طويلة الأجل تصوير لايف<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; القرص العين

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة مفصلة لعلى المدى الطويل فيفو السابقين الثقافة والتصوير المباشر لقرص تخيلي ذبابة الفاكهة. وهو يدل التمايز مبصرة والتناوب ommatidial في غضون فترة 10 ساعة من التصوير المباشر لقرص العين. بروتوكول بسيط ولا يتطلب الإعداد مكلفة.

Abstract

يوفر التصوير الحي القدرة على تتبع باستمرار العمليات الخلوية والتنموية ديناميكية في الوقت الحقيقي. وقد استخدمت ذبابة الفاكهة أقراص تخيلي اليرقات لدراسة العديد من العمليات البيولوجية، مثل تكاثر الخلايا، والتمايز، والنمو، والهجرة، وموت الخلايا المبرمج، والمنافسة، مما يشير الى خلية خلية، وتشكيل الحدود المجزئ. ومع ذلك، لم تكن طرق على المدى الطويل فيفو السابقين الثقافة والتصوير المباشر لأقراص تخيلي مرضية، على الرغم من الكثير من الجهود. مؤخرا، قمنا بتطوير طريقة لعلى المدى الطويل فيفو السابقين الثقافة والتصوير المباشر لأقراص تخيلي لمدة تصل إلى 18 ساعة. بالإضافة إلى استخدام تركيز الأنسولين عالية في مستنبت، تم استخدام الاغاروز ذوبان منخفضة أيضا إلى تضمين القرص لمنعها من الانجراف خلال فترة التصوير. يستخدم هذا التقرير أقراص العين antennal كمثال على ذلك. وأعقب مبصرة R3 / 4 محددة التعبير mδ0.5-Ga4 لإثبات أن مبصرة مختلفاtiation والتناوب ommatidial يمكن ملاحظتها خلال 10 ساعة فترة التصوير الحي. هذا هو بروتوكول تفصيلا واصفا هذه الطريقة البسيطة.

Introduction

وكانت ذبابة الفاكهة أقراص تخيلي اليرقات نظام تجريبي يفضل لدراسة مجموعة واسعة من الآليات البيولوجية. هذه الأقراص المنغلفة من ظهارة الجنينية وتصبح الهياكل الكيس مثل بنتها طبقتين الظهارية، Peripodial الظهارة (PE) والقرص المناسب (DP) ^{1 و 2.} الخلايا قرص تخيلي تتكاثر وتتمايز تدريجيا خلال مراحل اليرقات والعذارى وتطوير في نهاية المطاف في هياكل الجسم الكبار. نظرا لهيكل من طبقتين مسطح وبسيط للأقراص تخيلي، فهي سهلة لمراقبة عند تشريح من اليرقات. ومع ذلك، على الرغم من عدة جهود من قبل العديد من الجماعات، لم تكن الطرق الحالية للثقافة على المدى الطويل من أقراص تخيلي مرضية. لقد وضعت مؤخرا طريقة الثقافة التي يمكن أن تحافظ على التطور الطبيعي للأقراص تخيلي متعددة لمدة تصل إلى 18 ساعة والتي تتيح التصوير الحي ³ . طريقة الثقافة يمكن أن تدعم تمايز الخلايا والهجرة، ولكنها يمكن أن تدعم تكاثر الخلايا لساعة فقط 7-12 ولا يمكن دعم نمو القرص. والفرق الرئيسي في مستنبت هو تركيز عال من الانسولين ^3. طريقة بسيطة، وليس هناك حاجة تهوية خاصة أو تداول المتوسط.

واحدة من أفضل أقراص تخيلي مدروسة هو القرص العين antennal. هو مبني على العين ذبابة الفاكهة تتكون من حوالي 800 ommatidia. وتتألف كل مقيلة من ثماني خلايا مستقبلة للضوء (R1-R8). في القرص العين اليرقات، وخلايا مستقبلة للضوء نفرق عقب مرور تخلقية الشق (MF)، التي تجتاح عبر القرص العين من الخلفية إلى الأمامية ^{4 و 5.} المستقبلات الضوئية في مقيلة تفرق في التسلسل، بدءا R8، يليه R2 / R5، R3 / R4، R1 / R6، وR7 ^6. وommatidia في ظهري وهاءنصفين ntral من القرص العين الخضوع لدوران 90 درجة في اتجاهين متعاكسين، مما أدى إلى شرليتي المعاكس ^{7 و 8.} تحدث عملية تناوب على مرحلتين: أولا، يبدأ 45 درجة دوران في واكتمال في الصف السادس ommatidia وراء MF. اكتمال الثاني 45 درجة دوران بنحو التوالي 16 ^{9 و 10.} هذه الدراسة تستخدم دوران ommatidial، والتي تمثلت في R3 / 4 محددة ¹¹ mδ0.5-Ga4، للتدليل على التمايز وديناميات الخلوية العادية التي يمكن ملاحظتها من خلال هذا الأسلوب للثقافة ويعيش صورة القرص العين.

