Memeli Hücrelerinin Bakteri Mücadelesinden Sonra Stres Granül Oluşumunun İmmünofloresan Analizi

Özet

Hücrelere bakterilerle ve birkaç farklı stresle meydan okuduktan sonra, memeli hücrelerinde stres granülü oluşumunun nitel ve nicel analizi için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, konakçı-bakteriyel etkileşimlerin geniş bir aralığında hücresel stres granül tepkisini araştırmak için uygulanabilir.

Özet

Hücresel bileşenlerin floresan görüntülemesi konakçı-patojen etkileşimlerini araştırmak için etkili bir araçtır. Patojenler, organelle ultrastrüktür, hücre iskeleti ağ organizasyonu ve ayrıca Stres Granülü (SG) oluşumu gibi hücresel işlemleri de içeren enfekte hücrelerin birçok farklı özelliğini etkileyebilir. Patojenlerin konakçı süreçleri nasıl alt üst ettirdiklerinin karakterizasyonu patojenez alanının önemli ve ayrılmaz bir parçasıdır. Değişken fenotipler kolayca görülebiliyor olsa da, patojen yüklemesiyle indüklenen hücresel yapıların nitel ve niceliksel farklılıklarının kesin analizi, deneysel ve kontrol örnekleri arasındaki istatistiksel olarak önemli farklılıkların tanımlanması için gereklidir. SG oluşumu, antiviral yanıtlara yol açan evrimsel olarak korunmuş bir stres tepkisidir ve uzun süredir viral enfeksiyonlar ¹ kullanarak araştırılmıştır. SG oluşumu aynı zamanda sinyal kaskatlarını da etkiler ve hala bilinmeyen diğer kavramlara sahip olabilir² . Bakteriyel patojenler gibi virüs dışındaki patojenlere karşı bu stres tepkisinin karakterizasyonu şu anda ortaya çıkan bir araştırma alanıdır ³ . Şimdilik, SG oluşumunun nicel ve nitel analizi henüz viral sistemlerde rutin olarak kullanılmamaktadır. Burada, çeşitli dışsal streslere yanıt olarak SG oluşumunu etkileyen enfekte olmayan hücrelerde ve bir sitozolik bakteriyel patojen bulaşmış hücrelerde SG oluşumunu indüklemek ve karakterize etmek için basit bir yöntem tarif ediyoruz. SG oluşumunun ve bileşiminin analizi, bir dizi farklı SG işaretleyicisi ve ICY'nin açık kaynak görüntü analiz aracı olan spot detektör eklentisi kullanılarak gerçekleştirilir.

Giriş

Konukçu patojen etkileşimlerini hücre seviyesinde görselleştirmek, patojenik stratejiler hakkında fikir edinmek ve anahtar hücresel yolları tanımlamak için güçlü bir yöntemdir. Gerçekten, patojenler önemli hücresel hedefleri veya yapıları saptamak için araçlar olarak kullanılabilirler, çünkü patojenler merkezi hücresel prosesleri kendi hayatta kalmaları veya yayılımı için bir strateji olarak yıkmaya dönüşmüştür. Hücresel bileşenlerin görselleştirilmesi, flüoresanla etiketlenmiş konukçu proteinleri rekombinant şekilde eksprese ederek gerçekleştirilebilir. Bu, gerçek zamanlı analiz yapmayı sağlarken, spesifik olarak etiketlenmiş konukçu proteinler ile hücre hatlarının üretilmesi oldukça zahmetlidir ve istenmeyen yan etkilere neden olabilir. Çoklu konukçu faktörlerin aynı anda analiz edilebileceği ve birinin belirli bir hücre tipi ile sınırlı olmadığından spesifik antikorları kullanan hücresel faktörlerin saptanması daha elverişlidir. Bir dezavantaj, immünofloresans analizi, konukçu hücre fiksatını gerekli kıldığı için yalnızca statik bir görünümü yakalayabilmesidiriyon. Bununla birlikte, immünofloresan görüntülemenin önemli bir avantajı, hem niteliksel hem de niceliksel analiz için kendini kolayca bulabilmesidir. Bu, konak-patojen etkileşimlerine yeni kavrayışlar sağlamak için istatistiksel olarak önemli farklılıklar elde etmek için kullanılabilir.

Floresan görüntü analiz programları 3D ve 4D analizini gerçekleştirmek için güçlü analitik araçlardır. Bununla birlikte, yüksek maliyetli yazılım ve bakımı, açık kaynaklı yazılımlara dayalı yöntemleri daha cazip kılmaktadır. Biyolojik analiz yazılımını kullanarak dikkatli bir görüntü analizi, görsel analizi desteklediği ve istatistiksel önemleri belirlerken belirli bir fenotipin doğruluğuna olan güvenini arttırdığı için değerlidir. Daha önce SG'ler, bağımsız SG'lerin elle tanımlanmasını gerektiren ücretsiz ImageJ yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir4. Burada, hücresel SG oluşumunun indüksiyonu ve analizi için bir protokol sağlıyoruz(ICO) (http://icy.bioimageanalysis.org) kullanılarak biyolojik enfeksiyonlara karşı korunma sağlar. Biyo-görüntü analiz yazılımı, SG analizi için oldukça uygun olan yerleşik bir spot detektör programına sahiptir. Belirli Bölgelerdeki (ROI'lar) otomatik algılama işleminin hassas ayarlanmasına izin verir. Bu, bireysel SG'lerin manuel analiz ihtiyacını ortadan kaldırır ve örnekleme yanlılığını kaldırır.

