À long terme d&#39;imagerie en direct de<em&gt; drosophile</em&gt; Disc Eye

Résumé

Ce protocole décrit un procédé détaillé pour la culture ex vivo à long terme et de l' imagerie en temps réel d'un disque de Drosophila imagée. Elle démontre la différenciation des photorécepteurs et la rotation ommatidial dans les 10 h de l'imagerie en direct du disque des yeux. Le protocole est simple et ne nécessite pas l'installation coûteuse.

Résumé

imagerie en temps réel permet de suivre en permanence les processus cellulaires et de développement dynamiques en temps réel. Drosophile disques imaginales larves ont été utilisés pour étudier de nombreux processus biologiques, tels que la prolifération cellulaire, la différenciation, la croissance, la migration, l' apoptose, la concurrence, la signalisation cellule-cellule et la formation limite compartimentée. Cependant, les méthodes de culture ex vivo à long terme et de l' imagerie en direct des disques imaginaux ne sont pas satisfaisants, en dépit de nombreux efforts. Récemment, nous avons mis au point une méthode pour la culture ex vivo à long terme et de l' imagerie en direct des disques imaginaux jusqu'à 18 h. En plus d'utiliser une forte concentration d'insuline dans le milieu de culture, un agarose à bas point de fusion a également été utilisé pour incorporer le disque pour l'empêcher de la dérive au cours de la période de formation d'image. Ce rapport utilise les disques eye-antennaire comme exemple. Photorécepteur R3 / expression mδ0.5-GA4 4-spécifique a été suivi pour démontrer que photorécepteur différenciation et la rotation ommatidial peuvent être observées au cours d'une période de formation d'image en direct 10 h. Ceci est un protocole détaillé décrivant cette méthode simple.

Introduction

Les disques imaginales larves de drosophile ont été un système expérimental privilégié pour l'étude d'une grande variété de mécanismes biologiques. Ces disques invaginent de l'épithélium embryonnaire et deviennent des structures de type sac constituées par deux couches epitheliales, Peripodial Epithelium (PE) et du disque approprié (DP) ^{1, 2.} Les cellules du disque imaginal prolifèrent et se différencient progressivement au cours des stades larvaires et de pupe et finissent par développer dans les structures du corps adulte. En raison de la structure à deux couches plate et simple des disques imaginales, ils sont faciles à observer quand disséqué des larves. Cependant, en dépit de plusieurs efforts déployés par de nombreux groupes, les méthodes actuelles de la culture à long terme des disques imaginaux ne sont pas satisfaisants. Nous avons récemment mis au point une méthode de culture qui peut soutenir le développement normal de plusieurs disques imaginales jusqu'à 18 h et qui permet l' imagerie en direct ³ . La méthode de culture peut soutenir la différenciation cellulaire et la migration, mais il peut prendre en charge la prolifération cellulaire seulement 7-12 h et ne peut soutenir la croissance du disque. La principale différence dans le milieu de culture est la forte concentration de l' insuline ^3. La méthode est simple, et pas d'aération spéciale ou la circulation moyenne est nécessaire.

L'un des disques imaginaux mieux étudiés est le disque de l'oeil-antennaire. L'œil drosophile est construit d'environ 800 ommatidia. Chaque ommatidium comprend huit cellules photoréceptrices (R1-R8). Dans le disque de l' oeil larvaire, les cellules photoréceptrices différencient suivant le passage du morphogénétique sillon (MF), qui balaye le disque de l' oeil d'arrière en avant ^{4, 5.} Les photorécepteurs dans un ommatidium se différencient en séquence, en commençant par R8, suivie par R2 / R5, R3 / R4, R1 / R6, R7 et ^6. Le ommatidia dans la dorsale et ventral moitiés du disque de l' oeil soumis à une rotation de 90 ° dans des directions opposées, entraînant une chiralité opposée ^{7, 8.} Le processus de rotation se produit en deux étapes: d'abord, une rotation de 45 ° et commence à se termine à la sixième rangée de ommatidia derrière le MF; la deuxième rotation de 45 ° est terminée à environ 16 ligne ^{9, 10.} Cette étude a utilisé la rotation ommatidial, marquée par la mδ0.5-ana 4 ¹¹ spécifiques à 4 R3 /, pour démontrer la différenciation cellulaire normale et la dynamique qui peut être observée à travers cette méthode pour la culture et l' image en direct le disque des yeux.