Protocol

إعداد 1. ما قبل التجريبي

1. جمع البيض الطيران التي تعبر عن النووي البروتين الفلوري الأخضر (GFP) تحت mδ0.5-GAL4 والثقافة عند 25 درجة مئوية لمدة 5 أيام.
2. ميكروويف 0.7 غرام من الاسعار المنخفضة للذوبان الاغاروز في 10 مل من المالحة الفوسفات مخزنة-1X (PBS) حتى يذوب تماما agarose. حافظ على 0.7٪ هلام انصهار منخفضة في الحاضنة 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.
3. تعقيم جميع المعدات، بما في ذلك ملقط، مقص، 42 ملم coverslips س 0.17 ملم، 9 جيدا لوحة بقعة الزجاج، وغرفة الثقافة المغناطيسي، مع 70٪ من الإيثانول لأكثر من 12 ساعة.
4. إعداد مستنبت ^3: متوسط ذبابة الفاكهة شنايدر تستكمل مع 2٪ مصل بقري جنيني (FBS)، و 0.5٪ البنسلين ستربتومايسين، و 1.25 ملغ / مل الانسولين. لتجنب التلوث، وإعداد المتوسطة في غطاء ثقافة الخلية. تخزين مستنبت مستعد في 4 درجات مئوية وتستخدم في غضون شهر.
5. تنظيف منصة التشريح ومجرب "يدي مع الايثانول 70٪ قبل البدء في تشريح.

تشريح 2. القرص

1. الهواء الجاف جميع المعدات من 70٪ من الإيثانول.
2. حدد اليرقة الطور الثالث من قارورة ذبابة. لتجنب التلوث من القارورة الطيران، وغسل يرقة في برنامج تلفزيوني 1X 3X لإزالة النفايات.
3. تشريح اليرقة تنظيفها في 1 مل من مستنبت (في RT) في 9 جيدا الزجاج لوحة بقعة تحت المجهر تشريح.
4. فهم اليرقة مع زوج من الملقط في حوالي ثلث الطريق من نهاية الخلفي وملقط آخر في ربط الفم. سحب الملقط في اتجاهين متعاكسين للافراج عن الأنسجة الداخلية.
   1. إزالة الغدد اللعابية، الدهون في الجسم، وبشرة من مجمع العين والدماغ تعلق على ربط الفم. إذا لا تزال تعلق على الحبل العصبي البطني، وقطع بعيدا مع المقص.
5. استخدام زوج واحد من ملقط لفهم ورطتها الفم وزوج واحد من ملقط لإزالة قطعة من الأنسجة التي شاركnnects العقول وأقراص العين في الجزء الظهري.
   ملاحظة: إذا لم تتم إزالة هذا النسيج، وأقراص العين antennal اثنين تكون قريبة من بعضها البعض والدماغ. فإن أقراص العين ثم لا الاستلقاء على ساترة لهذا النسيج، والدماغ، والقرص العين antennal ستشكل مثلث.
6. تدوير مجمع كامل للموقف بطني-التصاعدي. إزالة خيوط الذي يربط ربط أو القرص إلى الدماغ.
   ملاحظة: إذا لم يتم إزالة خيوط، فإن القرص العين antennal انقسم الى اثنين من قطعة عند إزالة ربط الفم.
   1. إزالة ربط الفم. والحرص على عدم تلف القرص العين أثناء العملية.
      ملاحظة: قرص العين هو الآن مجانا على المديين المتوسط ​​وتوصيل فقط إلى الدماغ عن طريق ساق البصرية.

3. تركيب

1. الهواء الجاف وتجميع مكونات غرفة مع 42 مم × 0.17 مم ساترة. إرفاق طبقة مزدوجة من O-خواتم إلى مركز الغطاء زلة لعقد عشرالبريد الاغاروز.
2. غرفة تجميع مع ساترة. وضع 42 مم × 0.17 مم ساترة على متقبل المرحلة. وضع السيليكون يا الدائري على غلاف زلة. وضع قاعدة. قفل خزانة الختم ووضع الغطاء (الشكل 1).
3. نقل بعناية مجمع العين والدماغ تشريح لمركز O-حلقة باستخدام micropipette 20 ميكرولتر مع طرف 10-200 ميكرولتر.
4. إزالة معظم المتوسطة وإضافة 12 ميكرولتر من 0.7٪ الاغاروز ذوبان منخفضة (عند 37 درجة مئوية) للعينة.
   ملاحظة: إن موقف القرص العين يمكن أن تتغير مع ملقط قبل التصلب من الاغاروز. فإن الاغاروز يصلب خلال 5 دقائق.
   1. إضافة 1 مل من مستنبت في درجة حرارة الغرفة إلى مركز O-حلقة. كل حلقة O-يمكن تحميل ما يصل إلى 4 عينات. تأكد من أن الاغاروز يتم لصقها إلى O-عصابة لتجنب الانجراف من العينة.
      ملاحظة: لا تهوية أو تداول متوسطة أمر ضروري.

