웨어를 기반으로 한 방법이 더 널리 알려집니다. 생체 분석 소프트웨어를 사용하여 신중한 이미지 분석은 시각적 분석을 실체화하고 통계적 유의성을 부여 할 때 주어진 표현형의 정확성에 대한 신뢰도를 높이기 때문에 가치가 있습니다. 이전에는 SG가 무료 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석되었으므로 개별 SG를 수동으로 식별해야했습니다 ⁴ . 여기에 우리는 bac의 맥락에서 세포 SG 형성의 유도와 분석을위한 프로토콜을 제공한다.(http://icy.bioimageanalysis.org)를 사용하여 테리아 (terial) 감염을 예방할 수 있습니다. 바이오 이미지 분석 소프트웨어에는 SG 분석에 매우 적합한 스팟 디텍터 프로그램이 내장되어 있습니다. 지정된 관심 영역 (ROI)에서 자동화 된 탐지 프로세스를 미세 조정할 수 있습니다. 이는 개별 SG에 대한 수동 분석의 필요성을 극복하고 샘플링 편차를 제거합니다.

많은 환경 적 스트레스는 직경이 0.2 - 5 μm 인 상 고밀도 세포질, 비막 성 구조 인 SGs의 형성을 유도한다. 이 세포 반응은 효모, 식물 및 포유 동물에서 진화 적으로 보존되며 전 세계 단백질 번역이 금지 될 때 발생합니다. SG 로의 stalled translation initiation complex의 응집을 포함하며, SG는 translationally-inactive mRNA의 보유 장소로 간주되어 세포 mRNA의 일부를 선택적으로 번역 할 수있다.스트레스를 제거하면 SG가 분해되고 단백질 합성의 전체 속도가 재개됩니다. SG는 정확한 신랄한 구성이 적용되는 응력에 따라 달라질 수 있지만 번역 신생 개시 인자, RNA 대사에 관여하는 단백질, RNA 결합 단백질, 그리고 스 캐 폴딩 단백질 및 숙주 세포 신호 전달에 관련된 인자로 구성된다. SG 형성을 유도하는 환경 요인으로는 아미노산 결핍, 자외선 조사, 열 쇼크, 삼투압 쇼크, 소포체 세균 스트레스, 저산소증 및 바이러스 감염 ^{2 , 7 , 8이있다} . 박테리아, 곰팡이 또는 원충 병원체와 같은 다른 병원체가이 세포 성 스트레스 반응에 어떻게 영향을 미치는지에 대해서는 아직 거의 알려지지 않았지만 바이러스가 유도하는 방법과 SG 형성을 파괴하는 방법에 대한 많은 진전이있었습니다.

시게lla flexneri는 사람의 그람 음성 음성 매개 성 세포질 병원체이며 심한 설사 또는 세균성 경화증의 원인균이다. 이질균증은 주요 공중 보건 부담이며 5 세, ⁹ 세 이하의 어린이에서 매년 2 만 8 천명의 사망자를 발생시킵니다. S. flexneri 는 결장 상피를 감염시키고 숙주의 세포 골격 구성 요소 ^{11 , 12} 를 하이재킹하여 세포 대 세포를 퍼집니다. 상피의 감염은 세포질 내에서의 플레 서 네리 ( flexneri) 의 복제를지지하지만, 감염된 대식 세포는 열광 증 (pyroptosis)이라 불리는 염증 세포 사멸 과정을 통해 사망한다. 감염은 호중구와 열, 산화 스트레스 및 조직 파괴를 동반하는 심한 염증의 대규모 모집으로 이어집니다. 따라서, 감염된 세포는 골지사 파괴, 유전 독성 스트레스 및 세포 골격 재 배열과 같은 감염에 의해 유도 된 내부 스트레스를받는 반면감염된 세포는 또한 염증 과정으로 인해 환경 스트레스를받습니다.

다수의 SG 마커를 사용하여 환경 스트레스에 반응하는 세포의 능력에 대한 S. flexneri 감염의 특성화는 감염이 SG 조성 ^3의 질적 및 양적 차이를 유도한다는 것을 입증했다. 그러나 다른 박테리아 병원균에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 여기에서 우리는 cytosolic 병원체 S. flexneri , 다른 환경 스트레스와 세포의 스트레스, SG 구성 요소의 표시 및 감염의 맥락에서 SG 형성과 구성의 질적 및 정량 분석과 숙주 세포의 감염에 대한 방법론을 설명합니다 및 비 감염 세포. 이 방법은 다른 세균 병원균에 널리 적용 할 수 있습니다. 또한, SG 형성의 이미지 분석은 바이러스 또는 다른 병원균에 의한 감염에 사용될 수있다. SG를 분석하는 데 사용할 수 있습니다.감염시의 형성 또는 외인성 응력에 대한 SG 형성에 대한 감염의 효과.