Protocole

1. Configuration pré-expérimentale

1. Recueillir un oeuf de mouche qui exprime la protéine fluorescente verte nucléaire (GFP) sous mδ0.5-Gal4 et de la culture à 25 ° C pendant 5 jours.
2. Four à micro 0,7 g d'agarose bas point de fusion dans 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate 1x (PBS) jusqu'à ce que l'agarose soit complètement dissous. Maintenir le gel 0,7% bas point de fusion dans un incubateur à 37 ° C jusqu'à utilisation.
3. Stériliser tous les équipements, y compris des pinces, des ciseaux, 42 mm x 0,17 mm lamelles, une plaque de verre 9 spot de puits, et une chambre de culture magnétique, éthanol à 70% pendant plus de 12 h.
4. Préparer le milieu de culture ^3: milieu Drosophila de Schneider additionné de 2% de sérum bovin fœtal (FBS), 0,5% de pénicilline-streptomycine, et 1,25 mg / ml d' insuline. Pour éviter toute contamination, préparer le milieu dans une hotte de culture cellulaire. Conserver le milieu de culture préparé à 4 ° C et utilisé dans un mois.
5. Nettoyer la plate-forme de dissection et l'expérimentateur »s mains avec 70% d'éthanol avant de commencer la dissection.

2. Disque Dissection

1. Sécher à l'air tout l'équipement de 70% d'éthanol.
2. Sélectionnez une larve du troisième stade larvaire d'un flacon de mouche. Pour éviter toute contamination du flacon de mouche, laver la larve dans PBS 1x 3x pour éliminer les déchets.
3. Disséquer la larve nettoyé dans 1 ml de milieu de culture (à température ambiante) dans la plaque de verre 9 place puits sous un microscope à dissection.
4. Saisir la larve avec une paire de pinces à environ un tiers de la distance entre l'extrémité postérieure et une autre pince à crochet de la bouche. Tirer les deux pinces en sens inverse pour libérer les tissus internes.
   1. Retirer les glandes salivaires, la graisse corporelle, et cuticule du complexe oeil-cerveau attaché à l'hameçon de la bouche. Si le cordon nerveux ventral est encore attaché, couper avec des ciseaux.
5. Utiliser une paire de pinces pour saisir le crochet de la bouche et une paire de pinces pour enlever un morceau de tissu qui connects les cerveaux et les disques d'oeil dans la partie dorsale.
   NOTE: Si ce tissu n'est pas supprimé, les deux disques de l'œil-antennaire seront proches les uns des autres et le cerveau. Les disques oculaires seront alors pas à plat sur la lamelle parce que ce tissu, le cerveau, et le disque des yeux-antennaire formeront un triangle.
6. Tourner l'ensemble du complexe à une position ventrale vers le haut. Retirez le fil qui relie le crochet ou d'un disque au cerveau.
   NOTE: Si le filament est pas retiré, le disque des yeux-antennaire sera divisé en deux pièces lorsqu'on enlève le crochet de la bouche.
   1. Retirez le crochet de la bouche. Prenez soin de ne pas endommager le disque oculaire au cours du processus.
      REMARQUE: Le disque de l'oeil est maintenant libre dans le milieu et seulement relié au cerveau par la tige optique.

3. Montage

1. Sécher à l'air et à assembler les composants de la chambre avec une 42 mm x 0,17 mm lamelle. Attacher une double couche de joints toriques par rapport au centre de la lamelle couvre-objet pour tenir the agarose.
2. Monter la chambre avec lamelle. Mettez 42 mm x 0,17 mm sur l'accepteur lamelle de scène. Placer le joint torique silicium sur la lamelle. Placez la base. Verrouiller le casier d'étanchéité et placer le couvercle (figure 1).
3. Transférer délicatement le complexe oeil-cerveau disséqué au centre de joint torique en utilisant une micropipette 20 pi avec une pointe 10-200 ul.
4. Éliminer la majeure partie du milieu et ajouter 12 ul de 0,7% d' agarose bas point de fusion (à 37 ° C) à l'échantillon.
   NOTE: La position du disque oculaire peut être modifié avec une pince avant la solidification de l'agarose. L'agarose se solidifie en 5 minutes.
   1. Ajouter 1 mL de milieu de culture à température ambiante au centre du joint torique; chaque joint torique peut charger jusqu'à 4 échantillons. Assurez-vous que l'agarose est collée sur le joint torique afin d'éviter la dérive de l'échantillon.
      REMARQUE: Pas d'aération ou la circulation du milieu est nécessaire.