Birçok çevresel stres, 0,5 - 5 μm çapında ^{5 , 6} faz yoğun sitosolik, membranöz olmayan yapılar olan SG oluşumuna neden olur. Bu hücresel tepki, maya, bitkiler ve memelilerde evrimsel olarak korunur ve genel protein translasyonu engellendiğinde oluşur. Translatedly-inactive mRNA'lar için tutulan yerler olarak kabul edilen, hücresel mRNA'ların bir alt grubunun seçici çevirisine izin veren SG'ye durdurulmuş çeviri başlatma komplekslerinin toplanmasını içerir.Stresin giderilmesiyle, SG'ler eritilir ve küresel protein sentezi oranları devam eder. SG'ler, uygulanan strese bağlı olarak tam kompozisyonun değişmesine rağmen, translasyon uzama başlatma faktörleri, RNA metabolizmasına katılan proteinler, RNA-bağlayıcı proteinlerin yanı sıra iskele proteinleri ve konakçı hücre sinyallemesi ^2'ye dahil olan faktörlerden oluşur. SG oluşumunu uyaran çevresel faktörler, amino asit açlığı, UV ışınlaması, ısı şoku, ozmotik şok, endoplazmik retikulum stres, hipoksi ve viral enfeksiyonu içerir ^{2 , 7 , 8} . Bakteriyel, mantar veya protozoon patojenler gibi diğer patojenlerin bu hücresel stres tepkisini nasıl etkilediği hakkında henüz çok az şey bilinmesine rağmen, virüslerin SG oluşumunu nasıl indüklediğini ve yok ettiğini anlamada çok ilerleme kaydedildi ^{1 , 7} .

ShigeLla flexneri, insanlarda gram negatif fakültatif bir sitozolik patojendir ve şiddetli ishal ya da shigellosis'in sebep olduğu ajandır. Shigellosis önemli bir halk sağlığı yüküdür ve ^{9 , 10} yaşlarındaki 5 yaşın altındaki çocuklarda yılda 28.000 ölüme neden olur. S. flexneri , kolonik epiteli enfekte eder ve konak hücrenin hücre iskelet sistemi bileşenlerini ^{11 , 12'yi} kaçırarak hücre-hücreye yayılır. Epitelin enfeksiyonu S. flexneri'nin sitoplazmada çoğalmasını destekler, ancak enfekte makrofajlar pyroptoz adı verilen inflamatuar bir hücre ölümü süreciyle ölürler. Enfeksiyon, nötrofillerin büyük miktarda alınmasına ve ısı, oksidatif stres ve doku tahribatının eşlik ettiği ciddi inflamasyona neden olur. Böylece, enfekte olmuş hücreler, Golgi bozulması, genotoksik stres ve sitoskeletal yeniden düzenlenme gibi, enfeksiyon tarafından indüklenen iç strese maruz kalırlar.S, enfekte hücreler de inflamasyon süreci nedeniyle çevresel strese maruz kalmaktadır.

S. flexneri enfeksiyonunun, hücrelerin bir takım SG markörleri kullanarak çevresel streslere tepki verme kabiliyeti üzerindeki etkisinin karakterizasyonu, enfeksiyonun SG bileşimi ^3'teki kalitatif ve kantitatif farklılıklara yol açtığını ortaya koymuştur. Bununla birlikte, diğer bakteriyel patojenler hakkında çok az şey bilinmektedir. Burada, konakçı hücrelerin sitosolik patojen S. flexneri ile infeksiyonu için bir metodoloji, farklı çevresel streslere sahip hücrelerin streslenmesi , SG bileşenlerinin etiketlenmesi ve enfekte bağlamında SG oluşumunun ve kompozisyonunun nitel ve nicel analizleri anlatılmaktadır. Ve enfekte olmayan hücreler. Bu yöntem, diğer bakteriyel patojenler için yaygın olarak uygulanabilir. Buna ek olarak, SG oluşumunun görüntü analizi virüsler veya diğer patojenlerin neden olduğu enfeksiyonlar için kullanılabilir. SG'yi analiz etmek için kullanılabilirEnfeksiyona bağlı oluşum veya enfeksiyonun dış kaynaklı streslere yanıt olarak SG oluşumu üzerindeki etkisi.