프로토콜

1. 박테리아 및 숙주 세포의 제조

1. 실험 조건 당 1 개의 우물을 세는 무균 핀셋으로 24 또는 12-well 플레이트에서 12 또는 14 mm 유리 커버 슬립을 각각 옮깁니다. 15 분 동안 조직 배양 후드에서 자외선 처리로 이들을 소독하십시오.
   참고 : 외인성 스트레스에 의한 박테리아 감염 및 SG 유도에 대한 대조구를 포함하십시오.
2. 12mm coverslips가있는 24-well plate의 경우 coverslips에 1 x 10 ⁵ 포유류 세포 ( 예 : HeLa 세포)를 뿌립니다. 멸균 피펫 팁으로 coverslips을 누르십시오. 세포가 각 세포 유형에 적합한 문화 매체 5 % 이산화탄소 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 하룻밤 접착하자.
   참고 : 세포의 합류가 다음날 40-60 % 사이가되도록 플레이트 세포.
   1. HeLa 세포의 경우 비 필수 아미노산 (NEAA)과 10 % 분해 태아 송아지 혈청 (FCS)을 포함한 Dulbecco의 Modified Eagle Medium (DMEM)에서 배양하십시오.56 ° C 수조에서 30 분 동안 가열하여 FCS를 해체하고, 15 분 후에 한 번 혈청을 소용돌이 친다.
3. 박테리아를 줄이기 위해, 멸균 피펫 팁을 사용하여 -80 ° C의 냉동고에 보관 된 박테리아 글리세롤 스톡 (20 % 글리세롤)에서 소량을 제거하고 라벨 판에 놓습니다. 플레이트의 약 10 % 이상에서 박테리아를 퍼지려면 살균 루프를 사용하십시오. 새로운 멸균 루프를 사용하여 얼룩을 통해 드래그하여 3 개의 평행선을 만듭니다. 이 판을 통해 줄을 긋고 나머지 판을 덮습니다. 37 ℃에서 플레이트 O / N을 배양한다.
   1. 신선하게 줄무늬가있는 판에서 단일 박테리아 식민지 ( 예 : S. flexneri )를 선택하십시오. 1 주 이상 된 세균성 콜로니로 작업하지 마십시오.
   2. S. flexneri 균주 M90T의 경우, 새롭게 줄무늬가있는 Tryptic Soy Agar-0.1 % 콩고 레드 한천 플레이트를 15 mL 튜브에서 Tryptic Soy broth 8 mL에 식민지로 접종한다. 뚜껑을 조이고 30 분에 222 rpm O / N에서 흔들어주십시오.6; C.
      주의 : 독성 플라스미드를 잃어서 감염성이 없기 때문에 큰 백색의 콜로니를 사용하지 마십시오.