4. Microscopie confocale

1. Placer la chambre sur la platine d'un microscope confocal inversé pendant 30 minutes pour équilibrer la température. Cela peut empêcher la dérive de l'axe Z lors de l'imagerie.
2. Avant l'imagerie en direct à long terme, vérifier si le tissu est intact par microscopie de contraste d'interférence différentielle.
3. Pour éviter la phototoxicité, utilisez une puissance laser en dessous de 2 mW. Utilisez un objectif 40x pour l'imagerie.
4. Acquérir 62 um images Z-stack à 12 min à un intervalle optique de 1 um. Acquérir 40 cycles de balayages sur un total de 10 h. Assurez-vous que chaque cycle contient 12 min de l'imagerie et 3 min de repos.

Résultats

Dans cet exemple, les photorécepteurs R3 / R4 ont été marquées avec mδ0.5-GA4 pour contrôler la différenciation des photorécepteurs. mδ0.5-GA4 entraîne une forte expression dans R4 et R3 expression plus faible dans ^11, ce qui en fait un excellent marqueur pour R3 et R4, ainsi que pour le processus de rotation ommatidial. Dans Film 1, R3 et R4 ont été marquées avec la GFP. Au début de la 10 h session live-imagerie, il y avait 8 rangées de grappes ommatidial (figure 2A et film 1) et 14 rangées de grappes ommatidial à la fin (figure 2B). Le taux de différenciation ommatidial était de 1,67 h par ligne, ce qui est proche du taux de 1,5 à 2 h / ligne de disques in vivo ^{7, 8, 9, 10, 11,}s = "xref"> ^{12, 13, 14.} Sur la base des positions relatives des R3 et R4, ommatidial rotation est produite dans le disque en culture ex vivo au cours de l' imagerie en temps réel (Figure 2A 'A '', B' et B ''). Un seul groupe R3 / R4 a été marqué avec une sphère blanche dans la première image de film 2. Au début, l'axe R3 / R4 semble être perpendiculaire à l'équateur (figure 2C et film 2). Il apparaît alors de faire tourner de 15 °, 30 ° et 45 ° en 3 (figure 2C), 6 (figure 2C '') et 9 (figure 2C '' ') h, respectivement. Ces données suggèrent que cette méthode peut soutenir la différenciation des photorécepteurs au cours de l'imagerie en direct 10 h.

FiguRe 1: Diagramme schématique de l'assemblage de la chambre. Diagramme schématique de l'assemblage de la chambre: ( 1 ) Mettez la lamelle coulissante à double couche sur l'accepteur de scène. ( 2 ) Placez le joint torique en silicone sur le patin de recouvrement. ( 3 ) Placez la base. ( 4 ) Verrouiller le casier d'étanchéité. ( 5 ) Chargez l'échantillon au centre du joint torique et placez le couvercle. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2: Imagerie en direct de la différenciation et de la rotation R3 / R4. R3 / R4 marqué avec mδ0.5-Gal4 exprimant une GFP de forme nucléaire pendant 10 h d'imagerie en direct. Tous les chiffres ont été capturés à partir du film 1 . ( A ) Image prise au début. ( > A'-A ») image agrandie de la zone encadrée à gauche (A ») et à droite (A »). (B) l' image prise à la fin de la période de 10 h. (B'-B ») image agrandie de la zone encadrée à gauche (B ») et à droite (B »). (CC « » « ) Une seule paire R3 / R4 (marqué par une flèche A ») est suivie dans le temps afin de faire apparaître la rotation de la paire R3 / R4. Les barres d'échelle = 15 pm, 10 pm et 5 pm dans A, B et C, respectivement. Tous les chiffres sont des projections intensité maximale z. L'échelle de temps est indiqué en h: min. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Dans cette étude, nous fournissons un protocole détaillé pour une expérience d'imagerie en direct à long terme sur les disques imaginaux drosophile. Nous avons passé beaucoup de temps à pratiquer la dissection minutieuse pour éviter d'endommager le disque et pour permettre la fixation du disque à proximité des lamelles. Nous avons essayé de Poly-L-Lysine (PLL) et d'agarose à bas point de fusion pour maintenir le tissu; à la fin, l'agarose à bas point de fusion a montré une meilleure capacité de maintien du tissu. Bien que seul le disque de l'oeil a été utilisé dans le présent document pour démontrer la présence normale de la différenciation des photorécepteurs et rotation ommatidial pendant la période de formation d'image en direct 10 h, cette méthode peut également être appliquée à au moins un autre disque, le disque de l'aile, tel que démontré dans un étude ³ précédente. De plus, la préparation du milieu de culture et la configuration de l'imagerie en direct sont simples et ne nécessitent pas l'aération ou la circulation moyenne.

