הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; דיסק העין

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת עבור תרבות הדמיה חיה vivo לשעבר לטווח ארוך של דיסק דמותי דרוזופילה. זה מדגים בידול קולטי אור וסיבוב ommatidial בתוך התקופה 10 שעות של הדמית חיה של דיסק העין. הפרוטוקול הוא פשוט ואינו דורש התקנה יקרה.

Abstract

הדמית חיה מספקת את היכולת לעקוב אחר תהליכי הסלולר התפתחותי דינמיים ברציפות בזמן אמת. דיסקים דמותי תסיסנית זחל שמשו ללמוד תהליכים ביולוגיים רבים, כגון התפשטות תאים, בידול, צמיחה, הגירה, אפופטוזיס, תחרות, איתות בין תאים, ועל היווצרות גבול compartmental. עם זאת, שיטות התרבות לשעבר vivo לטווח ארוך הדמית חיה של הדיסקים דמותי לא היו משביעות רצון, למרות מאמצים רבים. לאחרונה, פיתחנו שיטה לטווח ארוך התרבות לשעבר vivo ו הדמיה חיה של דיסקים דמותי עד 18 h. בנוסף לשימוש בריכוז אינסולין גבוה בטווח הבינוני התרבות, agarose התכה נמוכה שמש גם כדי להטביע את הדיסק כדי למנוע ממנו נסחף בתקופת ההדמיה. הדוח משתמש דיסקים-מחושי העין כדוגמא. קולטי האור R3 / 4 ספציפי ביטוי mδ0.5-Ga4 בעקבות מנת להוכיח כי קולטי אור בידולtiation וסיבוב ommatidial ניתן לראות בתקופת הדמיה 10 h חי. זהו פרוטוקול מפורט המתאר שיטה פשוטה זו.

Introduction

הדיסקים דמותי הזחל תסיסנית כבר מערכת ניסיונית המועדף לחקר מגוון רחב של מנגנונים ביולוגיים. דיסקים אלו invaginate מן האפיתל העוברי ולהיות צק דמוי מבנים שנבנו על ידי שתי שכבות אפיתל, האפיתל Peripodial (PE) ו דיסק פרופר (DP) ^{1, 2.} תאי הדיסק דמותי להתרבות בהדרגה להבדיל בשלבי זחל גלמים ובסופו של דבר לפתח לתוך המבנים בגוף הבוגר. בשל המבנה דו השכבתי השטוח ופשוט של הדיסקים דמותי, הם קלים להתבונן כאשר גזורים מן הזחלים. עם זאת, למרות כמה מאמצים על ידי קבוצות רבות, את השיטות קיימות בתרבות לטווח הארוכה של הדיסקים דמותי לא היו משביעות רצון. פתחנו לאחרונה שיטת תרבות שיכולה לתמוך בהתפתחות התקינה של דיסקים דמותי מרובים עבור עד 18 שעות ולאחר המאפשר הדמית חיה ³ . שיטת התרבות יכולה לתמוך התמיינות תאי הגירה, אבל זה יכול לתמוך שגשוג תאים רק 7-12 h ולא יכול לתמוך בצמיחת דיסק. ההבדל העיקרי במדיום התרבות הוא הריכוז הגבוה של אינסולין ^3. השיטה היא פשוטה, ולא אורור מיוחד או במחזור בינוני נדרש.

אחד הדיסקים דמותי הנחקרים ביותר הוא דיסק מחושים-העין. עין תסיסנית בנויה של כ 800 האומטידיה. כל אומטידיום מורכב משמונה תאי קולטי אור (R1-R8). בשנת דיסק עין הזחל, תאי קולטי האור בהבחנה בעקבות המעבר של התלם המוךפו"גנטי שהולך (MF), אשר חולף על פני דיסק העין מן אחורי אל קדמי ^{4, 5.} קולטני האור בתוך האומטידיום להבדיל ברצף, החל R8, ואחריו R2 / R5, R3 / R4, R1 / R6, ו R7 ^6. האומטידיה הגבה ו veחצאים ntral של דיסק העין לעבור סיבוב 90 מעלות בכיוונים מנוגדים, ותוצאת כירליות היפך ^{7, 8.} תהליך הסיבוב מתרחש בשני שלבים: ראשון, סיבוב 45 ° מתחיל ומסתיים בשעה בשורת האומטידיה השישית מאחורי MF; הסיבוב השני 45 ° הושלם בסביבות שורה 16 ^{9, 10.} מחקר זה השתמש ברוטציה ommatidial, בסימן R3 / 4 ספציפי mδ0.5-Ga4 ^11, כדי להדגים את התמיינות תאים נורמליים ואת הדינמיקה שניתן לצפות באמצעות שיטה זו לתרבות ולחיות הדימוי הדיסק העין.