2. 숙주 세포의 박테리아 적 도전

1. 박테리아를 준비하여 감염 가능성을 극대화하십시오.
   1. S. flexneri 들어 , 8 ML 트립신 간장 한천에 150 μL O를 / N 문화를 추가하여 subculture 박테리아와 지각 유전자 발현을 유도하고 감염을 강화하기 위해 늦은 지수 단계 (~ 2 H) 37 ° C에서 222 rpm으로 흔들어 품어.
      1. 배양 물이 0.6과 0.9 사이의 광학 밀도 (600 nm에서 측정)에있을 때, 1.5 mL 튜브에 1 mL의 배양 물을 옮긴다. OD ₆₀₀ = 1 일 때 8,000 xg에서 2 분간 펠렛 박테리아를 만들고 OD ₆₀₀ = 1 일 때 감염 배지 (NEAA가있는 DMEM, FCS가없는 DMEM)에 재현 탁합니다. 따라서 OD ₆₀₀ 이 0.85이면 850 μL로 재현하십시오.
         참고 : S. flexneri의 경우 , OD ₆₀₀ = 1 일 때, mL 당 8 x 10 ⁸ 박테리아가 존재합니다.배지 8 mL에서 배양 하였다. 20의 다중도 감염 (MOI)이 적절합니다. 다른 병원체의 경우, OD ₆₀₀ 에서의 mL 당 박테리아 수와 적절한 MOI는 경험적으로 결정될 필요가있다.
   2. 박테리아와 숙주의 상호 작용을 향상시키기 위해 박테리아를 Poly-L-Lysine (PLL)으로 코팅하십시오.
      참고 : S. flexneri 의 PLL 처리는 SG 역학에 아무런 영향을 미치지 않았습니다. 다른 병원균은 PLL 치료에 대한 복종 가능성을 평가해야합니다.
      1. 박테리아를 PLL로 코트하려면 8,000 xg에서 2 분 동안 박테리아 배양액 1 mL를 원심 분리하고 OD ₆₀₀ = 1에서 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)의 10 μg / mL PLL에 펠렛을 다시 현탁하십시오.
      2. 12 잘 접시 이내 우물과 같은 작은 접시에 박테리아 솔루션을 추가하고 접시 셰이커에 온화한 동요와 RT (~ 20 ° C) 10 분 품어.
      3. 8,000 xg에서 2 분 동안 펠렛 박테리아가 과도한 PLL을 제거합니다. 1 ML PBS에 펠렛을 Resuspendd이 세척 단계를 두 번 반복하십시오. 최종 세척 후 OD ₆₀₀ = 1의 감염 배지에 재현 탁하십시오.
         참고 : 여기에서, flexneri에 대한 감염 매체는 FCS가없는 20 mM HEPES를 갖는 숙주 세포 배지이다.
2. 세균 감염을위한 세포 준비.
   1. 흡입 펌프를 사용하여 포유류 HeLa 세포에서 배지를 제거하십시오. 흡입 펌프를 사용하여 세포, 소용돌이, 제거 매체를 씻어 500 μL RT HeLa 세포 배지를 추가하고 500 μL RT 적절한 감염 매체 ( 예 : FCS가없는 20 mM HEPES의 숙주 세포 배지)로 교체하십시오.
   2. 참고 : 모든 세척 단계에서 신속하게 작업하고 세포가 완전히 건조되지 않도록 한 번에 최대 4 개의 커버 슬립 만 처리하십시오.
3. 도전 과제는 HeLa 세포에 박테리아를 넣어 20-50 %의 세포를 감염시키는 것입니다.
   참고 : 각 박테리아 종에 대해 적절한 시간과 MOI를 결정해야합니다. 일반적으로 좋은 시작은 37 분 30 분입니다.° C (MOI 10).
   1. S. flexneri 들어, 두 가지 방법 중 하나를 사용하여 HeLa 세포 세포에 도전 (2.3.1.1 또는 2.3.1.2 단계).
      1. 13,000 x g에서 10 분 동안 세포에 비 PLL 처리 박테리아 (500 μL 배지에서 24- 웰 플레이트의 OD ₆₀₀ = 1 / 웰 20 ㎕)를 스핀.
      2. 박테리아가 세포에 정착 수 있도록 RT에서 15 분 동안 PLL로 코팅 박테리아 (OD ₆₀₀ = 1 / 웰 500 μL 매체에 1 / 잘 15 μL)를 추가합니다.
   2. 30 분 37 ° C 조직 배양 보육에 정착 박테리아와 세포를 배치하여 감염을 허용합니다.
      참고 : 짧은 시간 동안, 조직 배양 배양기 대신에 37 ℃의 수조에 15 분 동안 플레이트를 놓아서 S. flexneri 감염을 동기화시킵니다.
4. 세포를 세척하여 감염을 중지하십시오.
   1. 세포를 씻고 여분의 박테리아를 제거하려면 흡입 펌프를 사용하여 배지를 제거하고 1 mL신선한 예비 (37 ℃) HeLa 배양 배지 (DMEM, 10 % FCS, NEAA). 매체를 선회시키고 신선한 매체로 제거하고 교체하십시오. 두 번 반복하고 세포에 신선한 매체를 남겨주세요.
      1. S. flexneri 또는 기타 세포 내 박테리아의 경우 HeLa 세포 및 세척 후 50 μg / mL gentamicin이 포함 된 표준 조직 배양 배지로 배지를 교체하여 세포 외 박테리아를 죽이고 더 이상의 세포 침입을 방지하십시오.
         참고 : 세포 외 박테리아를위한 배지에 항생 물질을 첨가하지 마십시오.
5. 조직 배양 배양기에서 원하는 시간 동안 박테리아를 세포와 함께 부화시킵니다.
   참고 : S. flexneri의 경우 감염은 세포 유형에 따라 6 시간까지 길어질 수 있습니다. HeLa 세포의 경우 SG 형성을 유도하기 위해 외인성 스트레스를 가하기 전에 1.5 ~ 2 시간 동안 감염을 진행하십시오. Shigella 가 세포 대 세포로 퍼지는 Caco-2 감염의 경우 외인성 스트레스를 가하기 전에 30 분에서 6 시간 동안 감염됩니다. Ce박테리아 감염의 결과로서 SG의 형성을 평가하기 위해 외인성 응력을 가하지 않고이 지점에서 고정시킬 수있다 (이 경우, 4 절을 진행한다).