Protokol

1. Bakteri ve konakçı hücrelerin hazırlanması

1. Deneysel durum başına bir kere sayılan steril cımbızla sırasıyla 24 veya 12 oyuklu plakalara 12 veya 14 mm cam kapak kaydırın. Bunları bir doku kültürü kapağında UV muamelesi ile 15 dakika sterilize edin.
   NOT: Bakteri yüklemesi ve dış kaynaklı streslerle SG indüksiyonu için kontrol kuyularını ekleyin.
2. 12 mm lamelleri olan 24 delikli bir plaka için, lamellerin üzerine 1 x 10 ⁵ memeli hücresi tohumlayın ( örn., HeLa hücreleri); Lamelleri steril bir pipet ucuyla aşağı doğru bastırın. Hücreler, 37 ° C'de, her bir hücre tipi için uygun kültür ortamında% 5 CO ₂ doku kültürü inkübatöründe gece boyunca tutsınlar.
   NOT: Plaka hücreleri, böylece hücrelerin birleşmesi ertesi gün% 40 - 60 arasındadır.
   1. HeLa hücreleri için, Olmayan Amino Asitler (NEAA) ve% 10 iyileştirilmemiş Fetal Buzağı Serumu (FCS) ile Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM) inkübe edin.56 ° C'lik bir su banyosunda 30 dakika ısıtılarak serumunu 15 dakika sonra bir kez döndürerek çözünür hale getirin.
3. Bakterileri çizmek için, bir -80 ° C dondurucuda depolanan bakteri gliserol stoğundan (% 20 gliserol) küçük bir miktar çıkarmak için steril bir pipet ucu kullanın ve etiketli bir plakaya yerleştirin. Bakterileri plakanın yaklaşık% 10'una yaymak için steril bir halka kullanın. Yeni steril bir halka kullanın ve 3 paralel çizgi yapmak için lekeye sürükleyin, yarım plaka uzunluğunda. Plakanın geri kalanını kaplayan bu çizgileri çizin. Plakayı O / N 37 ° C'de inkübe edin.
   1. Yeni çizgili plakadan tek bir bakteri kolonisi ( ör. S. flexneri ) seçin. 1 haftadan daha eski bakteri kolonileri ile çalışmaktan kaçının.
   2. S. flexneri suşu M90T için, yeni çizgili bir Tryptic Soy Agar -% 0.1 Congo kırmızı agar plakasından 15 mL'lik bir tüpteki 8 mL Triptik Soy arazisine kırmızı bir koloni aşılayın; Kapağı sıkıştırın ve 222 rpm O / N'de 30'da sallayarak inkübe edin.6 ° C.
      DİKKAT: Büyük beyaz kolonileri, virülans plasmidini kaybettikleri ve enfekte olmadıklarından kullanmayın.