Protocol

התקנה 1. Pre-ניסיוני

1. אסוף ביצת זבוב מבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק גרעיני (GFP) תחת mδ0.5-Gal4 ותרבות ב 25 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים.
2. מיקרוגל 0.7 גרם של התכה נמוכה agarose ב 10 מ"ל של 1x פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) עד agarose נמס לחלוטין. שמרו על ג'ל 0.7% נמוך ההיתוך בתוך חממה 37 ° C עד השימוש.
3. לעקר את כל הציוד, כולל מלקחיים, מספריים, 42 מ"מ x 0.17 מ"מ coverslips, צלחת במקום זכוכית 9-היטב, וחדר תרבות מגנטי, עם 70% אתנול עבור יותר מ 12 שעות.
4. הכן את המדיום התרבות ^3: בינוני דרוזופילה של שניידר בתוספת 2% עוברית שור סרום (FBS), 0.5% פניצילין, סטרפטומיצין, ו 1.25 מ"ג / מ"ל אינסולין. כדי למנוע זיהום, להכין את המדיום במנדף תרבית תאים. אחסן את מדיום התרבות המוכן ב 4 ° C בשימוש בתוך חודש.
5. נקה את פלטפורמת דיסקציה הנסיין"ים ידיים עם אתנול 70% לפני תחילת לנתיחה.

Dissection דיסק 2.

1. אוויר יבש כל הציוד מ 70% אתנול.
2. בחר זחל-instar השלישי מבקבוקון זבוב. כדי למנוע זיהום מבקבוקון זבוב, לשטוף את הזחל ב 1x PBS 3x כדי להסיר את הפסולת.
3. לנתח הזחל ניקה ב 1 מ"ל של מדיום תרבות (ב RT) בצלחת במקום זכוכית 9 היטב תחת מיקרוסקופ לנתיחה.
4. תפוס את הזחל עם זוג המלקחיים בסביבות שליש הדרך מהקצה האחורי מלקחיים נוספים הקרס בפה. משוך את שני מלקחיים בכיוונים מנוגדים כדי לשחרר את הרקמות הפנימיות.
   1. הסר את בלוטות רוק, שומן גוף, וגם לציפורן ממתחם עין-המוח מחובר הקרס בפה. אם העצב בחוט הגחון מחובר עדיין, לחתוך אותו עם מספריים.
5. השתמש זוג אחד מלקחיים כדי לתפוס את קרס פי זוג אחד מלקחיים כדי להסיר פיסת הרקמה כי שיתוףnnects מוחות דיסקי עין בחלק הגבה.
   הערה: אם הרקמה הזו לא יוסרה, שני הדיסקים-מחושים לעין יהיו קרובים לזה במוח. דיסקי העין יהיו אז לא לשכב על coverslip כי הרקמה הזו, המוח, ואת דיסק העין-מחושים יהוו משולשת.
6. סובב את המתחם כולו למיקום הגחון כלפי מעלה. סור הנימה שמחברת את הקרס או דיסק למוח.
   הערה: אם הנימה לא יוסרה, דיסק מחושים-העין יתפלג לשתיים חתיכה כאשר הקרס בפה מוסר.
   1. הסר את הקרס בפה. יש להיזהר שלא לפגוע דיסק העין במהלך התהליך.
      הערה: דיסק העין הוא עכשיו חינם בטווח הבינוני היחיד המחובר למוח על ידי הגבעול האופטי.

שמה 3.

1. האוויר יבש ולהרכיב את הרכיבים של התא עם coverslip 42 מ"מ x 0.17 מ"מ. צרף שכבה כפולה של טבעות אטימות למרכז להחליק את המכסה כדי להחזיק thagarose דואר.
2. להרכיב את התא עם coverslip. שים את coverslip 42 מ"מ x 0.17 מ"מ על acceptor הבמה. מניחים את O-Ring סיליקון על להחליק את המכסה. מניחים את הבסיס. נעל את ארונית האיטום ולמקם את המכסה (איור 1).
3. להעביר בזהירות את מורכבות העין למוח גזור למרכז-טבעת O באמצעות micropipette 20 μL עם טיפ 10-200 μL.
4. הסר ביותר של המדיום ולהוסיף 12 μL של agarose 0.7% נמוך ההיתוך (ב 37 ° C) המדגם.
   הערה: המיקום של דיסק העין ניתן לשנות עם מלקחיים לפני ההתמצקות של agarose. את agarose יהיה לגבש בתוך 5 דקות.
   1. להוסיף 1 מ"ל של מדיום תרבות בטמפרטורת החדר אל מרכז-טבעת O; O-Ring כל יכול לטעון עד 4 דגימות. ודא כי agarose מודבק-טבעת O כדי למנוע את סחיפת המדגם.
      הערה: אין אוורור או מחזור של המדיום הוא הכרחי.