3. 외인성 스트레스의 첨가에 의한 스트레스 과립 형성 유도

1. 흡입 펌프를 사용하여 감염된 및 감염되지 않은 HeLa 세포에서 배지를 제거하고 배지를 수질 조절제가 있거나없는 적절한 배지 500 μL로 대체하고 배양하십시오.
   참고 : 스트레스를 유발하는 조건은 다음을 포함합니다 (아래 참조). 추가적인 치료법은 Kedersha et al . ¹³ .
   1. 열충격 치료를 위해서는 20 mM HEPES가 함유 된 일반 배지를 사용하고 30 분 동안 44 ° C 수 욕조에 넣으십시오.
   2. clotrimazole (mitochondrial 스트레스를 유도) 치료를 위해서는 20 μM clotrimazole와 FCS없이 일반 매체를 사용하고 조직 배양기에서 1 시간 동안 품어.
      참고 : 20m의 일회 사용 분취 량을 보관하십시오최대 4 개월 동안 -20 ℃에서 디메틸 술폭 시드 (DMSO) 중 M 클로 트리 마졸 축적량. 제어 세포에는 DMSO 비히클을 사용하십시오.
   3. 비산회 (산화 스트레스 유도) 치료를 위해서는 0.5 μM 아비산 (arsenite)과 함께 표준 배지를 사용하고 1 시간 동안 조직 배양기에서 배양하십시오.
      주의 사항 : -20 ℃에서 0.5 mM arsenite의 단일 사용 분취 액을 6 개월 동안 보관하십시오.
      주의 : Clotrimazole과 arsenite는 환경에 해롭고 위험하며 적절하게 폐기되어야합니다.
   4. Des-Methyl Des-Amino (DMDA) - Pateamine 처리 (진핵 세포의 번역 개시를 억제 함)의 경우, DMDA-pateamine 50-200 nM과 함께 표준 배지를 사용하고 조직 배양기에서 1 시간 동안 항온 배양하십시오.
      참고 : DMDA-pateamine은 -80 ° C에서 보관하십시오. 동결 융해를 피하기 위해 시약을 작은 분량으로 저장하십시오.

4. 응고 과립 형성의 고정 및 Immunofluorescence 분석

참고 : 컨트롤 및실험적인 coverslips 동시에 후속 단계에서 이미지 분석에 영향을 미칠 수있는 얼룩을 피하기 위해. 대조군 시료는 SG 유도 처리 유무에 상관없이 감염을 포함하지 않으며 감염된 시료는 SG 유무에 관계없이 처리를 유도한다.