imagerie en temps réel continu peut fournir une séquence temporelle précise de veille biologiquents. Dans notre précédent rapport de la différenciation gliale et de la migration dans le disque des yeux, nous avons fourni une preuve directe que glie emballage différencier de la glie existante après la migration vers la partie antérieure du disque des yeux ^3. À long terme la culture ex vivo permet le marquage spécifique activé par laser des cellules, telles que la photo-conversion de la protéine fluorescente KAEDE, de suivre leurs comportements ^3. Il peut également accueillir les essais de produits chimiques qui sont ajoutés directement au milieu de culture; Ainsi, il peut être utilisé comme une plate-forme de criblage de médicaments. Depuis un processus dynamique se produit en quelques minutes ou secondes, haute résolution temporelle est nécessaire. Pour améliorer la résolution temporelle, la microscopie nappe de lumière ^{15, 16} ou d'un disque tournant au microscope ¹⁷ peut être une bonne option.

La condition de la culture actuelle n'est pas parfait. Il ne supporte pas la croissance du disque. p Cellroliferation est uniquement supporté pour un maximum de 12 h ^3. Après 12 h de culture ex vivo, le taux de différenciation des photorécepteurs commence à diminuer ^3. Cela peut être dû à l'absence de certains nutriments ou des hormones. Étant donné que la différence majeure dans ce milieu de culture est la forte concentration de l'insuline, l'insuline de mammifère peut être partiellement mimer la fonction des peptides analogues à l'insuline endogène. L'addition de mouche extrait, le sucre dans le sang des insectes trehalose, et diverses concentrations de l'hormone de mue 20-hydroxyecdysone, étaient pas bénéfique ^3. Cependant, la période de culture 12-18 h est suffisante pour étudier de nombreux processus de développement. Méthodes alternatives de culture pour la culture de disques imaginales larves ont été comparés ^3, et notre condition de culture et de l' imagerie fournit la fenêtre de temps la plus longue et la clarté pour l' imagerie en direct. Bien que les disques dans les larves vivantes et pupes peuvent être directement imagés^{18, 19, 20, 21, 22,} la résolution et la fenêtre de temps pour les observations sont limitées. Des larves et des pupes disques tardifs peuvent être cultivés pendant longtemps ^{23, 24,} mais les disques subissent morphogenèse importants. Pour tirer parti des disques plats, des larves 2D, notre procédé de culture et d'imagerie est la meilleure solution à ce jour.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low-melting agarose	AMRESCO	0815-25G
Phosphate-buffered Saline (PBS)	AMRESCO	0780-2PK
42 mm x 0.17 mm cover slips	PST	G401-42
Schneider’s Drosophila medium	Thermo	21720-024
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F9665
Penicillin-streptomycin	GIBCO	759
Insulin	Sigma	I9278
Culture chamber	PECON		POC-R2 Cell Cultivation System
40X objective			C-Apochromat 40X/1.2W Korr objective
Fly strain:nls.GFP	Bloominggton	4775