4. متحد البؤر المجهري

1. مكان الغرفة على مرحلة مجهر متحد البؤر مقلوب لمدة 30 دقيقة لكي تتوازن درجة الحرارة. وهذا يمكن منع Z-محور الانحراف أثناء التصوير.
2. قبل التصوير الحي على المدى الطويل، والتحقق ما إذا كانت الأنسجة سليمة من قبل التفاضلية المجهري تدخل التباين.
3. لتجنب الضيائية، واستخدام قوة الليزر أقل من 2 ميغاواط. استخدام هدفا 40X للتصوير.
4. الحصول على 62 ميكرومتر الصور Z-المكدس في 12 دقيقة في الفترة الفاصلة البصرية من 1 ميكرون. الحصول على 40 دورات المسح على ما مجموعه 10 ساعة. تأكد من أن كل دورة تتضمن 12 دقيقة من التصوير و 3 دقائق من الراحة.

النتائج

في هذا المثال، وصفت خلايا مستقبلة للضوء R3 / R4 مع mδ0.5-Ga4 لمراقبة مبصرة التمايز. mδ0.5-Ga4 يدفع تعبير قوي في R4 والتعبير الأضعف في R3 ^11، مما يجعلها علامة ممتازة للR3 وR4، فضلا عن عملية التناوب ommatidial. في الفيلم 1، وصفت R3 وR4 مع GFP. في بداية 10 ساعة جلسة الحية التصوير، وكانت هناك 8 صفوف من كتل ommatidial (الشكل 2A وفيلم 1) و 14 صفوف من كتل ommatidial في نهاية (الشكل 2B). وكان معدل التمايز ommatidial 1.67 ساعة لكل صف واحد، وهو ما يقارب نسبة 1.5-2 ح / الصف في الجسم الحي في أقراص ^{7، 8، 9، 10، 11،}الصورة = "XREF"> 12 ^{و 13 و 14.} على أساس المواقف النسبية للR3 وR4، حدث دوران ommatidial في القرص مثقف خارج الحي خلال التصوير الحي (الشكل 2A، A ''، B، و B ''). وصفت كتلة R3 / R4 واحدة مع كرة بيضاء في الإطار الأول من فيلم 2. في البداية، محور R3 / R4 يبدو أن عمودي على خط الاستواء (الشكل 2C وفيلم 2). ومن ثم يبدو لتدوير 15 درجة و 30 درجة مئوية، و 45 درجة في 3 (الشكل 2C)، 6 (الشكل 2C '')، و 9 (الشكل 2C '' ') ساعة، على التوالي. وتشير هذه البيانات إلى أن هذه الطريقة يمكن الحفاظ مبصرة التمايز خلال التصوير الحي 10 ساعة.

فيقوري 1: الرسم التخطيطي للجمعية الغرفة. الرسم التخطيطي للتجمع الغرفة: ( 1 ) وضع طبقة مزدوجة o- حلقة ساترة المرفقة على المرحلة متقبل. ( 2 ) ضع السليكون o الدائري على زلة الغطاء. ( 3 ) ضع القاعدة. ( 4 ) قفل خزانة الختم. ( 5 ) تحميل العينة في وسط حلقة O ووضع الغطاء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: التصوير لايف من R3 / R4 التمايز والتناوب. R3 / R4 المسمى مع Mδ0.5-Gal4 معربا عن شكل غفب النووي خلال 10 ساعة من التصوير الحي. تم التقاط جميع الأرقام من الفيلم 1 . ( A ) صورة اتخذت في البداية. ( > A-A ") الصورة الموسع من المنطقة المحاصرة على اليسار ( A ' ) والحق ( A" ). ( ب ) الصورة التي اتخذت في نهاية فترة 10 ساعة. ( B'-B " ) الصورة الموسع من المنطقة المحاصرة على اليسار ( B ' ) والحق ( B" ). ( سيسي '' ' ) ويتبع زوج واحد R3 / R4 (ملحوظ بالسهم في A') من خلال الوقت لإظهار دوران الزوج R3 / R4. الحانات مقياس = 15 ميكرون، 10 ميكرون، و 5 ميكرون في A، B، و C، على التوالي. جميع الأرقام هي أقصى كثافة Z- التوقعات. يظهر الجدول الزمني في h: مين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيلم 1:rce.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_1.avi "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيلم.