1. 흡입 펌프를 사용하여 배지를 완전히 제거하고 PBS에 0.5 ML RT 4 % paraformaldehyde (PFA)를 추가하여 시료를 고정하십시오. RT에서 30 분 동안 품어 낸다.
   주의 : PFA는 핸들러 및 환경에 유해합니다. 취급자를 보호하고 화학 폐기물로 처리하기 위해 적절한 조치를 취하십시오.
   참고 : 또는 15 분 동안 고정한 다음 SG 마커 ¹³ 의 세포질 내 위치를 유지하기 위해 10 분 동안 사전 냉각 된 메탄올 -20로 교체하십시오.
2. 피펫으로 PFA를 제거하고 액체를 적절한 폐기 용기에 폐기하십시오. 1 ML 트리스 - 버퍼 식염수 (TBS : 25 MM 트리스, 산도 7.3, 15 MM NaCl)와 coverslip을 씻으십시오. 온화한 흔들림으로 2 분 동안 coverslip을 품어 라.세척하는 동안 접시 쉐이 커에.
3. 흡입 펌프를 사용하여 TBS를 완전히 제거하고 세포를 permeabilize하기 위해 10 분 동안 TBS에 500 μL 0.3 % Triton - X100을 추가합니다.
4. 흡입 펌프로 투과성 용액을 제거하십시오. 1 ML TBS로 교체, 부드럽게 판을 소용돌이, 흡입하여 TBS를 제거하고 1 ML 차단 솔루션 (TBS에 5 % FCS) RT에서 1 시간 추가합니다.
5. TBS의 5 % FCS에서 1 차 항체 용액 (1 : 300으로 희석)을 준비한다. 12mm coverslip 당 50 μL를 계산하고 한 배치에있는 모든 coverslips에 대한 충분한 확인합니다.
   참고 : 사용되는 일반적인 일차 항체는 G3BP1, eIF3b 및 TIA1을 대상으로합니다.
6. 1 차 항체 50 μL를 플라스틱 파라핀 필름 (parafilm) 위에 넣고 벤치 나 챔버에 단단히 붙입니다.
   참고 : 정식 SG 마커 목록은 재료 표에 나와 있지만 SG의 구성은 적용되는 응력에 따라 달라질 수 있습니다. 다른 SG 마커는 Kedersha et al. ¹³ S. flexneri 감염에 대한 여러 SG 마커에 대한 예상 결과가 표 1에 나와 있습니다.
7. 족집게로 coverslip을 집어 들고, coverslip의 조직을 조직에 가볍게 두드리고, 과도한 액체를 제거하기 위해 족집게를 잠시 놓고, 방울에 얼굴을 가볍게 내려 놓으십시오. coverslips를 RT에서 1.5 시간 또는 4 ℃에서 밤새도록 보온하십시오.
   참고 : 습기가있는 챔버를 준비하려면 플라스틱 파라핀이 놓인 단단히 닫힌 챔버의 가장자리를 따라 사전에 습윤 된 조직을 놓으십시오.
8. 1 ML TBS로 가득 새로운 24 잘 접시의 우물에 핀셋과 각 coverslip을 전송, 플레이트 셰이커에서 5 분간 부드럽게 흔들어 부화 시키십시오. 흡입 펌프를 사용하여 각 우물에서 TBS를 흡입하고, 1 mL TBS로 교체하고 5 분 동안 플레이트 셰이커에 놓습니다. 한 번 더 세탁을 반복하십시오.
   참고 : 파라핀을 재사용하려면 여분의 액체를 티슈로 닦고 물로 씻으십시오. 파라핀 필름이 사용 전에 완전히 건조되었는지 확인하십시오.후속 염색 단계.
9. TBS (희석 1 : 500 - 1 : 2,000)에서 2 차 항체 용액을 준비합니다. 핵과 박테리아를 얼룩이려면 2 μg / mL DAPI를 혼합액에 첨가하십시오. 굴지를 염색하려면 형광 phalloidin을 첨가하십시오. 플라스틱 파라핀 필름에 50 μL 보조 항체 믹스를 피펫.
   참고 : G3BP1 (염소 항체)을 사용하는 경우 서로 다른 SG 표지자에 대한 공동 위치 연구를 위해 고도로 정제 된 교차 흡수 당나귀 2 차 항체의 사용을 권장합니다. 중첩되지 않는 스펙트럼을 가진 형광 표지 된 2 차 항체를 선택하십시오. eIF3b는 분명히 세포의 세포질을 얼룩지게하므로 세포를 묘사하는 데 좋은 마커입니다. 악틴의 얼룩은 세포 간 접촉 사이트와 박테리아 진입 영역에서 세포를 묘사하는 데 더욱 도움이됩니다.
10. 족집게로 coverslip을 들고, 과도한 액체를 제거하기 위해 coverslip의 가장자리를 조직에 집어 넣고 핀셋을 짧게 뗍니다. 부드럽게 방울 위에 coverslip 얼굴을 배치하고 coverslips를 품어어둠 속에서 1 시간 동안 실온에서 방치 하였다.
11. 핀셋을 사용하여 신선한 1 ML PBS로 가득 24 잘 접시에 다시 coverslip을 놓으십시오. coverslip가 PBS로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오. 5 분 동안 부드럽게 흔들어 세포를 3 번 ​​씻으십시오.
    참고 : 이차 항체의 형광 물질이 빛에 민감하므로 빛을 보호하기 위해 씻어내는 동안 덮개 아래에 판을 두십시오.
12. 짧게 탈 이온수에 coverslip을 담그고 소금을 제거하고 조직에서 가장자리에서 말린 후 유리 슬라이드에 형광 장착 매체 5 μL 위에 coverslip을 올려 놓습니다. 매니큐어를 사용하여 이미징하기 전에 coverslip을 봉인하십시오. 슬라이드는 단기간 (주간)에는 4 ° C, 장기간 (월간) 보관에는 -20 ° C로 유지하십시오.
    참고 : 이미지 품질을 해칠 수 있으므로 밀봉 할 때 공기 방울을 피하십시오.

5. 형광 이미징

참고 : 설정의 최적화는 현미경의 사용 설명서를 참조하십시오.