2. Ev sahibi Hücrenin Bakteriyel Zorunluluğu

1. Enfeksiyon potansiyelini en üst düzeye çıkarmak için bakteriler hazırlayın.
   1. S. flexneri için , 8 mL Tryptic Soy Agar'a 150 uL O / N kültür ekleyerek alt kültür ekosistemleri yapınız ve virülans gen ekspresyonunu başlatmak ve enfeksiyonu arttırmak için geç üslü faza (~ 2 saat) 37 ° C'de 222 rpm'de çalkalayarak inkübe edin.
      1. Kültür 0.6 ile 0.9 arasında (600 nm'de ölçülen) optik bir yoğunluğa sahip olduğunda, 1.5 mL tüp içine 1 mL kültür aktarın. 8.000 xg'de 2 dakika pelet bakteri püskürtün ve OD ₆₀₀ = 1'de enfeksiyon ortamında (NEAA ile DMEM, eksik FCS) yeniden süspanse edin. Böylece, OD ₆₀₀ 0.85 ise, 850 uL'de tekrar süspanse edin.
         NOT: S. flexneri için, OD ₆₀₀ = 1'de, her mL'de 8 x 10 ⁸ bakteri olacaktır.8 mL ortamda kültürlendi. Enfeksiyonun Bir Çokluğu (MOI) 20'dir. Diğer patojenler için bir OD ₆₀₀ ve uygun MOI'da ml başına bakteri sayısı ampirik olarak belirlenmelidir.
   2. Bakteri-konak etkileşimlerini arttırmak için bakterileri Poly-L-Lysine (PLL) ile kaplayın.
      NOT: S. flexneri'nin PLL tedavisinin SG dinamikleri üzerinde hiçbir etkisi yoktur. PLL tedavisine uygun oldukları için diğer patojenler değerlendirilmelidir.
      1. Bakterileri PLL ile kaplamak için, 1 dakika 8,000 xg'de bakteri kültürü santrifüjleyin ve sonra OD ₆₀₀ = 1'de Fosfat Tamponlu Tuz (PBS) içinde 10 ug / mL PLL'de peleti tekrar süspanse edin.
      2. Bakteri solüsyonunu, 12 delikli bir plaka içerisinde bir kuyu gibi küçük bir çanağa ilave edin ve bir plaka çalkalayıcı üzerinde hafifçe ajitasyon ile 10 dakika boyunca oda sıcaklığında (~ 20 ° C) inkübe edin.
      3. 8.000 xg'da 2 dakika pellet bakteri, fazlalık PLL'yi alın. Pelleti 1 mL PBS'de tekrar süspansiyon haline getirin.D Bu yıkama adımını iki kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra OD ₆₀₀ = 1 olan enfeksiyon ortamında tekrar süspanse edin.
         NOT: Burada S. flexneri için enfeksiyon ortamı FCS içermeyen 20 mM HEPES içeren konakçı hücre ortamıdır.
2. Bakteriyel mücadele için hücreleri hazırlayın.
   1. Emme pompası kullanarak ortamı memeli HeLa hücrelerinden çıkarın. Hücreleri yıkamak, girdaplamak, bir emme pompası kullanarak ortamı çıkarmak ve 500 μL RT uygun enfeksiyon ortamı ( örn. , 20 mM HEPES w / o FCS ile konakçı hücre ortamı) ile değiştirilmek üzere 500 uL RT HeLa hücre ortamı ekleyin.
   2. NOT: Tüm yıkama adımlarında hızlı bir şekilde çalışın ve hücrelerin kurumasını önlemek için yalnızca aynı anda 4 lamel takın.
3. Challenge, hücrelerin% 20 - 50'sini bulaştırmak için bakteri bulunan HeLa hücrelerini hazırladı.
   NOT: Her bakteri türü için uygun süre ve MOI belirlenmelidir. Genel olarak, iyi bir başlangıç, 37'de 30 dakika sürer.° C, 10 MOI'dır.
   1. S. flexneri için, iki yöntemden birisini kullanarak (adım 2.3.1.1 veya 2.3.1.2) HeLa hücreleri hücrelerine meydan okuyun.
      1. 13000 x g'de 10 dakika süreyle hücrelere PLL uygulanmayan bakterileri (20 uL OD ₆₀₀ = 1 / kuyucuk 24 oyuklu plakada 500 uL ortam) döndürün.
      2. Bakterilerin hücrelere yerleşmesine izin vermek için oda sıcaklığında 15 dakika süreyle PLL kaplı bakteri (15 μL OD ₆₀₀ = 1 / çukur 24-çukurlu tabaka 500 μL ortam) ilave edin.
   2. Enfeksiyonun, yerleşmiş bakteriler içeren hücreleri 30 dakika boyunca 37 ° C'lik bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirerek gerçekleşmesine izin verin.
      NOT: Kısa zaman noktaları için, doku kültürü inkübatörü yerine 15 dakika 37 ° C'lik bir su banyosuna plakalar yerleştirerek S. flexneri enfeksiyonunu senkronize edin.
4. Hücreleri yıkayarak enfeksiyonu durdurun.
   1. Hücreleri yıkamak ve fazla bakteri çıkarmak için, bir emme pompası kullanarak ortamı çıkarın, 1 mLTaze önceden ısıtılmış (37 ° C) HeLa kültür ortamı (DMEM,% 10 FCS, NEAA). Ortamı döndürünüz, çıkarın ve taze ortam ile değiştirin. İki kez tekrarlayın ve hücrelere taze ortam bırakın.
      1. S. flexneri veya diğer hücre içi bakteriler için, HeLa hücrelerinin ve yıkamaların enfeksiyondan sonra ortamı, hücre dışı bakterileri öldürmek ve hücre invazyonunu önlemek için 50 μg / mL gentamisin içeren standart doku kültürü ortamı ile değiştirin.
         NOT: Ekstraselüler bakteriler için ortamda antibiyotik eklemeyin.
5. Bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde bakterilerin hücrelerle istenen miktarda inkübe edin.
   NOT: S. flexneri için enfeksiyon, hücre türüne bağlı olarak 6 saat sürebilir. HeLa hücreleri için enfeksiyon, SG oluşumunu tetiklemek için eksojen stresler eklemeden önce 1.5 - 2 saat devam etsin. Shigella'nın hücre-hücre yayan Caco-2 enfeksiyonları için eksojen stres katmadan önce 30 dakika ila 6 saat enfekte olur. CeBu noktada, bakteriyel enfeksiyon sonucu SG oluşumunu değerlendirmek için eksojen stresler eklenmeksizin sabitlenebilir (bu durumda, bölüm 4'e geçin).

3. Eksojen Stresörlerin Katılmasıyla Stres Granül Oluşumunun Oluşturulması

1. Bir emme pompası kullanarak enfekte ve enfekte olmayan HeLa hücrelerinden ortamı çıkarın, ortamı, stresör veya inkübe edilmemiş veya bulunmayan 500 μL uygun ortam ile değiştirin.
   NOT: Stres oluşturan koşullar aşağıdakileri içerir (aşağıya bakın). Ek tedaviler için bkz. Kedersha ve ark . ¹³ .
   1. Isı şoku tedavisi için 20 mM HEPES içeren düzenli ortam kullanın ve plakayı 30 dakika boyunca 44 ° C su banyosuna yerleştirin.
   2. Clotrimazole (mitokondriyal strese neden olur) tedavisi için, 20 uM clotrimazole ile FCS içermeyen normal ortam kullanın ve bir saat boyunca bir doku kültürü inkübatöründe inkübe edin.
      NOT: Tek kullanımlık 20 m'lik alikotları saklayın.Dimetil sülfoksid (DMSO) içinde -20 ° C'de 4 aya kadar klotrimazol stokları. Kontrol hücreleri için DMSO aracı kullanın.
   3. Arsenit (oksidatif strese neden olur) tedavisi için, 0.5 uM arsenit ile düzenli ortam kullanın ve 1 saat boyunca doku kültürü inkübatöründe inkübe edin.
      NOT: 0.5 mM arsenit stokunun tek kullanımlık alikotları -20 ° C'de 6 aya kadar depolayın.
      DİKKAT: Clotrimazole ve arsenite çevre için zararlıdır ve tehlikelidir ve uygun şekilde atılması gerekir.
   4. Des-Metil Des-Amino (DMDA) -pateamin tedavisi için (ökaryotik translasyon başlangıcını inhibe eder) 50-200 nM DMDA pateamin ile düzenli ortam kullanın ve 1 saat süreyle doku kültürü inkübatöründe inkübe edin.
      NOT: DMDA-pateamine'yi -80 ° C'de saklayın. Donma çözülmesini önlemek için reaktifleri küçük miktarlar halinde saklayın.