4. מיקרוסקופיה confocal

1. מניחים את החדר על הבמה של מיקרוסקופ confocal הפוך במשך 30 דקות כדי לאזן את הטמפרטורה. זה יכול למנוע Z- ציר נסחף במהלך ההדמיה.
2. לפני הדמיה חיה לטווח ארוך, לבדוק אם הרקמה היא שלמה על ידי הפרעה הפרעות מיקרוסקופיה בניגוד.
3. כדי למנוע את phototoxicity, להשתמש בכוח לייזר מתחת 2 mW. השתמש המטרה 40X עבור הדמיה.
4. לרכוש 62 מיקרומטר Z- מחסנית תמונות ב 12 דקות במרווח אופטי של 1 מיקרומטר. לרכוש 40 מחזורים של סריקות על סך של 10 שעות. ודא כי כל מחזור מכיל 12 דקות של הדמיה ו 3 דקות של מנוחה.

תוצאות

בדוגמה זו, photoreceptors R3 / R4 היו שכותרתו עם mδ0.5-Ga4 לפקח על הפרדת photoreceptor. Mδ0.5-Ga4 כוננים ביטוי חזק R4 ו ביטוי חלש R3 ¹¹ , מה שהופך אותו סמן מצוין עבור R3 ו R4, כמו גם לתהליך של סיבוב ommatidial. ב סרט 1 , R3 ו R4 היו מסומנים עם GFP. בתחילת הפגישה 10 שעות לחיות הדמיה, היו 8 שורות של אשכולות ommatidial ( איור 2 א וסרט 1 ) ו 14 שורות של אשכולות ommatidial בסוף ( איור 2 ב ). שיעור ההבחנה האומטידיאלית היה 1.67 h לשורה, אשר קרוב לשיעור של 1.5-2 h / שורה ב vivo דיסקים ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11 ,}s = "Xref"> ^{12, 13, 14.} בהתבסס על מיקומם היחסי של R3 ו R4, סיבוב ommatidial התרחשה דיסק vivo לשעבר תרבותי במהלך הדמיה חיה (איור 2 א "א '', ב", ו-ב ''). אשכול R3 / R4 יחיד סומן עם כדור לבן בפריים הראשון של הסרט 2. בהתחלה, ציר R3 / R4 שנראה בניצב לקו המשווה (איור 2C ו Movie 2). הוא מופיע אז כדי לסובב 15 מעלות, 30 מעלות, ו 45 מעלות ב 3 (איור 2C '), 6 (איור 2C ''), ו 9 (איור 2C ''') ח, בהתאמה. נתונים אלה מראים כי בשיטה זו ניתן לקיים בידול קולטי אור במהלך הדמית 10 h החי.

figuמחדש 1: סכמטי תרשים של עצרת קאמרית. תרשים סכמטי של הרכבה קאמרית: (1) שים את coverslip שכבה כפולה O-המצורפת-טבעת על acceptor הבמה. (2) מניחים את סיליקון O-Ring על להחליק את המכסה. (3) מניח את הבסיס. (4) נעל את ארונית האיטום. (5) טען את המדגם במרכז טבעת O ולמקם את הכיסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: הדמיה חיה של בידול R3 / R4 ו סיבוב. R3 / R4 שכותרתו עם mδ0.5-Gal4 להביע GFP-טופס גרעיני במהלך 10 שעות של הדמיה חיה. כל הדמויות נתפסו מסרט 1. (א) התמונה נלקחה בהתחלה. ( > A'-A") תמונה מוגדלת מאזור בארגזים בצד שמאל (א") וימין (א"). תמונה (B) נלקח בסוף תקופת 10 h. (B'-B") תמונה מוגדלת מאזור בארגזים בצד שמאל (ב") וימין (B"). (CC "" ") זוג R3 / R4 יחיד (מסומן על ידי חץ א") ואחריו דרך הזמן להראות את הסיבוב של צמד R4 / R3. ברי סולם = 15 מיקרומטר, 10 מיקרומטר, ו 5 מיקרומטר A, B, ו- C, בהתאמה. כל הדמויות הן מקסימום עוצמת z-תחזיות. היקף הזמן מוצג שעות: דקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

סרט 1:Rce.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_1.avi "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.