1. 40 또는 63X 오일 침지 렌즈를 사용하여 공 촛점 현미경을 사용하여 이미지를 수집하십시오. 이미지 수집을 위해 원하는 형광 채널을 선택하십시오. 다중 형광 채널을 사용하는 경우 순차 수집 모드를 선택하십시오.
   참고 : 이후 샘플에서 과다 노출을 피하기 위해 SG가 가장 강하게 유도 된 실험 샘플부터 시작하십시오. 셀의 전체 깊이에 과다 노출 된 SG가 없도록하십시오.
   1. 이미지 분석의 정확성을 보장하기 위해 현미경 설정 내에서 비트 크기를 12 이상으로 설정하십시오.
   2. 셀의 전체 깊이를 커버하도록 이미지 스택을 설정하십시오. 다른 채널을 체크인하고 다른 SG 마커를 사용하여 전체 범위가 포함되도록하십시오. 스택의 시작 부분을 셀의 바닥에 놓고 스택 상단을 SG 마커가 더 이상 보이지 않는 셀 상단의 높이에 놓습니다.
   3. 스택을 획득하십시오. 모든 이미지에 대해 스택 높이를 동일하게 유지하십시오.
      참고 :후속 비교에 사용되는 대조 샘플과 실험 샘플 사이의 수집 설정을 변경하십시오.

6. 이미지 분석

참고 : 여기서 프리웨어 ICY를 사용하여 접힌 스택에 대한 SG 분석이 설명됩니다. 3D 재구성의 이미지 분석은 다른 전문 소프트웨어를 사용하여 수행 할 수도 있습니다. SG 검출은이 프로토콜에 대해 설정된 완전 자동화 된 작업 흐름을 통해 수행 될 수 있습니다 (http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/Stress_granule_detection_in_fluorescence_imaging에서 사용 가능). 이 프로토콜을 사용하려면, 핵은 소프트웨어에 대한 DNA 얼룩으로 각 세포의 중심을 찾을 수 있어야하고 세포 가장자리는 세포질 마커 (예 : eIF3b) 또는 소프트웨어에 대한 액틴 얼룩으로 표시해야합니다 셀 경계를 식별합니다. 자동 워크 플로우를 사용하여 수동으로 유도 된 결과의 유효성을 검사하거나 셀 경계가 높은 신뢰도로 감지 된 경우 분석을 위해 직접 확인할 수 있습니다.세포의 밀도와 세포 경계를 검출하는 데 사용되는 마커에 의존한다.