4. Stres Granül Oluşumunun Fiksasyon ve İmmünofloresan Analizi

NOT: Kontrolü işleyin veSonraki aşamalarda görüntü analizini etkileyebilecek farklılıkların boyanmasını önlemek için aynı zamanda deneysel lamelleri kullanın. Kontrol numuneleri, SG indükleyici tedavi ile veya SGS indükleme tedavisi olmadan enfeksi- yonu içermez ve SG enjeksiyonu uygulanmış ve edilmemiş enfekte örnekler içermez.

1. Bir emme pompası kullanarak ortamı tamamen çıkarın ve PBS'de 0.5 mL RT% 4 paraformaldehid (PFA) ekleyerek örnekleri düzeltin. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
   DİKKAT: PFA, işleyici ve çevre için zararlıdır. İşleyiciyi korumak için uygun önlemleri alın ve kimyasal atıklarla bertaraf edin.
   NOT: Alternatif olarak, 15 dakika sabitleyin ve daha sonra SG markörleri ^13'ün daha sitoplazmik lokalizasyonunu korumak için -20 ° C önceden karıştırılmış metanol ile 10 dakika değiştirin.
2. PFA'yı bir pipetle çıkarın ve sıvıyı uygun bir atık kabına yerleştirin. Lamel 1 mL Tris Tamponlu Tuz (TBS: 25 mM Tris, pH 7.3; 15 mM NaCl) ile yıkayın. Lamelleri hafifçe çalkalarken 2 dakika inkübe edinYıkama sırasında bir plaka çalkalayıcı üzerinde.
3. TBS tamamen bir emme pompası kullanarak çıkarın ve hücreleri permeabilize için TBS 500 mcL 0.3% Triton-X100 10 dakika ekleyin.
4. Bir emme pompası ile permeabilizing solüsyonu çıkarın. 1 mL TBS ile değiştirin, plakayı yavaşça döndürünüz, TBS'i emme ile çıkarın ve RT'de 1 saat boyunca 1 mL engelleme solüsyonu (TBS'de% 5 FCS) ilave edin.
5. TBS içinde% 5 FCS içinde birincil antikor çözeltisi (1: 300 seyreltme) hazırlayın. 12 mm lamel başına 50 mcL hesaplayın ve tek bir toplu tüm lamelleri için yeterince olun.
   NOT: Kullanılan ortak primer antikorlar hedef G3BP1, eIF3b ve TIA1'dir.
6. Birincil antikorun 50 μL'si tezgah veya bölme üzerine sıkıca bantlanmış bir plastik parafin filmi (parafilm) üzerine karıştırın.
   NOT: Malzeme Tablosunda kanonik SG işaretlerinin bir listesi verilmektedir, ancak SG'lerin bileşimi uygulanan strese bağlı olabilir. Diğer SG belirteçleri Kedersha ve ark. ¹³ S. flexneri enfeksiyonu için bir dizi SG markörü için beklenen sonuçlar Tablo 1'de listelenmiştir.
7. Cımbızla lamelleri kaldırın, lamelin kenarını dokuya dokunun, kısaca fazla sıvıyı çıkarmak için cımbız bırakın ve damla üzerine yüzü hafifçe koyun. Lamelleri oda sıcaklığında 1.5 saat inkübe edin veya gece boyunca 4 ° C'de nemli bir odada inkübe edin.
   NOT: Nemli bir oda hazırlamak için, önceden ıslatılmış dokuları, plastik parafilm ile kaplı sıkıca kapalı bir bölmenin kenarlarına yerleştirin.
8. 1 mL TBS ile doldurulmuş yeni bir 24-çukurlu küreye cımbızdaki her lamel aktarın; 5 dakika süreyle bir plaka çalkalayıcı üzerinde hafifçe sallayarak inkübe edin. TBS'yi bir emme pompası kullanarak her oyuktan boşaltın, 1 mL TBS ile değiştirin ve 5 dakika boyunca plakalı çalkalayıcıya yerleştirin. Tekrar tekrar yıkayın.
   NOT: Aşırı sıvıyı bir doku ile çıkararak parafilmi tekrar kullanın ve yüzeyi su ile yıkayın. Parafin filminin kullanmadan önce tamamen kuru olduğundan emin olun.G sonraki boyama adımı için.
9. İkincil antikor çözeltisini TBS'ye hazırlayın (seyreltme 1: 500 - 1: 2000). Çekirdeği ve bakteri lekelemek için karışıma 2 μg / mL DAPI ekleyin. Aktin lekelemek için flüoresan phalloidin ekleyin. Pipet 50 μL ikincil antikor, plastik parafin film üzerine karıştırın.
   NOT: G3BP1 (keçi antikoru) kullanıldığında, farklı SG işaretleyicilerinin birlikte lokalizasyon çalışmaları için yüksek saflıkta çapraz soğurulmuş eşek sekonder antikorların kullanılması önerilir. Çakışmayan spektrumlu floresanla işaretlenmiş sekonder antikorları seçin. EIF3b, hücrelerin sitoplazmasını açıkça lekeler ve bu nedenle hücreleri tanımlamak için iyi bir belirteçtir. Aktin boyası, hücre-hücre temas bölgelerindeki hücrelerin ve bakteriyel giriş alanlarının tanımlanmasına da yardımcı olur.
10. Fazla sıvıyı çıkarmak için cımbızla birlikte lamelleri kaldırın, lamellerin kenarını doku üzerine koyun, kısaca cımbız bırakın. Damla üzerine hafifçe yerleştirilmiş lamelleri damla üzerine yerleştirin ve lamelleri inkübe edin.Karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat karıştırıldı.
11. Yeni 1 mL PBS ile doldurulmuş 24 yuvalı plakalara lamel yerleştirmek için cımbız kullanın. Lambanın PBS tarafından tamamen kaplandığından emin olun. Hücreleri 3 kez yumuşak bir çalkalama ile 5 dakika boyunca yıkayın.
    NOT: İkincil antikorun floroforları ışığa duyarlı olduğu için ışığı korumak için yıkama sırasında bir kapağın altındaki plakayı tutun.
12. Tuzu çıkarmak için kenarları bir doku üzerine kenarından kurutun ve lamelleri bir cam slaytta bulunan floresan montaj medyumunun 5 μL'sine hafifçe koymak için kısaca deiyonize suya lamel koyun. Lensü, oje ile dokunmadan önce sızdırmaz kılın. Slaytları, kısa süreli (haftalık) 4 ° C'de veya uzun süreli (aylık) depolama için -20 ° C'de tutun.
    NOT: Sızdırmazlık esnasında hava kabarcıklarından kaçının; bu, görüntü kalitesine zarar verecektir.