סרט 1: אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.

Discussion

במחקר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור ניסוי הדמית חיה ארוך טווח על דיסקים דמותי דרוזופילה. בילינו הרבה זמן לתרגל את דיסקציה זהירה כדי למנוע נזק דיסק וכדי לאפשר את הקובץ המצורף של הדיסק קרוב coverslips. ניסינו פולי- L- ליזין (PLL) ו-התכה נמוכה agarose להחזיק את הרקמה; בסופו של דבר, את agarose-התכה נמוכה הראו יכולת טובה יותר להחזיק את הרקמה. אמנם רק את דיסק עין משמש במאמר זה כדי להדגים את ההתרחשות הנורמלית של בידול קולטי אור וסיבוב ommatidial במהלך 10 תקופת הדמית h חייה, שיטה זו יכולה לחול גם על אחד לפחות דיסק אחר, דיסק האגף, כפי שהנה באה לידי הביטוי מחקר ³ קודם. יתר על כן, הכנת בינוני תרבות התקנת הדמית חיה פשוטה ואינה דורשת אוורור או במחזור בינוני.

הדמית חיה רציפה יכולה לספק רצף זמני ברור של ערב ביולוגיNTS. בדו"ח הקודם שלנו של בידול גליה והגירה בתוך דיסק העין, ספקנו הוכחה ישירה כי גליה גלישה להבדיל מן גליה קיימת לאחר הגירה אל הקדמי של דיסק העין ^3. תרבות vivo לשעבר לטווח ארוך מאפשרת תיוג הליזר מופעל הספציפי של תאים, כגון מרת התמונה של חלבון פלואורסצנטי לקאךה, כדי לעקוב אחרי התנהגותם ^3. זה גם יכול להכיל את הבדיקה של כימיקלים שנוספים ישירות מדיום התרבות; ובכך, ניתן להשתמש בה כפלטפורמת הקרנת סמים. מאחר שחלק תהליך דינמי להתרחש בתוך דקות או שניות, ברזולוציה גבוהה זמנית נדרשה. כדי לשפר את הרזולוציה הזמנית, מיקרוסקופיה גיליון אור ^{15, 16} או ספינינג דיסק מיקרוסקופיה ¹⁷ עשוי להיות אפשרות טובה.

תנאי התרבות הנוכחי אינו מושלם. היא אינה תומכת צמיחה דיסק. תא proliferation נתמך רק עד 12 h ^3. אחרי 12 h בתרבות vivo לשעבר, שיעור בידול קולטי האור מתחיל לרדת ^3. זה יכול להיות בגלל חוסר הזנה או הורמונים מסוימים. מאז ההבדל העיקרי במדיום התרבות זו הוא הריכוז הגבוה של אינסולין, האינסולין היונק עלול להיות חלקי מחק את הפונקציה של פפטידים דמוי אינסולין אנדוגני. התוספת של תמצית זבוב, trehalose הסוכר בדם החרקים, וריכוז שונה של הורמון ההנשרה 20-hydroxyecdysone, לא הייתה מועילה ^3. עם זאת, תקופת תרבות 12-18 h מספיקה כדי ללמוד תהליכים התפתחותיים רבים. שיטות culturing אלטרנטיביות עבור culturing דיסקים דמותי זחל כבר לעומת ^3, ומצבו culturing ודימות שלנו מספק את חלון הזמן הארוך ביותר והבהיר ביותר עבור הדמיה חיה. למרות דיסקים בתוך זחלים וגלמים חיה ניתן הדמיה ישירות^{18, 19, 20, 21, 22,} חלון הרזולוציה וזמן לתצפיות מוגבלים. זחל מאוחר דיסקים גלמי יכולים להיות מתורבתים במשך זמן רב ^{23, 24,} אך הדיסקים עוברים morphogenesis המשמעותי. כדי לנצל את הדיסקים השטוחים, 2D זחל, שיטת culturing ודימות שלנו היא הפתרון הטוב ביותר עד כה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low-melting agarose	AMRESCO	0815-25G
Phosphate-buffered Saline (PBS)	AMRESCO	0780-2PK
42 mm x 0.17 mm cover slips	PST	G401-42
Schneider’s Drosophila medium	Thermo	21720-024
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F9665
Penicillin-streptomycin	GIBCO	759
Insulin	Sigma	I9278
Culture chamber	PECON		POC-R2 Cell Cultivation System
40X objective			C-Apochromat 40X/1.2W Korr objective
Fly strain:nls.GFP	Bloominggton	4775