1. ImageJ 또는 피지를 사용하여 이미지 스택을 축소 (이미지> 스택> Z 프로젝션)하고 .tiff 파일로 저장합니다.
   참고 : 이미지 분석 소프트웨어가 결과를 원본 이미지의 사이트에 연결하므로 각 이미지에 대해 새 폴더를 만듭니다.
2. 컨트롤 및 실험 .tiff 이미지를 이미지 분석 플랫폼 (파일> 열기)에로드합니다. 시퀀스 창으로 이동합니다. "조회 테이블"에서 채널 매개 변수까지 아래로 스크롤하십시오.
3. 모든 채널 탭의 확인란을 클릭하여 모든 채널을 비활성화하십시오. 채널 0을 클릭 한 다음 위의 색상 막대를 클릭하여 원하는 색상을 선택하십시오. 강도 필드에서 선을 클릭하고 이동하여 모든 구조를 보려면 필요에 따라 채널의 강도를 높이십시오. 모든 채널에 대해이 단계를 반복하십시오.
   참고 : 샘플 분석에서 바이어스를 최소화하기 위해 주어진 작업에 필요하지 않은 채널을 비활성화하십시오.
4. 스크롤캔버스 탭 내에서 확대 / 축소 탭을 조정하여 필드 당 약 10 개의 셀로 확대하십시오.
5. 폴리곤 함수 도구 (상단 막대에 있음)를 사용하여 이미지의 셀 경계를 윤곽을 그립니다. 세포 경계 묘사 ( 예 : eIF3b)에 액틴 얼룩이나 세포질 마커를 사용하십시오.
   1. "파일 및 ROI"도구에서 다각형 기능을 클릭하십시오. 셀을 클릭하여 묘사를 시작한 다음 셀 경계를 반복하여 클릭하여 앵커를 만들어 선을 연장합니다. ROI를 완료하려면 "파일 및 ROI"도구 내의 다각형 기능을 다시 클릭하십시오.
      참고 : 감염된 윤곽이 표시된 세포의 하위 집단을 확인하십시오. 샘플은 감염된 세포와 감염되지 않은 세포가 혼합되어 구성됩니다. 박테리아를 확인하려면 DAPI 얼룩이나 형광 박테리아 (예 : GFP 발현 박테리아)를 사용하십시오. 모든 박테리아가 보이는지 확인하기 위해 강도를 높이십시오.
   2. ROI 이름을 지정하려면 오른쪽의 ROI 창으로 이동하고 click 이미지의 관심 세포에. 그러면 ROI 탭의 해당 ROI가 강조 표시됩니다. ROI 이름을 두 번 클릭하고 이름을 수정하십시오 ( 예 : 감염된 셀 # 1).
      참고 : 하나의 이미지를 감염된 세포와 감염되지 않은 세포를 모두 분석하는 데 사용하려면 두 개의 개별 폴더에 이미지를 저장하고 감염된 세포와 감염되지 않은 세포를 구분하여 구분하여 분석을 용이하게하는 두 개의 다른 스프레드 시트를 생성하는 것이 더 쉽습니다 후에.
6. "탐지 및 추적"탭 (상단 막대)에서 스팟 감지기 응용 프로그램을 엽니 다. 입력 탭에서 현재 이미지가 선택됩니다. 아무것도 바꾸지 마십시오. 전처리 탭에서 분석 할 채널을 선택하십시오.
   참고 : 한 번에 하나의 채널 만 분석 할 수 있습니다. 만족스러운 결과를 얻기 위해 매개 변수가 검사 된 완전 자동화 된 분석 순서를 사용하는 경우 배치 분석을 선택할 수 있습니다.
   1. 감지기 탭에서 "De어두운 배경 위에 밝은 반점을 찍는다. "그런 다음 적절한 스케일과 감도를 선택하십시오. 컨트롤과 실험 샘플 모두에서 서로 다른 설정과 교차점 검사를 테스트하여이를 수행하십시오.
      참고 : 해상도가 2,048 x 2,048이고 픽셀 크기가 0.12 μm ² 인 이미지의 경우 감도가 25 ~ 100 인 레벨 2 임계 값이 일반적으로 적합하지만 각 SG 마커는 경험적으로 테스트해야합니다. 처리되지 않은 대조군 샘플에서 반점이 검출되지 않도록 반점 탐지를 설정하고, SG가있는 실험 샘플에서는 모든 작은 및 큰 SG를 계수한다.
   2. 투자 수익 (ROI) 탭에서 추천 투자 수익 (ROI)을 선택하십시오. 필터링 탭에서 필터링 없음을 선택하십시오. 출력 탭에서 적절한 출력을 선택하십시오.
      참고 : 특정 파일 사용을 선택하면 다양한 탐지 조건 또는 다른 채널을 저장하는 데 도움이됩니다. ROI와 탐지로 이진 이미지와 원본 이미지를 내보내도록 선택하면 hel품질 관리 분석을 위해 충분하지 않습니다.
   3. "이전 명소를 ROI로 렌더링 제거"를 선택하십시오. "선택한 파일 없음"버튼을 클릭하여 파일을 저장할 폴더를 선택하십시오. 디스플레이 탭에서 원하는 옵션을 선택하십시오. "검색 시작"을 클릭하십시오.
      참고 : 내 보낸 이미징 옵션이 포함 된 이름과 위치가 선택된 폴더가 생성됩니다. 이러한 이미지는 테스트 된 새로운 각 조건에 대해 덮어 쓰게됩니다. 이미지를 유지하려면 폴더 이름을 변경하여 새 폴더를 만들거나 저장 폴더의 이미지를 새 폴더로 전송하십시오. 이미지의 품질 관리를 위해 디스플레이 감지 마크, ROI 감지 수 및 ROI 번호 및 이름을 선택하는 것이 좋습니다.
7. 테스트 한 각 이미지 또는 조건에 대해 생성 된 스프레드 시트를 사용하여 여러 매개 변수에 대한 데이터를 통합하고 저장하십시오.
   참고 : 분석 할 매개 변수에는 ROI 당 SG 수, SG 표면적 및 SG 최대치가 포함됩니다imum, 평균 및 최소 강도.
8. 데이터를 전송하고 통계적 유의성을 분석, 그래프 화 및 결정할 수있는 분석 프로그램을 사용하여 분석하십시오.

결과

이 원고에 설명 된 프로토콜을 설명하고 설명하기 위해 우리는 세포질 병원체 S. flexneri에 감염되었거나 감염되지 않은 HeLa 세포에서 clotrimazole 유도 된 SG의 이미지를 특징으로했습니다. 이 절차의 개요는 그림 1 에 나와 있으며 콩고 레드 플레이트에 박혀 있는 독성과 무해한 S. flexneri , 박테리아 준비, 감염, 환경 스트레스 추가, ?...