5. Flüoresan Görüntüleme

NOT: Kurulumun optimizasyonu için mikroskop kullanım kılavuzuna bakın.

1. 40 veya 63X yağ daldırmalı lens kullanarak konfokal bir mikroskop kullanılarak görüntü elde edin. Görüntü alımı için arzu edilen floresan kanallarını seçin. Birden çok floresan kanalı kullanırken ardışık edinim modunu seçin.
   NOT: Sonraki örneklerde aşırı pozlamayı önlemek için SG'lerin en kuvvetli şekilde indüklendiği deney numuneleri ile başlayın. Hücrenin tüm derinliği boyunca SG'ye aşırı maruz kalmadığınızdan emin olun.
   1. Görüntü analizinin doğruluğunu sağlamak için mikroskop ayarları içerisinde bit büyüklüğünü 12 veya daha yüksek olarak ayarlayın.
   2. Görüntü yığını hücrenin tüm derinliğini kaplayacak şekilde ayarlayın. Tüm aralığın dahil edildiğinden emin olmak için farklı kanalları ve farklı SG işaretleyicileri kontrol edin. Yığın başlangıcını, hücrelerin tabanında ve istiflerin üstü, daha fazla SG işaretleyicisinin görülmediği hücrelerin üstündeki yükseklikte ayarlayın.
   3. Yığını bulun. Tüm görüntülerde yığın yüksekliğini aynı tutun.
      NOT: YapmaDeney ve sonraki örnekleme için kullanılacak deneysel örnekler arasındaki alım ayarlarını değiştirin.

6. Görüntü Analizi

NOT: Burada, ücretsiz ICY'yi kullanarak yığılmış yığınlar üzerinde SG analizi analiz edilmiştir. 3D rekonstrüksiyonların görüntü analizi, diğer özel yazılımları kullanarak da yapılabilir. SG saptaması, bu protokol için kurulmuş tam otomatik bir iş akışı yoluyla gerçekleştirilebilir (http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/Stress_granule_detection_in_fluorescence_imaging adresinde mevcuttur). Bu protokolü kullanmak için, çekirdeğin, her bir hücrenin merkezini bulmak için bir DNA lekesi ile lekelenmesi ve hücre kenarlarının, bir sitoplazmik işaretleyici (eIF3b gibi) veya yazılım için aktin lekesi ile işaretlenmesi gerekir Hücre sınırlarını tanımlamak için. Otomatik iş akışı, elle türetilen sonuçları doğrulamak için veya hücre sınırları yüksek güvenle tespit edildiğinde analiz için doğrudan kullanılabilir, ki bu mo olacaktırStly hücrelerin yoğunluğuna ve hücre sınırlarını belirlemek için kullanılan işaretleyiciye bağlıdır.