فيلم 1: الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الفيلم.

Discussion

في هذه الدراسة، ونحن نقدم بروتوكول مفصلة لعلى المدى الطويل تجربة التصوير مباشرة على أقراص تخيلي ذبابة الفاكهة. قضينا الكثير من الوقت في ممارسة تشريح دقيق لتجنب الضرر القرص والسماح للمرفق من القرص بالقرب لل coverslips. حاولنا بولي-L-ليسين (PLL) وانخفاض ذوبان الاغاروز لعقد الأنسجة. في النهاية، أظهر الاغاروز ذوبان منخفضة قدرة أفضل على عقد الأنسجة. وعلى الرغم من استخدام القرص العين فقط في هذه الورقة لإثبات وقوع العادي للتمايز مبصرة والتناوب ommatidial خلال 10 ساعة فترة التصوير الحي، ويمكن أيضا أن تطبق هذه الطريقة على قرص واحد آخر على الأقل، القرص الجناح، كما هو موضح في دراسة سابقة ^3. وعلاوة على ذلك، وإعداد مستنبت والإعداد والتصوير الحية هي بسيطة ولا تتطلب تهوية أو تداول المتوسط.

تصوير حي المستمر يمكن أن توفر تسلسل زمني واضح لعشية البيولوجيةاليلة. في تقريرنا السابق من التمايز الدبقية والهجرة في القرص العين، قدمنا دليل مباشر على أن الدبقية التفاف تفرق من الدبقية الموجودة بعد الهجرة إلى الجزء الأمامي من القرص العين ^3. على المدى الطويل ثقافة فيفو السابقين تسمح لوضع العلامات تنشيط ليزر معين من الخلايا، مثل الصور وتحويل البروتين الفلوري Kaede الذي، لمتابعة تصرفاتهم ^3. كما يمكن أن تستوعب اختبار المواد الكيميائية التي تضاف مباشرة إلى مستنبت. وبالتالي، يمكن استخدامه كمنصة فحص المخدرات. منذ بعض عملية ديناميكية تحدث في غضون دقائق أو ثواني، مطلوب قرار زمنية عالية. لتعزيز القرار الزماني، وعلى ضوء ورقة المجهري ^{15، 16} أو الغزل القرص المجهري ¹⁷ قد يكون خيارا جيدا.

حالة الثقافة الحالية ليست مثالية. أنه لا يدعم نمو القرص. خلية صويدعم roliferation فقط لمدة تصل إلى 12 ساعة ^3. بعد 12 ساعة في الثقافة فيفو السابقين، فإن معدل التمايز مبصرة يبدأ في الانخفاض ^3. قد يكون هذا بسبب عدم وجود بعض العناصر الغذائية أو الهرمونات. لأن الفرق كبير في هذا مستنبت هو تركيز عال من الأنسولين، قد يكون الأنسولين الثدييات جزئيا محاكاة وظيفة الببتيد الذي يشبه الانسولين الذاتية. إضافة استخراج ذبابة، والحشرات طرهالوز السكر في الدم، وتركيز مختلف من هرمون طرح الريش 20 hydroxyecdysone، لم تكن مفيدة ^3. ومع ذلك، فإن الفترة الثقافة 12-18 ساعة كافية لدراسة العديد من العمليات التنموية. وقد تم مقارنة طرق زراعة بديلة لزراعة أقراص تخيلي اليرقات ^3، ويوفر لدينا زراعة والتصوير شرط أطول نافذة الوقت، ومعظم الوضوح للتصوير الحي. على الرغم من أن أقراص داخل اليرقات الحية والشرانق يمكن تصوير مباشرة^{18، 19، 20، 21، 22،} نافذة قرار والوقت للملاحظات محدودة. اليرقات في وقت متأخر وأقراص العذراء يمكن تربيتها لفترة طويلة ^{23 و 24،} ولكن أقراص الخضوع التشكل كبير. للاستفادة من وأقراص اليرقات 2D مسطحة، لدينا طريقة زراعة والتصوير هو الحل الأفضل حتى الآن.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low-melting agarose	AMRESCO	0815-25G
Phosphate-buffered Saline (PBS)	AMRESCO	0780-2PK
42 mm x 0.17 mm cover slips	PST	G401-42
Schneider’s Drosophila medium	Thermo	21720-024
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F9665
Penicillin-streptomycin	GIBCO	759
Insulin	Sigma	I9278
Culture chamber	PECON		POC-R2 Cell Cultivation System
40X objective			C-Apochromat 40X/1.2W Korr objective
Fly strain:nls.GFP	Bloominggton	4775