토론

여기에 설명 된 프로토콜은 외인성 스트레스의 존재 또는 부재 하에서 cytosolic 병원체 S. flexneri 에 감염된 세포 및 감염되지 않은 세포에서 SG의 유도, 국소화 및 분석을 설명합니다. 자유 이미징 소프트웨어를 사용하여 프로토콜은 주어진 phenotypes의 차이를 식별하고 통계적으로 처리하기 위해 SG 형성에 대한 정확한 질적 및 양적 분석을 허용합니다.

감염, SG 유도 및 영...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary Antibodies
eIF3b (N20), origin goat	Santa Cruz	sc-16377	Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1 in 300
eIF3b (A20), origin goat	Santa Cruz	sc-16378	Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1 in 300
eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal)	Cell Signaling	3411	Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1 in 800
eIF4AI, origin goat	Santa Cruz	sc-14211	Recommended by (Ref # 13). Dilution 1 in 200
eIF4B, origin rabbit	Abcam	ab186856	Good stress granule marker in our hands. Dilution 1 in 300
eIF4B, origin rabbit	Cell Signaling	3592	Recommended by Ref # 13. Dilution 1 in 100
eIF4G, origin rabbit	Santa Cruz	sc-11373	Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1 in 300
G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal)	BD Biosciences	611126	Widely used SG marker. Dilution 1 in 300
Tia-1, origin goat	Santa Cruz	sc-1751	Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1 in 300
Alexa-conjugated Secondary Antibodies
A488 anti-goat , origin donkey	Thermo Fisher	A-11055	Cross absorbed. Dilution 1 in 500
A568 anti-goat, origin donkey	Thermo Fisher	A-11057	Cross absorbed. Dilution 1 in 500
A488 anti-mouse, origin donkey	Thermo Fisher	A-21202	Dilution 1 in 500
A568 anti-mouse, origin donkey	Thermo Fisher	A10037	Dilution 1 in 500
A647 anti-mouse, origin donkey	Thermo Fisher	A31571	Dilution 1 in 500
A488 anti-rabbit, origin donkey	Thermo Fisher	A-21206	Dilution 1 in 500
A568 anti-rabbit, origin donkey	Thermo Fisher	A10042	Dilution 1 in 500
Other Reagents
Shigella flexneri			Available from various laboratories by request
Tryptone Casein Soya (TCS) broth	BD Biosciences	211825	Standard growth medium for Shigella, application - bacterial growth
TCS agar	BD Biosciences	236950	Standard growth agar for Shigella, application - bacterial growth
Congo red	SERVA Electrophoresis GmbH	27215.01	Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application - bacterial growth
Poly L lysine	Sigma-Aldrich	P1274	Useful to coating bacteria to increase infection, application - infection
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397	Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application - infection
HEPES	Life Technologies	15630-056	PH buffer useful when cells are incubated at room-temperature, application - cell culture
DMEM	Life Technologies	31885	Standard culture medium for HeLa cells, application - cell culture
Fetal calf serum	Biowest	S1810-100	5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application - cell culture
Non-essential amino acids	Life Technologies	11140	1/100 dilution used for HeLa cell culture medium, application - cell culture
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650	Reagent diluent, application - cell culture
Sodium arsenite	Sigma-Aldrich	S7400	Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application - stress inducer
Clotrimazole	Sigma-Aldrich	C6019	Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application - stress inducer
PFA	Electron Microscopy Scences	15714	4% PFA is used for standard fixation of cells, application - fixation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application - permeabilization
A647-phalloidin	Thermo Fisher	A22287	Dilution is at 1/40, best added during 2ary antibody staining, application - staining
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application - staining
Parafilm	Sigma-Aldrich	BR701501	Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application - staining
Prolong Gold	Thermo Fisher	36930	Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application - mounting
Mowiol	Sigma-Aldrich	81381	Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting
24-well cell culture plate	Sigma-Aldrich	CLS3527	Standard tissue culture plates, application - cell culture
12-mm glass coverslips	NeuVitro	1001/12	Cell culture support for immunofluorescent applications, application - cell support
forceps	Sigma-Aldrich	81381	Cheap and obust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting
Programs and Equipment
Prism	GraphPad Software		Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application - data analysis
Leica SP5	Leica Microsystems		Confocal microsope, application - image acquisition
Imaris	Bitplane		Professional image analysis program, application - data analysis
Excel	Microsoft		Data analysis and graphing program, application - data analysis