1. ImageJ veya Fiji'yi kullanarak görüntü yığınlarını daraltın (Resim> Yığınlar> Z projeksiyonu) ve .tiff dosyaları olarak kaydedin.
   NOT: Görüntü analiz yazılımı sonuçlarını orijinal resmin sitesine bağlayacağından, her görüntü için yeni bir klasör oluşturun.
2. Görüntü analiz platformuna bir kontrol ve deneysel .tiff resmi yükleyin (Dosya> Aç). Sıra penceresine gidin. "Arama Tablosu" nu kanal parametrelerine kaydırın.
3. Tüm kanal sekmelerinin onay kutusunu tıklayarak tüm kanalları devre dışı bırakın. Kanal 0'ı tıklayın ve ardından yukarıdaki renk çubuğunu tıklayarak tercih edilen rengi seçin. Yoğunluk alanındaki çizgiyi tıklatıp hareket ettirerek tüm yapıları görmek için kanal yoğunluğunu artırın. Bunu tüm kanallar için tekrarlayın.
   NOT: Verilen bir görev için gerekli olmayan kanalları, örnek analizde yanlılığı en aza indirgemek için devre dışı bırakın.
4. KaydırmaYukarı ve Tuval sekmesinde, yakınlaştırma sekmesini ayarlayarak alan başına yaklaşık 10 hücre yakınlaştırır.
5. Resimdeki hücrelerin hücre sınırlarını çizmek için çokgen fonksiyon araçlarını (üst çubukta) kullanın. Hücre sınır çizimi için aktin lekesi veya sitosolik işaretleyici kullanın ( örn. EIF3b).
   1. "Dosya ve ROI" araçları içindeki çokgen işlevini tıklayın. Hücre üzerine tıklayarak tasvir etmeye başlayın ve hücre sınırını tekrar tekrar tıklatarak bağlayıcılar yaparak hattı genişletin. ROI'yi tamamlamak için, "Dosya ve ROI" araçlarındaki poligon işlevini tekrar tıklayın.
      NOT: Virüs bulaşmış hücrelerin alt popülasyonlarını belirleyin. Örnek, enfekte olmuş ve bulaşmamış hücrelerin karışımından oluşur. Bakterileri tanımlamak için, DAPI lekesi veya floresan bakteri (GFP ifade eden bakteri gibi) kullanın. Tüm bakterilerin görülmesini sağlamak için yoğunluğu arttırın.
   2. Bir Yatırım Getirisini isimlendirmek için, sağdaki ROI penceresine ve cli'ye gidinCk, görüntüdeki ilgi hücresine. Bu, ROI sekmesinde karşılık gelen ROI'yi vurgulamaktadır. ROI adına çift tıklayın ve adı değiştirin ( ör . Virüs bulaşmış hücre # 1).
      NOT: Hem bulaşmış hem de virüs bulaşmamış hücreleri analiz etmek için bir görüntü kullanılırsa, görüntüyü iki ayrı klasörde kaydetmek ve virüslü ve virüs bulaşmayan hücreleri ayrı ayrı çizmek ve iki farklı elektronik tablo oluşturarak analiz etmeyi kolaylaştırmak daha kolaydır sonra.
6. "Algılama ve İzleme" sekmesinde (üst çubuk) spot dedektör uygulamasını açın. Giriş sekmesinde, geçerli görüntü seçilecektir. Hiçbir şey değiştirme. Ön-İşleme sekmesinde, analiz edilecek kanalı seçin.
   NOT: Herhangi bir zamanda yalnızca bir kanal analiz edilebilir. Parametreler tatmin edici sonuçlar verecek şekilde kontrol edilmiş olan tam otomatik analiz dizisini kullanırsa burada bir toplu analiz seçilebilir.
   1. Dedektör sekmesinde, "DeKaranlık fon üzerinde parlak lekeleri "seçin.Daha sonra uygun skalayı ve hassaslığı seçin.Bunu farklı ayarları test ederek yapın ve kontrol ve deney numunelerinde nokta tespiti çapraz kontrol edin.
      NOT: 2,048 x 2,048 çözünürlüklü ve 0.12 μm2'lik bir piksel boyutu olan bir görüntü için, 25 ila 100'lük bir duyarlılıkla bir 2. seviye eşik genellikle uygundur, ancak her SG işaretçisi ampirik olarak test edilmelidir. Deney numunesinde SG'leri olan küçük ve büyük SG'lerin hepsi sayılırken, nokta tespitini ayarlayın, böylece muamele edilmemiş kontrol numunesinde noktalar tespit edilmez.
   2. ROI sekmesinde, önerilen ROI From Sequence'i seçin. Filtreleme sekmesinde Filtreleme Yok'u seçin. Çıktı sekmesinde uygun çıktıyı seçin.
      NOT: Farklı bir algılama koşulunu veya farklı kanalları kaydetmek için Belirli Dosyayı Etkinleştir seçimi yararlıdır. İkili görüntü ve orijinal görüntüyü yatırım getirileri ve algılama ile dışa aktarmayı seçmek helKalite kontrol analizi için çok şey var.
   3. "ROI'lar olarak oluşturulmuş önceki noktaları kaldır" ı seçin. "Dosya seçili olmayan" düğmesini tıklayarak dosyayı kaydedecek klasörü seçin. Görüntü sekmesinde istediğiniz seçenekleri seçin. "Algılama işlemini başlat" ı tıklayın.
      NOT: Dışa aktarılan görüntüleme seçeneklerini içeren ad ve konum seçilmiş bir klasör oluşturulur. Bu görüntüler, test edilen her yeni durum için üzerine yazılacaktır. Görüntüleri korumak için, klasörü yeni bir klasör oluşturulacak şekilde yeniden adlandırın veya görüntüleri kaydet klasöründen yeni bir klasöre aktarın. Görüntülerin kalite kontrolü için, ekran algılama işareti, ROI ve ROI numarası ve ismi algılama sayısını seçmek yararlıdır.
7. Test edilen her resim veya koşul için oluşturulan e-tabloyu kullanarak farklı parametrelerin verilerini bir araya getirin ve kaydedin.
   NOT: Analiz edilecek parametreler, ROI başına SG sayısı, SG yüzey alanları ve SG maxImum, ortalama ve minimum yoğunluklar.
8. Veriyi aktarın ve istatistiksel önemi analiz edebilen, grafikleyen ve belirleyebilen bir analiz programı kullanarak analiz edin.

Sonuçlar

Bu yazıda açıklanan protokolü açıklamak ve göstermek için, cytosolik patojen S. flexneri ile enfekte olmuş veya olmayan HeLa hücrelerindeki klotrimazol kaynaklı SG'lerin görüntüsünü karakterize ettik. Prosedürün ana hatları Şekil 1'de sunulmakta ve Kongo Kırmızı plakaları üzerinde çizgili olan virulent ve avirulent S. flexneri , bakteri hazırlama, enfeksiyon, çevresel stres eklenmesi, numune fiksasyonu ve...

Tartışmalar

Burada özetlenen protokol, dış kaynaklı stres varlığında veya yokluğunda, sitoplazmik patojen S. flexneri ile infekte olmayan hücrelerdeki ve hücrelerdeki SG'lerin indüksiyonu, lokalizasyonu ve analizini anlatmaktadır. Protokoller, serbest görüntüleme yazılımını kullanarak belirli fenotiplerde farklılıkları tanımlamak ve istatistiksel olarak ele almak için SG oluşumunun kesin kalitatif ve kantitatif analizine olanak tanır.

Enfeksiyon, SG indüksiyon ve ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary Antibodies
eIF3b (N20), origin goat	Santa Cruz	sc-16377	Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1 in 300
eIF3b (A20), origin goat	Santa Cruz	sc-16378	Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1 in 300
eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal)	Cell Signaling	3411	Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1 in 800
eIF4AI, origin goat	Santa Cruz	sc-14211	Recommended by (Ref # 13). Dilution 1 in 200
eIF4B, origin rabbit	Abcam	ab186856	Good stress granule marker in our hands. Dilution 1 in 300
eIF4B, origin rabbit	Cell Signaling	3592	Recommended by Ref # 13. Dilution 1 in 100
eIF4G, origin rabbit	Santa Cruz	sc-11373	Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1 in 300
G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal)	BD Biosciences	611126	Widely used SG marker. Dilution 1 in 300
Tia-1, origin goat	Santa Cruz	sc-1751	Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1 in 300
Alexa-conjugated Secondary Antibodies
A488 anti-goat , origin donkey	Thermo Fisher	A-11055	Cross absorbed. Dilution 1 in 500
A568 anti-goat, origin donkey	Thermo Fisher	A-11057	Cross absorbed. Dilution 1 in 500
A488 anti-mouse, origin donkey	Thermo Fisher	A-21202	Dilution 1 in 500
A568 anti-mouse, origin donkey	Thermo Fisher	A10037	Dilution 1 in 500
A647 anti-mouse, origin donkey	Thermo Fisher	A31571	Dilution 1 in 500
A488 anti-rabbit, origin donkey	Thermo Fisher	A-21206	Dilution 1 in 500
A568 anti-rabbit, origin donkey	Thermo Fisher	A10042	Dilution 1 in 500
Other Reagents
Shigella flexneri			Available from various laboratories by request
Tryptone Casein Soya (TCS) broth	BD Biosciences	211825	Standard growth medium for Shigella, application - bacterial growth
TCS agar	BD Biosciences	236950	Standard growth agar for Shigella, application - bacterial growth
Congo red	SERVA Electrophoresis GmbH	27215.01	Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application - bacterial growth
Poly L lysine	Sigma-Aldrich	P1274	Useful to coating bacteria to increase infection, application - infection
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397	Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application - infection
HEPES	Life Technologies	15630-056	PH buffer useful when cells are incubated at room-temperature, application - cell culture
DMEM	Life Technologies	31885	Standard culture medium for HeLa cells, application - cell culture
Fetal calf serum	Biowest	S1810-100	5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application - cell culture
Non-essential amino acids	Life Technologies	11140	1/100 dilution used for HeLa cell culture medium, application - cell culture
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650	Reagent diluent, application - cell culture
Sodium arsenite	Sigma-Aldrich	S7400	Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application - stress inducer
Clotrimazole	Sigma-Aldrich	C6019	Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application - stress inducer
PFA	Electron Microscopy Scences	15714	4% PFA is used for standard fixation of cells, application - fixation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application - permeabilization
A647-phalloidin	Thermo Fisher	A22287	Dilution is at 1/40, best added during 2ary antibody staining, application - staining
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application - staining
Parafilm	Sigma-Aldrich	BR701501	Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application - staining
Prolong Gold	Thermo Fisher	36930	Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application - mounting
Mowiol	Sigma-Aldrich	81381	Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting
24-well cell culture plate	Sigma-Aldrich	CLS3527	Standard tissue culture plates, application - cell culture
12-mm glass coverslips	NeuVitro	1001/12	Cell culture support for immunofluorescent applications, application - cell support
forceps	Sigma-Aldrich	81381	Cheap and obust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting
Programs and Equipment
Prism	GraphPad Software		Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application - data analysis
Leica SP5	Leica Microsystems		Confocal microsope, application - image acquisition
Imaris	Bitplane		Professional image analysis program, application - data analysis
Excel	Microsoft		Data analysis and graphing program, application - data analysis